大片段克隆载体研究进展
目的基因的克隆实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的本实验旨在通过分子克隆技术，将目的基因从基因库中提取并克隆到合适的载体上，为后续的基因表达、功能研究及基因工程应用奠定基础。
二、实验原理分子克隆技术是基因工程的核心技术之一，其基本原理是将目的基因片段与载体DNA片段通过酶切、连接等步骤形成重组DNA分子，然后将重组DNA分子导入宿主细胞进行扩增和表达。
三、实验材料1. 实验试剂：限制性核酸内切酶、T4 DNA连接酶、DNA聚合酶、dNTPs、质粒载体、目的基因DNA、LB液体培养基、LB固体培养基、IPTG、X-Gal、0.1 M MgCl2、0.1 M CaCl2等。
2. 实验仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、离心机、恒温培养箱、显微镜、超净工作台等。
四、实验步骤1. 目的基因的获取（1）设计引物：根据目的基因的序列，设计特异性引物，引物5'末端带有酶切位点。
（2）PCR扩增：以目的基因DNA为模板，PCR扩增目的基因片段。
（3）PCR产物回收：采用PCR产物回收试剂盒回收目的基因片段。
2. 载体与目的基因的连接（1）载体线性化：用限制性核酸内切酶酶切质粒载体，获得线性化载体。
（2）连接反应：将回收的目的基因片段与线性化载体在T4 DNA连接酶作用下进行连接。
（3）连接产物转化：将连接产物转化到大肠杆菌感受态细胞中。
3. 重组子筛选与鉴定（1）菌落培养：在含有IPTG和X-Gal的LB固体培养基上培养转化菌，挑选白色菌落。
（2）菌落PCR鉴定：以白色菌落为模板，进行PCR扩增，检测目的基因片段是否插入载体。
（3）重组子测序：对PCR鉴定阳性的重组子进行测序，验证目的基因片段是否正确插入载体。
五、实验结果与分析1. PCR扩增结果：通过PCR扩增，成功获得了目的基因片段。
2. 菌落PCR鉴定结果：白色菌落PCR鉴定阳性，表明目的基因片段已插入载体。
3. 重组子测序结果：测序结果显示，目的基因片段正确插入载体。
六、实验结论本实验成功克隆了目的基因，为后续的基因表达、功能研究及基因工程应用奠定了基础。
拟南芥全长cDNA研究进展
拟南芥全长cDNA研究进展【摘要】全长cdnas是基因组序列注释和基因及其产物功能分析的基础。
目前共分离了155，144个riken拟南芥全长（raf）cdna 克隆。
将得到的155，144个rafl cdnas进行了3’端表达序列标签聚类成14，668个非冗余cdna类，其中60%预测到基因。
同时已从14，034个非冗余cdna类中获得了5’ests，并构建成启动子文库。
rafl cdnas序列数据库的建立有助于启动子分析、预测出转录本单元的正确注释和基因产物的注释。
而且，全长cdnas还为表达谱分析、功能分析和植物蛋白结构分析提供了宝贵的资源。
【关键词】拟南芥；cdna拟南芥因其具有个体小，世代周期短和转化率高等特点，因此在植物研究中被广泛的作为一种模式生物。
为了将拟南芥的小基因组测序，日本、欧洲和美国的科学家共同合作完成了拟南芥基因组测序工程。
拟南芥5条染色体中的2条（2号和4号染色体，不包括核仁组织区和着丝点区）在1991年进行了测序，其余3条染色体在2000年进行了测序。
2001年5月，大约127，000个拟南芥表达序列标签（ests）被提交到est数据库（dbest）。
其中的序列来自法国，美国和日本共同合作的大范围est工程。
这些工程已从不同的组织、器官、种子和发育阶段的拟南芥中获得est数据。
然而，这些基于cdna文库的est工程中的大部分的插入片段都不是全长的。
ests有助于为表达基因提供标签，大圣无法进行基因功能的进一步研究。
因此，全基因组范围的获得表达基因的全长cdna，对于在功能基因组学领域中分析基因及其产物的表达标签和功能是十分重要的。
1.拟南芥全长cdna文库的构建目前已应用biotinylated cap trapper法建立了拟南芥的全长cdna文库。
最近，研究人员有将trehalose-ther-moactivated 反转录酶应用到cap trapper法中，构建了不同处理的拟南芥全长cdna文库。
同源重组介导的克隆策略研究进展
３Ｙｕ ｎ Ｌ ｎ ｐｎ ｇ — ｅｈ Ａ ｃ ｌ ｒ ． ａ ｏ ｇ ｉｇＨｉｈ Ｔ ｃ ｕｔ ｅＣＯ，Ｌ Ｄ，Ｃ ａ ｇｈ ，Ｈｕｎ ｎ４ ０ ０ ，Ｃ ｉａ ｕ Ｔ ｈ ｎｓａ ’ａ １ ０ １ ｈｎ ）
Ｒｅ ｅ ｒ ｈ Ｐｒ ｇ ｅ ｓｏ ｃ ｍｂｉａｉｎ Ｂａ ｅ ｎ Ｃｌ ｎｎ ｅｈ ｄ ｓ ａ ｃ ｏ ｒ ｓ ｎ Ｒｅ ｏ ｎ ｔｏ ｓ ｄ ｏ ｏ ｉ ｇ Ｍ ｔｏ ｓ
Ｄ ｉ ｉ ，＂ｉ ｕ ，Ｌ ｉ ｇａｇ ａ Ｑ． ｎ ｒ ｎＹ ｎ ａ ｕＸａ ｙｎ ｎ
摘 要 ：随 着 基 因功 能 的深 入 研 究 ，构 建 表 达载 体 是 研 究 各 基 因的 功 能 及 其 相互 关 系 的 第 一 步 。 近年 来 涌 现 的 多 种 同 源 重 组 介 导 的 高 效 克 隆 策 略 极 大 地 方 便 了 载体 的构 建 。 简 要 综 述 了 同源 重 组介 导 的 克 隆 方 法 的研 究 进 展 ，及 其 在 载 体 构 建 中 的应 用 。 关键词 ：载体构建 ；同源重组 ；连接酶非依赖型克隆；无 限制酶系统 中图 分 类 号 ：Ｑ ８ ７５ 文 献标 志码 ：Ａ ｄ ｉ １． ６／ｓｎ１７ — ６ ６ Ｘ） ０ １ ６０ ２ ｏ： ０３ ９ｊｓ．６ １ ９４ （ ． １ ． ． ９ ｉ ２ ０ ０
ｃｏ ｉ ｇ ｓ ｓｅ ｌｎ ｎ ｙ ｔ ｍ
分 子 生物 学经 过 ２ Ｏ年 的发 展 ，利 用 限制 性 内切 酶 和连 接 酶 的 方法 成 为 载 体 构 建 中一 个 稳 定 而 有 效 的 系统 。在 载 体构 建 的过 程 中 ，可根 据 实 验 要 求 选 择合 适 的克 隆方法 ，最大 程度 利 用 每种 方 法 的优 点 。 经典 克 隆这 种 依 赖 限制 性 酶 切 位 点 的技 术 完 全 依 赖
克隆载体构建实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 学习克隆载体的构建方法，掌握分子克隆的基本原理和操作步骤。
2. 掌握利用限制性内切酶和DNA连接酶进行DNA片段的插入和连接。
3. 熟悉重组质粒的鉴定和扩增方法。
二、实验原理克隆载体是分子生物学研究中常用的工具，它可以将目的基因插入其中，并在宿主细胞中进行扩增。
克隆载体的构建主要包括以下步骤：1. 设计引物：根据目的基因序列设计特异性引物，用于PCR扩增目的基因片段。
2. PCR扩增：利用引物扩增目的基因片段。
3. 载体线性化：利用限制性内切酶将载体线性化，使其具有末端粘性。
4. DNA片段连接：将目的基因片段与载体进行连接。
5. 转化宿主细胞：将连接后的重组质粒转化至宿主细胞。
6. 鉴定和扩增：通过PCR、酶切等方法对转化后的细胞进行鉴定和扩增。
三、实验材料1. 试剂：PCR引物、限制性内切酶、DNA连接酶、DNA分子量标准、Taq酶、pUC19载体、感受态细胞等。
2. 仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、移液器、DNA纯化柱等。
四、实验步骤1. 设计引物：根据目的基因序列设计特异性引物，引物长度一般为20-30个碱基，其中包含酶切位点。
2. PCR扩增：利用引物扩增目的基因片段，PCR反应体系如下：- 10×PCR缓冲液5μl- dNTPs（每种2.5μmol/L）4μl- 引物（上下游引物各1μmol/L）2μl- DNA模板1μl- Taq酶0.5μl- ddH2O补充至50μl3. 载体线性化：利用限制性内切酶将载体线性化，反应体系如下：- 载体DNA 5μl- 10×酶切缓冲液5μl- 限制性内切酶1μl- ddH2O补充至20μl4. DNA片段连接：将PCR产物与载体进行连接，反应体系如下：- 线性化载体DNA 5μl- PCR产物5μl- 10×连接缓冲液5μl- DNA连接酶1μl- ddH2O补充至20μl5. 转化宿主细胞：将连接后的重组质粒转化至感受态细胞，具体操作方法如下：- 将感受态细胞铺板于含有适当抗生素的培养基上，37℃培养过夜。
基因克隆技术研究进展
基因克隆技术研究进展刘心伟;朱文豪;李何【摘要】@@ 几种模式生物基因组测序和人类基因组计划(human genome project,HGP)的相继完成,使人们对基因的研究很快进入后基因组时代.基因组学时代的主要任务是图谱制作和序列测定,后基因组学时代则是进行基因组功能注释(genome annotation),这也是功能基因组学的主要研究目标[1-2].【期刊名称】《河南职工医学院学报》【年(卷),期】2010(022)006【总页数】4页(P753-756)【关键词】基因克隆;图位克隆;转座子标签;表达序列标签;差异表达基因【作者】刘心伟;朱文豪;李何【作者单位】河南省体育科学研究所,河南,郑州,450044;河南省农科院畜牧兽医研究所,河南,郑州,450002;信阳职业技术学院化学工程系,河南,信阳,464000【正文语种】中文【中图分类】Q785几种模式生物基因组测序和人类基因组计划(human genome project,HGP)的相继完成,使人们对基因的研究很快进入后基因组时代。
基因组学时代的主要任务是图谱制作和序列测定,后基因组学时代则是进行基因组功能注释(genome annotation),这也是功能基因组学的主要研究目标[1-2]。
如何利用基因这一重要的资源,日益成为研究焦点。
关于基因专利权的建立和完善的基因争夺大战的硝烟也正在弥漫全球。
克隆化基因不仅可以用来兴旺生命科学工业 (制药业等),改良农作物、畜禽品种等,还可以对遗传性疾病进行基因治疗,探索疾病的分子机制和生物发育调控规律。
克隆基因的途径有两种,正向遗传学和反向遗传学途径。
前者是依据目标基因所表现的功能为基础,通过鉴定其产物或某种表型突变而进行的;后者则着眼于基因本身,通过特定的序列或在基因组中的位置进行。
基因的克隆一般采用下列技术:同源序列技术、差异表达基因分离技术、表达序列标签技术、图位克隆技术和转座子标签技术等。
t载体的应用及研究进展
##以基因的扩增和克隆为中心的分子生物学实验 操作在生命科学发展进程中始终起着重要的作用' 近年来$随着基因组测序工作的完成$产生大量的基 因组信息$将日益丰富的信息通过分析与归类成为 有用 的 知 识$ 首 先 需 要 面 临 大 量 的 基 因 克 隆 工 作(!$ &) ' 聚合酶链式反应 " ABC# 是常用的 M=D体 外扩增技术$1载体作为一种新型的载体$可直接用 于克隆 ABC产物且操作简单$因此应用于大规模的 基因克隆与表达的研究($!') ' 1载体对 ABC产物克 隆的原理是由于 ABC反应过程中 !"#M=D聚合酶 具有非模板依赖性的末端转移酶活性$因此 ABC产 物 $N端被添加单个腺嘌呤残基" 8D# 形成突出的末 端$可与 1载体的 $N末端悬挂的胸腺嘧啶残基" 81# 形成互补配对$快速进行 ABC产物的克隆$该克隆 方法被称为 1D克隆((!G) $该方法通过黏性末端将 载体与片段连接一起$连接效率比平末端连接效率 高' 但目前市面上供应的 1载体多为进口试剂盒$ 其价格昂贵$质量批次不稳定$制约了 1载体的进 一步广泛使用(!%) ' 在此$笔者简要综述了 1载体的 常规的制备方法$以及多个针对常规制备方法的弊 端和实际需求对 1载体进行一些技术创新和改良 的尝试'
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大片段DNA的克隆
大片段DNA的克隆通常超过3Kb以上的片段不太容易构建到载体上，成功率也是非常的低，根据笔者多年的经验成功克隆过5kb左右的基因片段，先将一些心得与大家分享：第一：PCR产物确保正确，扩增长片段往往会出现点突变，缺失插入突变，甚至是并非自己想要的片段，此时就要要求所用的TAQ酶是高质量高保真高前进能力的酶--推荐primerstar，并且保证所设计的引物的特异性，如果有错配的可以尝试不加MCS 的巢式引物，拿第一次PCR产物再用加MCS的引物去扩，可保证起特异性和效率性。
第二：连接要求有效，通常大片段与载体相连接由于空间位阻的原因不太容易得到阳性克隆，所以一定要保证以下几点-目的基因绝对的大量保证在载体的10-15倍摩尔比值；载体最好不要太小，可以直接尝试表达载体；最好使用过夜16度连接（24h以上），快速连接的效果对于大片段来讲并不占优势；连接酶可适当多加。
第三：转化要高效，由于大片段克隆到载体上通常加上载体会比较大，有时甚至超过10-20kb，这时会严重影响转化效率和细菌的生长速度，可以考虑电转或者，300-400ul的感受态细胞，严格按要求转化，使用DH5a时，可能消耗能量的原因，细菌长得很慢，可以考虑用TOP10,或DH5a多培养一段时间第四：不轻易放弃，长出来的菌因为质粒很大，去做菌落PCR不一定能检测出来阳性菌，可以考虑照样接种，次日提质粒酶切鉴定。
也可以多对比几个不同的载体，相信一定能做出来的。
第五：实在是做不出来，将其肢解成多个小片段，每个片段构建到T载上，最后拼接到一起。
第六：克隆大片段真核基因，要保证高质量的RNA，以确保完整的片段，并且需要高质量的逆转录酶，可以将RNA的量加到说明书的上限，保证足够浓度的完整的cDNA片段。
如果大片段的外显子不是很多，还可以考虑用基因组或BAC/YAC来调取目的基因。
动物基因工程—基因克隆载体
B、在非必需区组入选择标记基因
C、构建的λDNA载体不应小于36.4kb
基因工程载体构建
③用λDNA作载体比用质粒作载体的优点：
A、可容纳较大的外源DNA片段（15－23kb，质粒一般<10kb）
B、λDNA进入细菌细胞容易，不象质粒载体那样需要采用化学介导
法才能进入细菌细胞
物细胞（或蓝藻细胞）中进行高效表达。
基因工程载体构建
2、植物病毒克隆载体
构建植物病毒克隆载体的基本策略是：
对病毒DNA（包括RNA反转录的DNA）进行加工，消除其对植物的致
病性，保留其通过转导或转染能进入植物细胞的特性，使携带的目的基因导
入植物细胞。
目前应用最多的植物病毒克隆载体是：利用CaMV（花椰菜花叶病毒）
TGMV）、非洲木薯花叶病毒（ACMV）、玉米线条病毒（MSV）、小麦矮缩病毒
（WDV）
RNA病毒：雀麦草花叶病毒（BMV）、大麦条纹花叶病毒（BSMV）、蕃茄丛矮病
毒（TBSV）、马铃薯X病毒（PVX）、烟草花叶病毒（TMV）、烟草蚀刻病毒（
TEV）、李痘病毒（PPV）等
基因工程载体构建
2、植物病毒克隆载体
根据这些性质构建了一系列分别适用于不同生物的病毒克隆载体，把
感染细菌的病毒专门称为噬菌体，由此构建的载体则称为噬菌体载体 。
基因工程载体构建
基因工程载体构建
基因工程载体构建
（1）λ噬菌体克隆载体
①λDNA构建克隆载体的依据：
A、λ噬菌体由DNA（λDNA）和外壳蛋白组成，对大肠杆菌具有很高的感
动 物 生 物 技 术
基因工程载体构建
基因工程载体构建
基因工程载体构建
T载体的应用及研究进展
T载体的应用及研究进展田生礼1 梁秀怡1 梁志成2【摘要】摘要T载体可直接用于克隆PCR产物，因此应用于大规模的基因克隆中，具有快速、高效、操作简单等优点。
对T载体进行了综述，介绍了T载体在生物学众多领域的广泛应用，总结了当今T载体的技术创新和改良，特别介绍了目前最新的新型多功能T载体——定向克隆表达型T载体，并且探讨了T载体未来的发展趋势。
【期刊名称】科学技术与工程【年(卷),期】2014(014)030【总页数】8【关键词】关键词 T载体 TA克隆定向克隆表达型T载体生物科学以基因的扩增和克隆为中心的分子生物学实验操作在生命科学发展进程中始终起着重要的作用。
近年来，随着基因组测序工作的完成，产生大量的基因组信息，将日益丰富的信息通过分析与归类成为有用的知识，首先需要面临大量的基因克隆工作[1，2]。
聚合酶链式反应(PCR)是常用的DNA体外扩增技术，T 载体作为一种新型的载体，可直接用于克隆PCR产物且操作简单，因此应用于大规模的基因克隆与表达的研究[3—6]。
T载体对PCR产物克隆的原理是由于PCR反应过程中Taq DNA聚合酶具有非模板依赖性的末端转移酶活性，因此PCR产物3′端被添加单个腺嘌呤残基(dA)形成突出的末端，可与T载体的3′末端悬挂的胸腺嘧啶残基(dT)形成互补配对，快速进行PCR产物的克隆，该克隆方法被称为TA克隆[7—9]，该方法通过黏性末端将载体与片段连接一起，连接效率比平末端连接效率高。
但目前市面上供应的T载体多为进口试剂盒，其价格昂贵，质量批次不稳定，制约了T载体的进一步广泛使用[10]。
在此，笔者简要综述了T载体的常规的制备方法，以及多个针对常规制备方法的弊端和实际需求对T载体进行一些技术创新和改良的尝试。
1 T载体的种类和应用1.1 T载体的分类随着生物学研究和基因工程的进步，已发展出多种T载体，根据其功能可分为克隆型T载体和表达型T载体。
克隆型T载体允许外源的DNA插入，储存，并可在宿主中扩增[11，12]，主要是DNA水平上的操作，如Takara公司的pMDTM系列克隆载体。
腺病毒载体构建原理与方法的研究进展
作者单位:100052北京,中国预防医学科学院病毒学研究所病毒形态研究室#综述#腺病毒载体构建原理与方法的研究进展何金生王健伟洪涛由于腺病毒(Adenovirus,Ad)载体在哺乳动物及其多种细胞上进行基因转移和蛋白表达的高效性,使其在基因疫苗及基因治疗的研究中受到人们的青睐,成为当今使用最多的病毒载体之一。
为了取得更满意的效果,人们在腺病毒载体构建与改进方面,做了大量工作。
本文谨就近年来腺病毒载体构建原理与方法的研究进展扼要综述如下。
1腺病毒载体的构建原理腺病毒的基因组为线形双链DNA,长度约为36kb,被包装在一个二十面体的蛋白质外壳内,可分为编码区和非编码区。
编码区又可分为早期转录区和晚期转录区两种,前者有E1、E2、E3、E4四个区,编码病毒的调节蛋白,后者有L1、L2、L3、L4、L5五个区,编码病毒的结构蛋白。
非编码区含有病毒进行复制和包装等功能所必需的顺式作用元件。
除E3区外,其余的编码区及顺式作用元件均为病毒复制所必需。
第1代腺病毒载体是由去除腺病毒基因组的E1和P或E3两个区而获得,其复制必须在由5型腺病毒转化的可组成性表达E1蛋白的293细胞中完成。
其主要优点为:在体外有很高的繁殖滴度(1011~1012PFU P ml);易感的宿主细胞范围广,既能感染增殖细胞,又能感染非增殖细胞;病毒基因组存在于细胞染色体外,避免了因整合引起的细胞突变。
但由于病毒载体与表达E1蛋白的293细胞之间存在同源序列。
在293细胞中繁殖时,通过重组,可重新获得E1区,出现复制型腺病毒(Replication-competent Ads, RCAs),这使得第1代腺病毒载体的应用受到限制112。
此外,由于发现在多种转化及原代的细胞内存在具有Ela样活性(Ela-like activity)的物质,因而E1区缺失的腺病毒载体在这些细胞内,仍能进行Ela非依赖性的腺病毒DNA复制,并从头合成病毒的早期和晚期蛋白,激发宿主针对腺病毒的细胞和体液免疫,使载体在体内的持续时间以及再次应用均受到极大影响122。
大片段DNA插入文库的研究进展
Ｃ ｓ ｄ ｉｒｒ ，ＹＡＣ ｉｒｒ Ｂ ｓｌ ｒｒ ｒ ｈ ｈｅ ｅ ｓｉ ｈｅｄ ｖ ｏ ｍｅ ｔｉ ｏ ｓｒｃｉｎｏ ａ ｇ ｏｍｉｓｌ ａｙ ｂ ｓｌ ａｙ， ＡＣ ｉ ａｙａｅｔ ｅｔｒｅｓ ｐ ｎｔ ｂ ｂ ｔ ｅ ｄ ｐ ｎ ｎ０ ｎ ｔ ｔ ｕ ｏ ｆｌ ｅ—ｓ ｅｉ ｒ ｒ ｉ ｍｅ ｔ ｚ ＤＮＡ ｌ ｒｒ Ｄｉ ｅｅ ｔｉｒｒ ｙ ｔｒｓ ｒ ｒｅ ｙｏ ｍｐ ｒｄ ｉ ａｙ ｂ ｆ ｒｎ ｌ ａｙｓ＇ｅ ａ ｅｂ ｉｆ ￣ ａｅ Ｔｈ ｐ ｌａ ｏ ｓｏ ｌｒｅ—ｓ ｅＤＮＡ ｉ ｅｔｌ ｒｒ ｓｗｅｅｄ — ｆ ｂ ３ ａ ｌ ｅａ ｐｌ ｄ ｎ ｆａｇ ｃ ｉ ｚ ｒ ｒ ｉ ａｉ ｓ ｂ ｅ ｒ ｅ ｓｒ ｅ ｅａ Ｔｈ ｏｓｒｃｉｎｏ ＡＣ ｂａｙ ｃｉ ｄ ｉ ｄ ｔ丑 ｂ ｎ ｅｏｎ ｔｕ ｔ ｆ ｏ 开展 基 因 为 组 的分 化组 成 、 因 的表 达 与调控 、 基 染色 体 区段 的分
段过小 而 步行 的次数太 多 ， ， 最 早 Ａ 是 发展 的真 正意 义上 的人 工染 色体 。在成 功分 离 出复
随着 基因组 学 时 代 的 到来 ， 隆 并利 用生 物 的 克
重要 基 因、 研究 这些 基 因的结 构 、 能和进 化 已成 为 功
的工作 为人 们构建 大 片段文 库奠 定 了基础 。
Ｃ ｓ ｄ文 库 ｏ ｍｉ Ｃ ｓ ｄ文 库 是 为 克 隆和 增殖 基 ｏｍｉ 因组 Ｄ ＮＡ 大片段 而设 计 的。人 们 期 望大 容 量 的 载
摘
要 ： 基 因组 Ｄ Ａ 太片段插入作 为基 因组 学和基 因克 隆的技 术平 台． Ｎ 它的发展 主要库 的应 用作 丁比较 详 Ｙ Ｃ Ｂ Ｇｓ 文 对
维普资讯
生物 技 术 通报
目的基因片段与载体连接
目的基因片段与载体连接全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：目的基因片段与载体连接是分子生物学领域中常见的实验操作，它是为了将感兴趣的基因片段插入载体中，以便在细胞或生物体内进行研究和表达。
这一过程是基因工程、基因克隆和表达的基础步骤之一，对于揭示基因功能、疾病研究以及生物技术应用具有重要意义。
为了实现目的基因片段与载体的连接，研究人员通常采用多种方法和技术。
其中最常用的方法是利用酶切和连接技术。
酶切是指使用特定的限制性内切酶切割DNA，将基因片段和载体进行切割，以便于它们能够形成互补的粘性末端。
连接过程中需要使用DNA连接酶将目的基因片段与载体连接在一起，形成一个完整的重组DNA分子。
连接过程分为以下几个步骤：1. 酶切：首先需要使用适当的限制性内切酶对目的基因片段和载体进行酶切，生成具有粘性末端的DNA片段。
2. 处理：将酶切后的目的基因片段和载体经过处理，以去除杂质和保持DNA稳定性。
3. 连接：在连接反应中，目的基因片段和载体通过DNA连接酶的作用，将它们连接在一起。
这种连接通常是在适当的实验条件下进行，以确保连接的可靠性和效率。
4. 转化：将连接好的重组DNA分子引入宿主细胞中，通常通过转化的方式实现。
转化是指利用细胞膜通透性增加的方法，将DNA分子引入细胞内，使其在细胞内表达。
除了酶切和连接技术外，还有其他方法可以实现目的基因片段与载体连接，如PCR扩增、梯度离心、化学连接等。
这些方法各有特点，研究人员根据实验需要和经验选择最适合的连接方法。
目的基因片段与载体连接的成功与否直接影响到后续的实验结果和研究进展。
在连接过程中，需要严格控制实验条件、操作技术和试剂质量，避免出现非特异性连接或连接失败的情况。
合理设计连接实验方案、选择合适的酶切位点和优化连接条件也是确保连接成功的关键。
目的基因片段与载体连接是基因工程和分子生物学研究中至关重要的步骤，它为科学家提供了有效的手段，揭示基因功能、探索生命奥秘。
基因克隆技术的原理及应用
基因克隆技术的原理及应用1. 基因克隆技术的引言基因克隆技术是生物学领域中一项重要的实验技术，被广泛用于基础研究、生产应用、医学诊断等领域。
本文将介绍基因克隆技术的原理以及其在不同领域的应用。
2. 基因克隆技术的原理基因克隆技术是指将感兴趣的DNA片段从一个有机体中复制到另一个有机体的过程。
它主要包括DNA片段的获取、载体的选择、转化和筛选等步骤。
2.1 DNA片段的获取DNA片段可以通过多种方法进行获取，包括PCR、限制性内切酶切割、合成以及基因库筛选等。
其中，PCR是最常用的方法之一，通过酶连锁反应可以扩增目标DNA片段。
2.2 载体的选择克隆过程中需要选择一个合适的DNA载体来承载目标DNA片段。
常见的载体包括质粒、噬菌体和人工染色体等。
选择载体时需要考虑载体的大小、复制能力、表达能力等因素。
2.3 转化将目标DNA片段与选定的载体进行连接后，需要将复合物转化到宿主细胞中。
转化可以通过化学方法、电穿孔等方式实现。
转化后的细胞将能够持续地复制目标DNA片段。
2.4 筛选为了筛选出含有目标DNA片段的克隆体，可以利用选择性培养基、荧光标记、抗生素抗性等方法进行筛选。
筛选后的克隆体可以进一步进行纯化和验证。
3. 基因克隆技术的应用基因克隆技术在许多领域都得到了广泛的应用，下面将介绍其在基础研究、生产应用和医学诊断中的应用。
3.1 基础研究基因克隆技术在基础研究中起到了至关重要的作用。
通过克隆和研究特定基因，科学家可以深入了解基因的结构、功能以及相互作用关系。
这对于研究生物学基本原理、探索疾病机理等具有重要意义。
3.2 生产应用基因克隆技术在农业、药物生产和工业生产等领域都有广泛的应用。
例如，农业方面可以利用基因克隆技术改良作物品种，提高产量和抗病性；药物生产方面可以利用基因克隆技术大规模生产特定蛋白质，用于制造药物；工业方面可以利用基因克隆技术生产高效酶、清洁能源等。
3.3 医学诊断基因克隆技术在医学诊断中的应用也越来越广泛。
猪瘟病毒基因组蛋白结构及蛋白表达技术的研究进展
种 功 能 蛋 白 ，对 病 毒 的免 疫 、识 别 、吸 附 和 进 入 宿 主 细 胞
十 分 重 要 。 它 可诱 导机 体 产 生 中 和 抗 体 ，用 其 免 疫 猪 可 诱 导
产 生 对 致 死 剂 量 的 保 护 性 免 疫 反 应 ．也 是 病 毒 粒 子 吸 附 进 入
ｐｌ Ａ ｏｙ（）尾 巴结 构 ，在 所 有 瘟 病 毒 中 高 度 保 守 ，其 参 与 病 毒 基 因组 的复 制 、 多 聚蛋 白 的 翻译 和 病 毒 粒 子 的装 配 。猪 瘟 病 毒 的 Ｏ Ｆ翻 译 一 个 ３ ９ Ｒ ８ ８个 氨 基 酸 的 多 聚 蛋 白 。 该 蛋 白在 细 胞 内 蛋 白 酶 和病 毒特 异 性 的 蛋 白酶 作 用 下 裂 解 成 各 种 成 熟 的
和 性 ．Ｎ ２ ３蛋 白为 双 功 能 蛋 白 ，具 有 丝 氨 酸 蛋 白酶 活 性 、 Ｓ—
核苷 ｉ磷酸酶活性及 解旋酶 活性 ，其解旋作用 依赖于 Ｃ Ｆ ＳＶ
特 异 的单 链 Ｒ Ａ，该 蛋 白在 病 毒 的 生 命 周期 中 至关 重 要 。还 Ｎ 有 其 他 一 些 非 结 构 蛋 白 ，比如 Ｎ ４ 和 Ｎ ４ 、Ｎ ５ ＳＡ ＳＢ Ｓ Ａ和 Ｎ ５ ＳＢ 这 些非 结 构蛋 白的研 究还 不 多 ，其 中 Ｎ ５ Ｓ Ｂ也 与病 毒 复制 有关 。 ２ 猪瘟 病 毒 蛋 白表 达 技 术 ２１ 原核 表 达 ． 在 各 种 表 达 系 统 中 ，最 早 被 采 用 进 行 研 究 的 是 原 核 表 达 系 统 ．这 也 是 目前 掌 握 最 为 成熟 的 表 达 系 统 。该 项 技 术 的 主 要 方 法 是 将 已 克 隆 人 目的 基 因 Ｄ Ａ 片 段 的 载 体 （ 般 为 质 Ｎ 一
胡杨大片段转化拟南芥植株表型分析
胡杨大片段转化拟南芥植株表型分析谭诗梦;敖小平;符泽华;覃建庸;徐刚标;卢孟柱【摘要】Populus euphratica is one of valuable material on abiotic stress research of trees. It is a new attempt to research plant gene function that using random genome fragments but not a single gene ofP. euphratica to transformArabidopsis. The study transform wild-typeArabidopsis (columbia) by the floral dip method, then specific traits of transformed plants were screened, recording the new phenotype and analyzing the new function, to explore the specific function of thePopulus genome sequence. The experiments showed that the growth traits of transformed typeArabidopsis were significantly different from the wild-type. The grain size of the transformed seed increased nearly 14%, and the weight increased by nearly 27%, which laid a foundation for further study on the function of the inserted fragment.%胡杨是研究林木对极端逆境响应的首选材料。
植物基因克隆研究进程分析
植物基因克隆研究进程分析作者：李卓雨来源：《种子科技》2022年第03期摘要：随着科学技术的发展及人类基因工作的推进，植物基因克隆技术研究取得了一定的成就。
近年来，我国植物基因克隆技术有了新发展，玉米、小麦及水稻等均克隆了较多与植物产品品质、产量等相关的基因。
就植物基因克隆技术展开研究，以供借鉴。
关键词：植物;基因;克隆技术文章编号：1005-2690（2022）03-0010-03 中国图书分类号：S336 文献标志码：B植物基因克隆技术是现代生命科学的关键组成，也是现代生命科学技术最为关键的要素，基于20世纪70年代初级DNA体外重组技术的诞生，经历了甄别、分离特异性的基因并得到基因完整的序列，明确其在染色体上的确切位置，阐明其生化功能，以及结合生物工程方式应用于生产实践中的过程[1]。
通常基因克隆策略包含两类，即正向遗传学方式和反向遗传学方式。
前者主要以待克隆基因所表现出的功能为前提，基于对包括基因表达产物及其表现现状实现克隆，包含了功能方面以及表观方面等多个部分;后者更多综合基因自有的序列或基因组之中的特殊点位进行克隆，如定位克隆和同源序列法克隆等。
随着DNA测序和生物信息学等理念不断完善，电子克隆等新兴技术诞生[2]。
目前，包括烟草在内的多类植株已在品质、抗性以及性状等多个维度实现了克隆。
对植株基因克隆涉及的相关技术进行分析，可以更好地了解植物基因克隆技术的发展过程，并对其未来发展趋势进行展望。
1 功能克隆技术功能克隆是以蛋白质的功能为基础进行的基因克隆，主要内容是综合确切的生化问题或已知与这一功能存在关联性的蛋白质，对纯化蛋白进行分离，测定出相关氨基酸序列，结合遗传密码研究明确潜在的编码序列，开发出相关的核苷酸探针、杂交筛选基因组文库等，基于抗原反应锁定特异克隆，完成测序处理，继而获得对应的序列。
结合该形式克隆基因的核心分离得到纯蛋白，得到其部分序列以及相关抗体，随后搭建基因组文库，并结合文库予以筛选[3]。
使用peasy-blunt simple cloning vector连接克隆载体原理
使用peasy-blunt simple cloning vector连接克隆载体原理1. 引言1.1 概述克隆载体是在分子生物学中常用的工具，用于将外源DNA序列插入到宿主细胞中进行研究。
peasy-blunt simple cloning vector是一种具有简易操作和高效性的克隆载体。
本文将介绍使用peasy-blunt simple cloning vector进行DNA 克隆的原理和方法步骤。
1.2 文章结构本文共分为五个部分。
首先，对peasy-blunt simple cloning vector进行详细介绍，包括其定义、功能、特点和优势以及应用领域。
接下来，在第三部分中，将概述DNA重组技术的基础知识，并解释克隆载体的作用和构建原理，以及peasy-blunt simple cloning vector在克隆过程中的应用。
第四部分将着重讲解使用peasy-blunt simple cloning vector进行克隆的具体方法步骤，包括实验前准备工作与材料准备、DNA放入克隆载体的方法与步骤详解，以及转化、筛选与验证克隆结果的步骤说明。
最后，在结论与展望部分，将总结实验结果并进行讨论，并提出存在问题和改进方向的展望。
1.3 目的本文旨在详细介绍使用peasy-blunt simple cloning vector进行克隆的原理和方法，以帮助读者全面了解这一克隆技术并能够正确应用于实验中。
通过本文的阅读，读者将能够掌握克隆载体原理、peasy-blunt simple cloning vector的特点和应用，并能够熟练操作克隆过程中的各项步骤。
2. peasy-blunt simple cloning vector简介:2.1 定义和功能:peasy-blunt simple cloning vector是一种常用的克隆载体，它被广泛应用于分子生物学研究中。
克隆载体是用来携带外源DNA片段并将其复制到宿主细胞中的DNA分子。
图位基因克隆
文章编号:1008—9632(1999)03—0001—1图位基因克隆Ξ涂友斌 王 纪(中国科学院等离子体物理所离子束生物工程中心,合肥 230031)摘 要:图位基因克隆是最近几十年中发展并逐步完善起来的基因分离及研究方法。
紧密连锁分子标记的获得及DNA 大片段克隆文库的建立是顺利进行图位基因克隆的重要条件,而对于那些数量性状基因(Q TLs )的克隆更显示了其优越性。
关键词:图位基因;步查;重叠群中图分类号:Q78 文献标识码:A 图1 图位基因克隆原理1 前言高等生物的基因组织结构非常复杂,许多基因的作用机制和产物都是未知的,更有一些基因连其座位都不清楚,所以就很难通过常规途径进行基因克隆。
图位基因克隆(Map -based cloning )的出现解决了这一难题。
顾名思义,图位基因克隆就是将目的基因定位于遗传图谱上,然后对其克隆,它主要是用于分离编码产物尚不知道的目的基因的一种有效的方法。
从理论上讲,任何一种可鉴定出有一个突变的基因,都可以通过图位基因克隆技术予以分离。
一九九二年就已成功用于人类,植物中的拟南芥菜尤其成为当前研究的热点。
从数量上来说,目前植物克隆所得到的抗病基因中有一半以上来自于图位基因克隆。
2 图位基因克隆策略图位基因克隆原理的提出是在一九八六年[1](图1),但当时由于所用的文库插入片段较小,单个克隆往往未能包含完整的基因。
而且各种生物的遗传图谱上可以利用标记还非常少,所以一直未有成功的报道。
近几年来随着高密度DNA 分子标记连锁图谱的构建以及大片段DNA 克隆载体如YAC ,BAC ,P1等发展,为直接定位和克隆基因提供了可能。
211 大片段DNA 克隆文库 作为第一代文库载体的代表,噬菌体和科斯质粒虽然具有稳定,易分离及转化率高等优点,但容载量都在25—45kb 之间。
酵母人工染色体色出现是DNA 克隆容载的一次飞跃[2],它具有着丝粒(CEN )、端粒(TEL )及复制起点(ARS ),能够在酵母细胞中自主复制,利用限制性内切酶切开的左右臂可以连接外源大片段DNA ,通常YAC 容载范围在100—500kb 之间,据报道最大克隆量曾达到1Mb 甚至3Mb 。
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载体 宿主
载体容量
质粒 大肠杆菌
15～20kb
噬菌体 大肠杆菌
17～20kb
柯斯质粒 大肠杆菌
30～45kb
YAC
酵母
350～1000kb
BAC
大肠杆菌
100～300kb
Pl
大肠杆菌
100kb
PAC
大肠杆菌
100～300kb
BIBAC 大肠杆菌Π农杆菌 100～300kb
TAC
大肠杆菌Π农杆菌 100kb
虽然 YAC 能容载较大的片段 ,但是 YAC 克隆 的稳定性较差 ,操作也不方便 ,具有自身难以克服 的缺点 :1) 存在嵌合现象 (chimerism) ,即一个 YAC 克隆中的插入子可能来自两个或多个不同的片段 , 嵌合体的比例达到 10 %～50 % ,这种现象使染色体 步行 (chromosome walking) 和基因分离难度加大 ;2) YAC 克隆的稳定性差 ,插入片段存在重排和丢失现 象 ,这对染色体物理图谱的构建和基因分离都十分 不利 ;3) 插入片段的分离和纯化困难 ;4) 转化效率 低[1] 。 212 细菌人工染色体( BAC)
第 24 卷第 3 期
中 国 生 物 工 程 杂 志
CHINA BIOTECHNOLOGY
2004 年 3 月
大片段克隆载体研究进展 3
樊颖伦1 赵开军1 ,233
(1 中国农业科学院作物科学研究所 农业部作物遗传育种重点实验室 北京 100081) (2 国际水稻研究所中国办事处 北京 100081)
摘要 DNA 克隆技术是分子生物学研究中一项重要的技术手段 。自第一个质粒载体 pSC101 作 为克隆载体以来 ,随着分子生物学技术的发展 ,克隆载体的整体结构 、容载能力和转化效率都有 了很大的改善 。尤其是人类基因组计划的实施 ,产生了 YAC 和 BAC 克隆体系 。随着植物基因组 计划的进行 ,又产生了既能够克隆大片段 DNA 又能够将候选克隆直接通过农杆菌介导进行功能 互补实验的载体 。综述了几种常用大片段克隆载体 YAC、BAC、BIBAC、PAC 和 TAC 的特点及其应 用 ,并对克隆载体的发展作了展望 段克隆载体研究进展
13ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
多基因转化载体系统 。 211 酵母人工染色体( YAC)
真正的人工染色体要在寄主细胞中稳定地复 制并遗传下去 , 必须具备三个元件 : 复制起始区 (origin of replication) ,参与染色体 DNA 复制起始结 构的形成 ;着丝粒 (centromere) ,负责染色体向子细 胞的传递 ;端粒 (telomere) ,对染色体 DNA 两个末端 起封口和保护作用 。Murray 等 (1983) 利用这三个 元件构建了第一个酵母人工染色体 。
遗传稳 定性
稳定 稳定 稳定 不稳定 稳定 稳定 稳定 稳定 稳定
嵌合 可否转 性 化植物
低否 低否 低否 高否 低否 低否 低否 低可 低可
2 大片段克隆载体
大片段克隆载体 YAC、BAC 可以说是随着人类 基因组计划的实施而产生的进行植物基因分离时 ,常要求对候选克隆进 行功能互补实验 ,由于农杆菌介导转化技术的成 熟 ,产生了能够将候选克隆直接通过农杆菌介导进 行功能互补实验的大片段克隆载体 BIBAC、TAC。 近几年来 ,又出现了可以把多个基因聚合并转化的
BAC 载体的容载能力一般为 100～350kb ,虽然 容量没有 YAC 载体大 ,但是 BAC 具有更多优点 :1) 以大肠杆菌载体以环型超螺旋状态存 在 ,从大肠杆菌中提取质粒较方便 ,而从酵母中分 离 DNA 较困难 ;3) BAC 的复制子来源于 F 因子 ,可 稳定遗传 ,嵌合及重组现象少 ;4) 可以通过菌落原 位杂交来筛选目的基因 ,方便快捷 ;5) BAC 载体在 克隆位点的两侧具有 T7 和 Sp6 聚合酶启动子 ,可 以用于转录获得 RNA 探针或直接用于插入片段的 末端测序[1] 。
第三个发展阶段是以近几年发展起来的双元 细菌人工染色体 (binary BAC ,BIBAC) 和可转化人工
收稿日期 :2003209215 修回日期 :2004201208 3 农 业 部“948 ”项 目 ( 20012203 ) ; 国 家“863 ”计 划 资 助 项 目 (2001AA222151 ,2002AA2Z1001215) 。 3 3 通讯作者 ,电子信箱 :zhaokj @mail . caas. net . cn
14
中 国 生 物 工 程 杂 志
第 24 卷
而生 ,具有代表性的载体系统有 BIBAC 和 TAC。 213 双元细菌人工染色体( BIBAC)
1996 年 , Hamilton 等[7] 结合 BAC 载体和 Ti 质 粒的特点 ,构建了双元 BAC 载体 BIBAC2 ,该载体在 结构上具有 BAC 的复制系统 ,又加入在农杆菌中 起作用的 Ri 复制子和抗卡那霉素筛选标记及 T2 DNA 的左右边界 ,因此 BIBAC 能在大肠杆菌和根 癌农杆菌中穿梭复制 。Hamilton 等[7] 已用其将一段 30kb 的酵母 DNA 和一段 152kb 的人类基因组 DNA 通过农杆菌介导成功地导入烟草核基因组 ,并证明 能够稳定遗传 。Bancroft 等[8] 构建了 pCLD04541 双 元载体 ,在 T2DNA 左右边界之间有一个 dBS 多位 点接头 ,使重组子克隆产生更深的蓝色 ,这在低拷 贝的双元载体中具有一定的优势 。 214 P1 克隆系统和源于 P1 的人工染色体( PAC)
基于上述传 图谱和物理图谱构建的主要工具[6] 。但是 YAC、 BAC 载体不能直接进行植物转化 ,在候选克隆的转 化互补实验中需要将外源片段进行亚克隆 ,因而工 作量大 ,同时也有漏失目的 DNA 片段的可能 。因 此 ,可直接用于植物转化的大片段双元载体便应运
第一 阶 段 以 质 粒 ( plasmid ) 、λ 噬 菌 体 (λ2 bacteriophage) 、柯斯质粒 (cosmid ,又称粘粒) 为主 , 主要特点是载体在宿主细胞内稳定遗传 、易分离 、 转化效率高 ,但是克隆容量有限 ,一般小于 45kb 。
第二阶段的克隆载体则突破了上述载体容量 , 显著特点是载体的容载能力扩大 ,约 100～350kb , 主要有酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome , YAC ) 、细 菌 人 工 染 色 体 ( bacterial artificial chromosome ,BAC) 以及源于噬菌体 P1 的人工染色 体 ( Pl2derived artificial chromosome ,PAC) 。
Choi 等[6] 将 CreΠloxP 特异位点重组系统引入 BAC 载体 pBeloBAC11 ,构建了 pBACwich 载体 ,为基 因克隆和鉴定提供了一种新载体 。CreΠloxP 特异 位点重组系统使外源基因可以插入到染色体特定 的位点 ,可以在一定程度上消除由于外源基因随机 整合到染色体而引起的“位置效应”。Choi 等[6] 以 pB证明外源 DNA 片段整 合到染色体的特定位点上 。
Mozo 等[4] 将 卡 那 霉 素 抗 性 基 因 插 入 到 pBeloBAC11 的氯霉素抗性基因的 EcoR Ⅰ位点 ,构 建了 pBeloBACKan 载体 ,使 pBeloBACKan 具有了卡 那霉 素 筛 选 标 记 。Frengen 等[5] 构 建 了 pBACe316 载体 ,其多克隆位点位于蔗糖致死基因 sacB 上 ,这 样重组子可以在含有蔗糖的培养基上进行选择 。 Fu 等 (2000) 在 pBACe316 载体的基础上构建了多克 隆位点为 Mlu Ⅰ和 Not Ⅰ的 BAC 载体 pNOBAC1 , Mlu Ⅰ和 Not Ⅰ是甲基化敏感的内切酶 ,主要作用 于低拷贝序列 ,使用这种载体构建可以减少筛 选相关基因所需的克隆数 。
载体[1] , 这 样 重 组 子 可 以 通 过 蓝 白 斑 进 行 筛 选 , pBeloBAC11 载体是第二代 BAC 载体的代表 。BAC 载体 p IndigoBAC 源自 pBeloBAC11 ,由于 lacZ 基因 的 3′末端的一个点突变 ,能够使 p IndigoBAC 载体产 生比 pBeloBAC11 更深的蓝色[3] 。
BAC 载体系统是在大肠杆菌 F 因子的基础上 发展而来的 , F 因子具有稳定遗传的特点 ,其复制 是严谨型的 ,在每个细胞中仅有 1～2 个拷贝 ,减小 了插入片段发生重组的机率 ,并且 F 因子能够携带 1Mb 的外源片段 。1992 年 ,Shizuya 等[2] 利用 F 因子 的 oriS 、repE 、parA 和 parB 等与复制和调节拷贝数 有关的基因 ,以氯霉素抗性基因为选择标记 ,并利 用电激穿孔转化大肠杆菌 DH10B ,构建了第一个细 菌人工染色体载体 pBAC108L ,它能够克隆约 300kb 的外源片段 ,但是它只有转化选择标记而无重组子 选择标记 ,重组子的选择必需通过杂交进行验证 。 为了进一步方便 BAC 克隆的筛选 ,将 lacZ 基因引 入了 pBAC108L 的克隆位点中 ,构建了pBeloBAC11
YAC 载体的突,其原因是植 物细胞较大 ,有硬而厚的细胞壁 ,同时细胞内多糖 和 DNA 水解酶类多 ,难以得到超大分子量的基因 组 DNA 基因组 , 使构建高等生物基因组遗传图谱和物理图谱成为 可能 ,基因组计划得以顺利实施 。
1994 年 ,Ioannou 等[9] 创建了源于 P1 的人工染 色体 ( PAC) , PAC 载体以 F 因子和噬菌体 P1 为基 础构建 ,兼有二者的特点 ,通过电激穿孔转化可将 PAC 导入大肠杆菌 。其特点是插入的外源 DNA 没 有明显的嵌合和缺失现象 , PAC 载体可以插入约 300kb 的 外 源 片 段 , 可 以 稳 定 遗 传 及 高 效 扩 增 。 PAC 除具有许多 BAC 载体的特征外 ,它的多克隆 位点位于蔗糖诱导型致死基因 sacB 上 ,通过加入 蔗糖和抗生素的培养基筛选出来的克隆都是含有 插入片段的重组子 。但是 ,PAC 载效 率高 。PAC 载体在基因分离和序列分析当中 ,可作 为 YAC 连续克隆群的重要补充 ,日本水稻基因组人工染色体( TAC)