基因工程第2章 酶学基础(2DNA连接酶)

直接用T4DNA连接酶连接平末端
5‘…G--C--T--C--T--G-OH 3‘…C--G--A--G--A--C-P
P-C--A--G--G--A--G … 3’ OH-G--T--C--C--T--C … 5’ T4DNA连接酶
5‘…G--C--T--C--T--G--C--A--G--G--A--G … 3’
5'
CTGCA G G ACGTC T4-DNA pol 切平 G C
5'
5'
C G
5'
T4DNA ligase
5' C GATCC GCTAGG C GATCC GCTAG G GGATCG CCTAGC G GATCG CCTAG C 5'
5'
5'
2.5.4平末端的直接连接
• 从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造 的黏性末端的连接属于分子内部的连接，而平头末 端的连接则属于分子间的连接，因此后者反应速度 要慢得多
5' 5' PstI酶切位点
5' 5'
GCATGCCCCCC TGCAG CGTACGGGGGGACGTC GCATGCCCCCC TGCAG CGTACGGGGGGACGTC
5' 5'
5’突出末端
黏性末端修饰成平末端后再连接
5' G CTTAA Klenow AATTC G 补平 AATTC TTAAG dGTP 5' 5' GATCC CCCCCCCTAGG GGATCCCCCCC CCTAG BamHI酶 5' 切位点 GGATCCCCCCC AATTC CCTAG GGGGGGTTAAG 5' GGATCCCCCCC AATTC CCTAG GGGGGGTTAAG 5' EcoRI 5' GATCC G 5' Klenow G BamHI CCTAG 5'
3‘…C--G--A--G--A--C--G--T--C--C--T--C … 5’
2.3 分类（P21）
大肠杆菌DNA连接酶 T4DNA连接酶
来源
大肠杆菌
T4噬菌体 ATP
能源辅助因子 NAD+ 功能
主要催化DNA黏性末 黏性末端、平 端的连接 末端均可连接
2.4 DNA连接酶的反应体系
• 1U DNA连接酶的酶活 性：在最佳反应条件下 15 ℃反应1 小时，完全 连接1μgλ-DNA （HindIII片段）所需的 酶量
• 黏性末端修饰成平末端后再连接
3’突出末端
DNA片段末端同聚物加尾后连接
5' GCATG3’ C C 3’GTACG TdT 5' dCTP
SphI
5'
5' G 3' ACGTC TdT
CTGCA 3' PstI G 5' dGTP CTGCAGGGGGG 3' G 5'
GCATGCCCCCC3’ C 5' G C 3’CCCCCCGTACG 5' 3' GGGGGGACGTC 退火 5' G GCATGCCCCCC C GGGGGGACGTC 5' G GCATGCCCCCC C GGGGGGACGTC Klenow
T4DNA连接酶
G AATTC CTTAA G G AATTC CTTAA G
5'
5'
5'
2.5.2同尾酶产生的黏性末端的连接
5'
TGATCA ACTAGT BclI 5' 5' GGATCC CCTAGG BamHI GATCC G G CCTAG GGATCC CCTAGG 5'
5'
T GATCA ACTAG T
• • • •
提高平头末端连接效率的方法包括： 加大连接酶用量（10倍于黏性末端的连接） 加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会 加入10% PEG8000，促进大分子之间的有效作用 加入单价阳离子（NaCl），最终浓度150-200 mM
2.5.4平末端的连接
（1）直接用T4DNA连接酶连接； （2）先用末端核苷酸转移酶，给平末端DNA 分子加上同聚物尾巴之后再用DNA连接酶 进行连接； （3）用连杆连接平末端DNA分子； （4）DNA接头连接法。
5'
退火
T4DNA连接酶
5'
T GATCC ACTAG G GGATCC CTTAA G
G GATCA CCTAG T G GATCA CCTAG T
5'
5'
5'
2.5.3不同黏性末端的连接
5'
CTGCAG GACGTC PstI 5' 5' GGATCC CCTAGG BamHI GATCC G Klenow GATCC CTAGG G CCTAG 补平 GGATC CCTAG GGATCC CCTAGG 5'
• DNA片段末端加上化学合成的连杆，能形成黏 性末端，连接后可用内切酶进行切割。
• 连杆的5’-末端和待克隆的DNA片段5’末端，用多核苷酸激酶处理使之磷酸 化，然后再通过T4DNA连接酶的作用 使两者连接起来。接着用适当的限制 酶消化具有连杆的DNA分子和克隆载 体分子，这样的结果使二者都产生出 了彼此互补的黏性末端。于是便可以 按照常规的黏性末端连接法，将待克 隆的DNA片段同载体分子连接起来。
补平
GGATC CCTAG 5' dCTP
Leabharlann Baidu
5'
GAATT CTTAA TdT
5'
5' GATCC CTAGG
TdT
5'
GAATTGGGGGG AATTC CTTAA GGGGGGTTAAG
T4DNA ligase
5' 5'
GAATTGGGGGG GATCC CTTAA CCCCCCCTAGG
GAATTGGGGGG GATCC CTTAA CCCCCCCTAGG
小结：平末端DNA片段的连接
（1）直接用T4DNA连接酶连接； （2）先用末端核苷酸转移酶，给平末端DNA 分子加上同聚物尾巴之后再用DNA连接酶 进行连接； （3）用连杆连接平末端DNA分子； （4）DNA接头连接法。
PCR产物的连接（P135）
• 修复与RNA链结合的DNA链上切口处的磷 酸二酯键
5‘…G--C--U--C--U--G--C--A--G--G--A--G … 3’
3‘…C--G--A--G A--C--G--T--C--C--T--C … 5’ nick P OH DNA连接酶
5‘…G--C--U--C--U--G--C--A--G--G--A--G … 3’ 3‘…C--G--A--G-- A--C--G--T--C--C--T--C … 5’
在大肠杆菌及其它细菌中，DNA连接酶催化的连接反 应，是利用NAD＋[烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(氧化型)]作 能源的； 而在动物细胞及噬菌体中，则是利用ATP[腺苷三磷酸] 作能源。 DNA连接酶并不能够连接两条单链的DNA分子或环 化的单链DNA分子，被连接的ＤＮＡ链必须是双螺 旋的一部分。实际上，DNA连接酶是封闭双螺旋 DNA骨架上的切口(nick)，即在双链DNA的某一 条链上两个相邻核苷酸之间失去一个磷酸二酯键所 出现的单链断裂。
• 连接多个平头双链DNA分子
5‘…G--C--T--C--T--G-OH 3‘…C--G--A--G--A--C-P P-C--A--G--G--A--G … 3’ OH-G--T--C--C--T--C … 5’ DNA连接酶 5‘…G--C--T--C--T--G--C--A--G--G--A--G … 3’
5' 5'
C CTGCAGGGGGG CCCCCCGTACG G 5' C CTGCAGGGGGG CCCCCCGTACG G 5' T4DNA ligase CTGCAGGGGGG CATGC GACGT CCCCCCGTACG CTGCAGGGGGG CATGC GACGT CCCCCCGTACG
第二章 基因工程的 酶学基础
第二节 DNA连接酶
2.1 DNA连接酶的发现(P21)
• 1967年，世界上有数个实验室几乎同时发 现了一种能够催化在2条DNA链之间形成磷 酸二酯键的酶，即DNA连接酶(ligase)。
• 这种酶需要在一条DNA链的3’-末端具有一 个游离的羟基(-OH)，和在另一条DNA链的 5’-末端具有一个磷酸基团(-P)，只有在这种 情况下，才能发挥其连接DNA分子的功能 作用。
2.2 DNA连接酶的基本性质
• 修复双链DNA上切口处的磷酸二酯键
OH P
nick
5‘…G--C--T--C--T--G--C--A G--G--A--G … 3’
3‘…C--G--A—G A--C--G--T--C--C--T--C … 5’
nick
P OH
DNA连接酶
5‘…G--C--T--C--T--G--C--A--G--G--A--G … 3’ 3‘…C--G--A--G--A--C--G--T--C--C--T--C … 5’
具黏性末端的DNA片段的连接比较容易，也较常用。
2.5.1同种内切酶产生的黏性末端的连接
5'
GAATTC CTTAAG 5' 5' EcoRI GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG 5'
5'
G CTTAA
AATTC G
5'
AATTC G
G CTTAA
退火
5' G AATTC CTTAA G G AATTC CTTAA G
• DNA连杆连接法尽管有诸多方面的优越性， 但也有一个明显的缺点，那就是如果待克隆 的DNA片段或基因的内部，也含有与所加的 连杆相同的限制位点，这样在酶切消化连杆 产生黏性末端的同时，也就会把克隆基因切 成不同的片段，从而为后继的亚克隆及其它 操作造成麻烦。 • 当然，在遇到这种情况时，一个方法可改用 其它类型的连杆，另一种公认的较好的替代 办法是改用DNA接头(adapter)连接法。
3‘…C--G--A--G--A--C--G--T--C--C--T--C … 5’
2.5.5末端修饰后的连接
• DNA片段末端同聚物加尾后连接（用末端 脱氧核苷酸转移酶（TdT）给具平末端的 DNA片段加上poly(dA)、 poly(dT)、 poly(dC)、 poly(dG)尾巴之后，再用DNA 连接酶将它们连接起来） P133
2008年2月10日，吴瑞教授在康奈尔大学去世。
吴瑞（1928-2008）
2008年3月14日出版的《science》以“桥”为题，撰文纪念吴瑞教授。
吴瑞创建了中美生物化学联合招生项目（CUSBEA），1982年至1989年间，该项 目共招收了400余位顶尖的中国学生来美学习研究生课程。 http://www.hudong.com/wiki/%E5%90%B4%E7%91%9E 科学网专题：深切缅怀吴瑞教授 http://www.sciencenet.cn/news/sub.aspx?id=114
2.5.7 DNA接头(adapter)连接法 (P134)
• 于1978年由康乃尔大学吴瑞 教授发明的。它是一类由人 工合成的一头具有某种限制 性内切酶粘末端，另一头为 平末端的特殊的双链寡核苷 酸片段。当它的平末端与平 末端的外源DNA片段连接之 后，便会使后者成为具黏性 末端的新的DNA分子，而易 于连接重组。
2.5 体外连接DNA片段的方式（P130-135）
黏 性 末 端
• 同种内切酶产生的黏性末端的连接 • 同尾酶产生的黏性末端的连接 • 不同黏性末端的连接
• 平末端的直接连接 • 末端修饰后的连接 • 加上连杆（ linker ），使之形成黏性末 端后，再用DNA连接酶连接 • DNA接头(adapter)连接法
10×连接缓冲液 1.0μL 目的序列回收产物 5.0μL T4 DNA连接酶 （3U/µL） 0.5μL
双酶切后的植物表 3.5μL 达载体 总体积 10.0μL
某植物表达载体的连接体系
• 连接酶连接切口DNA的最佳反应温度是 37℃。但是在这个温度下，黏性末端之间 的氢键结合是不稳定的。因此，连接黏性 末端的最佳温度，应是界于酶作用速率和 末端结合速率之间，一般认为4~15℃比较 合适。 • 平末端的连接采用T4DNA聚合酶，可在较 高的温度进行，如22 ℃。
2.5.6 加上连杆后再连接(P133)
• 如果重组体DNA是用平末端连接或是用同聚物 加尾构建的，那么很可能无法用原来的限制酶 作特异的切割，因此也不能获得插入DNA片段。 为了解决这个问题，可采用连杆法提供必要的 序列，进行DNA分子的连接。
• 所谓连杆(1inker)，是指用化学方法合成的一 段由10～12个核苷酸组成的、具有一个或数个 限制酶识别位点的寡核苷酸片段。