第一章生物大分子的制备.

例如：
NADH2和NADPH2发荧光，因此可通过NAD/NADH2 和NADP/NADPH2的氧化和还原反应借助荧光测定来检测 有关成分的活性。通常谷草转氨酶（GOT）活性测定,是采 用与苹果酸脱氢酶(MDH)相偶联反应进行。
GOT
天冬氨酸 + a-酮戊二酸
草酰乙酸 + 谷氨酸
草酰乙酸 + NADH2 MDH 苹果酸 + NAD+
其生物活性。
大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数 与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中 。稀盐溶液和缓冲液对蛋白质的稳定性好，溶解度大，是提 取蛋白质和酶最常用的溶剂。
二、抽提有效成分的影响因子
在抽提阶段，pH值、金属离子、溶剂的浓度和极性等 因子，可明显影响有效成分的性质和数量。因此选择抽提液 必须考虑这些因素。
5、分析测定的方法分类：
———— 即生物学和物理、化学的测定方法
物理、化学方法主要有：比色法、气相色谱和液相色谱法、 光谱法（紫外／可见、红外和荧光等分光光度法）、电泳法、 以及核磁共振等。
生物学的测定法主要有：酶的各种测活方法、蛋白质含量的 各种测定法、免疫化学方法、放射性同位素示踪法等；
冰箱的除霜循环，可能对细胞造成伤害，要特別小 心。解冻时要越快越好，但避免局部过热。
2.植物材料：
① 选材：注意植物品种和生长发育状况不同，其中所含生 物大分子的量变化很大，另外与季节性关系密切。种子 须泡胀或粉碎才可使用。含油脂较多的也要进行脱脂处 理。 a.提取核DNA：选用黄化苗（生长7－10天小麦，水 稻），防止叶绿体DNA的干扰 b.提取RNA：根据实验目的选用生长幼嫩组织为好。
1.动物组织：
① 选材：必须选择有效成分含量丰富且易分离的脏器组织为 原材料。如磷酸单酯酶，从含量看，虽然在胰脏、肝脏和 脾脏中较丰富，但是因其与磷酸二酯酶共存，进行提纯时， 这两种酶很难分开。所以实践中常选用含磷酸单酯酶少， 但几乎不含磷酸二酯酶的前列腺作材料。
② 脱脂：脏器中含量较高的脂肪，容易氧化酸败，导致原料 变质影响纯度操作和制品得率。常用的脱脂方法有：人工 剥去脏器外的脂肪组wk.baidu.com；浸泡在脂溶性的有机溶剂（丙酮， 乙醚）中脱脂；采用快速加热（50℃左右），快速冷却的 方法，使溶化的油滴冷却后凝聚成油块而被除去。
4、要了解的生物大分子的物理、化学性质
①在水和各种有机溶剂中的溶解性。 ②在不同温度、pH值和各种缓冲液中生物大分子的稳定性。 ③固态时对温度、含水量和冻干时的稳定性。 ④各种物理性质：如分子的大小、穿膜的能力、带电的情况、
在电场中的行为、离心沉降的表现、在各种凝胶、树脂等填 料中的分配系数。 ⑤其他化学性质：如对各种蛋白酶、水解酶的稳定性和对各种 化学试剂的稳定性。 ⑥对其他生物分子的特殊亲和力。
而在破坏酵母菌的细胞时，可采用蜗牛酶进行。一般对数 期的酵母细胞对该酶较敏感。将酵母细胞悬于0.1mol/L柠檬酸 /磷酸氢二钠缓冲液(pH5.4)中，加入1%蜗牛酶， 在30℃处理 30分钟，即可使大部分细胞壁破裂，如同时加入0.2%巯基乙醇 效果更好。
第四节 抽 提
一、抽提的含义
“抽提”是用适当的溶剂和方法，从经过预处理或破 碎的原材料细胞中把有效成分分离出来，并尽可能 保持原来的天然状态不丢失生物活性的过程。
在动、植物和微生物材料中，有效成分的含量一般较少。如 胰脏中胰岛素的含量小于其鲜重的百万分之一；稳定性较差， 大多数对酸、碱、高温和高浓度有机溶剂等因子较敏感；易 被微生物分解变质。
总的来说，材料选择应遵循的原则是，有效成分含量多、稳 定性好；来源丰富、保持新鲜；提取工艺简单、有综合利用 价值等。
结构与功能的研究 核酸：基因序列与功能、核酶 蛋白质：结构、功能、变性与折叠 多糖：信息传递与免疫识别
制备是基础、分析鉴定为关键 复杂性与对技术的依赖性
1、生物大分子制备的主要特点：
⑴生物材料的组成极其复杂，含有数百种乃至几千种化合物。 ⑵生物大分子含量极微，分离纯化的步骤繁多，流程长。 ⑶许多生物大分子一旦离开了生物体内的环境时就极易失活，
② 保存：冷冻采样后尽快放于－4℃――20℃冰箱内。 DNA,RNA 采样后，N2速冻，至－70℃冰箱。对RNA样，如 不立即使用，冷冻保存尤为重要。
3.微生物：
选材：应注意它的生长期，在微生物的对数生长期，酶和 核酸的含量较高，可以获得高产量，以微生物为材料时有 两种情况：
a.利用微生物菌体分泌到培养基中的代谢产物和胞外 酶等。一般用离心法收集上清液，上清液只能在低温下短 期保存
每生成一分子草酰乙酸就消耗一分子NADH2，这样GOT 活性就可通过测定NADH2在340nm消光值的下降来求得。
第三节 细胞的破碎
细胞结构：细胞壁、细胞膜、细胞质和核区。 所要物质可存在细胞外（胞外酶）和细胞内（胞内酶）
不同的生物体细胞破碎的难易不一，使用的方法也不相同， 如动物脏器的细胞膜较脆弱，容易破碎。植物和微生物由于 具有较坚固的纤维素、半纤维素组成的细胞壁，要采取专门 的细胞破碎方法。
常用方法：
一、机械破碎 三、化学处理
二、物理方法 四、生物酶降解
一、机械法：
1. 研磨：将剪碎的动物组织置于研钵或匀浆器中， 加入少量石英砂研磨或匀浆。
2. 组织捣碎器：这是一种较剧烈的破碎细胞的方法， 通常可先用家用食品加工机将组织打碎，然后再 用10000r/min～20000r/min的内刀式组织捣碎机 (即高速分散器)将组织的细胞打碎。
b.利用菌体含有的生化物质，如：蛋白质，核酸和胞 内酶等。需破碎菌体细胞分离，湿菌体可低温短期保存， 冻干粉可在4℃保存数月。 3.
第二节 确立测定方法
有效成分在原材料中含量较低，纯化是使其纯度 增高的过程，因此，提取和分离的每个步骤均要测定 有效成分的含量.
测定目的：监控整个制备过程。 测定方法要求: 专一、准确、灵敏和简便。 使用较多的测定方法有光谱法（包括紫外光谱法、可见光光 谱法、荧光光谱法等） 、生物活性(如酶活力、激素活性)测 定、电泳分析等，有时可用电化学法和免疫分析法。
四、 生物酶降解法
生物酶(如溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶)有降解细菌细胞壁 的功能。在用此法处理细菌细胞时，先是细胞壁消解，随之而 来的是因渗透压差引起的细胞膜破裂，最后导致细胞完全破碎。
例如：从某些细菌细胞提取质粒DNA时，不少方法都采用了加 溶菌酶(来自蛋清)破坏细胞壁的步骤。当有些细菌对溶菌酶不 敏感时，可加巯基乙醇（ME）或者8mol/L的尿素，以促进细胞 壁的消化。另外，也可加入蛋白酶K来提高破壁效果。
2、注意事项
① 控制适当的pH ② 控制低温 ③ 注意提取过程中的溶液环境 ④ 防止提纯过程中丟失一些辅助因子或亚 基
一.选择材料及预处理
动物，植物，微生物都可作为制备生物大分子的原材料，所 选用的材料主要依据试验目的来确定。
有效成份是指欲纯化的某种单一的生命大分子物质。而有效 成分以外的其它物质则统称杂质。
③ 保存：对预处理好的材料，若不立即进行实验，应冷冻保 存。 a.冰冻：剥去脂肪和筋皮等结缔组织，短期保存： －10℃的冰箱内；长期保存：－70℃低温冰箱内。 b.干燥：对于像脑垂体一类小组织，可置丙酮液中 脱水，干燥后磨粉储存备用；对于含耐高温有效成分（如： 肝素）的肠粘膜，可在沸水蒸煮处理，烘干后能长期保存。
二、物理法：
1. 反 复 冻 融 法 ： 将 待 破 碎 的 细 胞 冷 至 － 15℃ 到 － 20℃，然后放于室温(或40℃)迅速融化，如此反复 冻融多次，由于细胞内形成冰粒使剩余胞液的盐 浓度增高而引起细胞溶胀破碎。
2. 溶胀法：细胞膜为天然的半透膜，在低渗溶液和 低浓度的稀盐溶液中，由于存在渗透压差，溶剂 分子大量进入细胞，将细胞膜胀破释放出细胞内 含物。
第一章 生物大分子物质的制备
第一节 概述 第二节 材料的选择与处理 第三节 确立测定方法 第四节 细胞的破碎 第五节 抽提 第六节 浓缩 第七节 样品保存 第八节 纯化方案的设计与评价
第一节 概述
蛋白质、酶和核酸等生物大分子的结构与功能的研究是 探求生命奥秘的中心课题，而生物大分子结构与功能的研究， 必须首先解决生物大分子的制备问题，分离不到足够纯度的 生物大分子，结构与功能的研究就无从谈起。
层析法
电泳法 超离心法
→结晶
透析和超滤
│←前处理→│ ←粗分级→ │ ← 细分级 →│
•材料选择与处理 •细胞破碎（机械破 碎、溶账和自溶、 酶解、化学处理）
•盐析（硫酸铵盐析） •等电点沉淀 •有机溶剂沉淀 •离心
依据原理
•分子大小 •溶解度 •电荷性质 •吸附性质 •生物亲和力
基本原则：防止生物分子变性、降解
3. 超声波处理法：此法是借助超声波的振动力破碎 细胞壁和细胞器。破碎微生物细菌和酵母菌时， 时间要长一些。
4. 压 榨 法 ： 这 是 一 种 温 和 的、 彻 底破 碎 细胞 的方 法。在1000×105Pa～2000×105Pa 的高压下使细胞 悬液通过一个小孔突然释放至常压，细胞将彻底 破碎。
因此分离过程中如何防止其失活，就是生物大分子提取制备 最困难之处。 ⑷生物大分子的制备几乎都是在溶液中进行的，温度、pH值、 离子强度等各种参数对溶液中各种组成的综合影响，很难准 确估计和判断。
2、生物大分子的制备的通常步骤
① 确定要制备的生物大分子的目的和要求。 ② 建立可靠的分析测定方法，这是制备生物大分子的关键。 ③ 通过文献调研和预备性实验，掌握生物大分子目的产物的物
①利用混合物中几个组分分配系数的差异，把它们分配到两 个或几个相中，如盐析、有机溶剂沉淀、层析和结晶等；
②将混合物置于某一物相（大多数是液相）中，通过物理力场 的作用，使各组分分配于不同的区域，从而达到分离的目的， 如电泳、离心、超滤等。
目前纯化蛋白质等生物大分子的关键技术是电泳、层析和高速 与超速离心。
常用溶剂：缓冲液、稀酸、稀碱、有剂溶剂（乙醇 和丙酮）、蒸馏水
理想抽提液的条件： 对有效成分溶解度大、破坏作 用小；对杂质不溶或溶解度小；来源广、价廉、安 全。
通常： 极性物质易溶于极性溶剂，非极性物质易溶于非极性溶剂； 碱性物质易溶于酸性溶剂，酸性物质易溶于碱性溶剂； 温度升高，溶解度加大； 远离等电点的pH值，溶解度增加。 提取时所选择的条件应有利于目的产物溶解度的增加和保持
实际操作中尽可能多用仪器分析方法，以使分析测定更加快 速、简便。
第二节 材料的选择与处理
制备的一般过程和原则 注意事项
•确立有效成分的测定方法 •材料的选择和预处理 •细胞的破碎和细胞组分分离 •有效成分的抽提 •有效成分的纯化和浓缩
1、生物大分子分离纯化的一般步骤和原则
生物组织→ →提取液→ →粗产品→
5. 冷热交替法：从细菌或病毒中提取蛋白质和核酸 时 可 用 此 法 。 在 90℃ 左 右 维 持 数 分 钟 ， 立 即 放 入冰浴中使之冷却，如此反复多次，绝大部分细 胞可以被破碎。
三、化学处理方法：
用脂溶性的溶剂(如丙酮、氯仿、甲苯)或表面活性剂 (如十二烷基磺酸钠、十二烷基硫酸钠) 处理细胞时，可将 细胞壁、细胞膜的结构部分溶解，进而使细胞释放出各种酶 类或DNA等物质，并导致整个细胞破碎。
理化学性质。 ④ 生物材料的破碎和预处理。 ⑤ 分离纯化方案的选择和探索，这是最困难的过程。
⑥ 生物大分子制备物的均一性（即纯度）的鉴定，要求达到一 维电泳一条带，二维电泳一个点，或HPLC和毛细管电泳都 是一个峰。
⑦ 产物的浓缩，干燥和保存。
3、制备生物大分子的分离纯化方法基本原理
蛋白质的制备工作涉及物理、化学和生物等各方面知识， 主要是利用它们之间特异性的差异，如分子的大小、形状、 酸碱性、溶解性、溶解度、极性、电荷和与其他分子的亲和 性等。各种方法的基本原理可以归纳为两个方面：
1、溶剂的极性和离子强度：
① 有些生物大分子在极性大、离子强度高的溶液中稳定；有些 则在极性小、离子强度低的溶液中稳定。例如提取刀豆球蛋 白A时，用0.15mol/L甚至更高浓度的NaCl溶液，都可使其从 刀豆粉中溶解出来，稳定存在。而抽提脾磷酸二酯酶时，则 需用0.2 mol/L蔗糖水溶液。