适于茭白茎部蛋白质组分析的双向电泳技术体系的建立
双向电泳的技术流程和样品制备
实验组和对照组 样品的制备
蛋白样品的IEF和PAGE电泳分离 和 蛋白样品的 电泳分离 图像扫描和初步分析
胰酶对脱色后蛋白质的消化 质谱的多肽指纹图、 质谱的多肽指纹图、微测序分析 质谱结果的生物信息学分析和比对 新蛋白质的发现
蛋白信息的 初步获得
其它实验 的进一步 验证
蛋白质组研究的基本技术路线
样品液的准备
标准液：
Reagent 8M urea 50mM DTT or 2mM TBP 4% CHAPS 0.2%carrier ampholytes 0.0002%bromophenol blue ddH2O Amount 47ml of 8.5 stock or 24g urea in 25ml H2O 385mg or 500ul of 200mM TBP stock 2g See next table 100ul of 0.1% stock To 50ml
双向电泳原理
第一向: IEF 变性的等电聚焦电泳根据蛋白 质的等电点分离
第二向: SDS-PAGE SDS 聚丙烯酰胺电泳根据蛋白 质的分子量分离
一块双向电泳胶上可以分离几千个蛋白点
等电聚焦电泳（IEF）原理
在电场存在下的一定pH溶液中，带正电的蛋白分子将向负极移动而带负 电的蛋白分子将向正极移动，在某一pH时，蛋白分子在电场中不再移动， 此时的pH值即为该蛋白质的等电点。
双向电泳分析中的样品制备原则： 双向电泳分析中的样品制备原则： 原则
应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（ 应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包括 多数疏水性蛋白），且制备方法应具有可重现性。 ），且制备方法应具有可重现性 多数疏水性蛋白），且制备方法应具有可重现性。 防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。 防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。 防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰 如酶性或化学性降解等）。 （如酶性或化学性降解等）。 完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。 完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。 尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白， 尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保证 待研究蛋白的可检测性。 待研究蛋白的可检测性。
双向电泳技术原理及其应用
¹双向电泳技术原理及其应用刘上峰 傅俊江 综述 李麓芸 审校(中南大学湘雅医学院人类生殖工程研究室,湖南长沙410078)摘要:双向电泳技术是蛋白质组研究的核心技术之一,本文对其基本原理、分辨率、可重复性、相关数据库、减法分析等作了介绍,并对其今后的发展方向作了展望。
关键词:双向电泳; 蛋白质组; 数据库;减法分析中图分类号:R318133 文献标识码:A 文章编号:100121773(2002)022*******随着后基因组时代的到来,蛋白质组学应运而生。
双向电泳(tw o 2dimensional electrophoresis,22D E)作为蛋白质组研究的三大关键核心技术之一(另二种是质谱技术和计算机图像数据处理与蛋白质组数据库即蛋白质组信息学),仍然是目前分析组份复杂蛋白质分辨率最高的工具,因此日益受到人们的广泛关注。
1 双向电泳的基本原理首先根据蛋白质等电点不同在pH 梯度胶中等电聚焦(isoelec tric f ocusing,IEF)将其分离,然后按照它们的分子量大小在垂直方向或水平方向进行十二烷基磺酸钠2聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS 2PAG E)第二次分离。
根据第一向等电聚焦条件的不同,可将22DE 分为三种系统:第一种系统是在聚丙烯酰胺凝胶中进行,两性电解质在外加电场作用下形成梯度,该系统称为IS O 2D A L T 。
其主要缺点是pH 梯度不稳定,重复性差,上样量低,不利于不同实验室间进行图谱比较;如果第一向电泳使用丙烯酰胺和Immobilines 共聚,形成具有pH 梯度的凝胶,这种系统称为IPG 2D AL T 系统,该系统pH 梯度稳定,不依赖于外加电场,基本上克服了ISO 2D AL T 的主要缺点,无论是重复性和上样量均优于I SO 2D AL T;第三种是非平衡pH 梯度电泳(nonequilibrium pH gradient electrophoresis,NEPhG E),主要用于分离碱性蛋白质,电泳展开时间相对比较短。
双向电泳
双向电泳的应用及研究进展摘要:双向电泳是蛋白质组学研究中最常用的技术,具有简便、快速、高分辨率和重复性等优点。
本文重点介绍了双向电泳的基本原理及其应用。
同时对当前双向电泳技术面临的挑战和发展前景进行了讨论。
关键词: 双向电泳，应用，前景1.1双向电泳技术概述双向电泳（two-dimensional gel electrophoresis, 2-DE）是蛋白分离的黄金标准，由此可以分析生物样品的显著差别，产生的结果用于诊断疾病、发现新的药物靶标和分析潜在的环境和药物的毒性。
双向电泳分离技术利用复杂蛋白混合物中单个组分的电泳迁移，第一向通过电荷的不同分离，另一向通过质量的不同分离。
双向电泳协同质谱技术是正在出现的蛋白组学领域的中心技术。
双向电泳是一种分析从细胞、组织或其他生物样本中提取的蛋白质混合物的有力手段，是目前唯一能将数千种蛋白质同时分离与展示的分离技术，其高分辨率、高重复性和兼具微量制备的性能是其他分离方法所无与伦比的。
双向电泳技术、计算机图像分析与大规模数据处理技术以及质谱技术被称为蛋白质组研究的三大基本支撑技术。
可见双向电泳在蛋白质组学研究中的重要性。
就像Fey和Larsen在他们的综述中提到：“尽管人们都想有新技术取代它，可是如果希望对细胞活动有全面的认识，其他技术无法在分辨率和灵敏度上与双向电泳相媲美”。
1.2双向电泳基本原理1975年,意大利生化学家O’Farrell发明了双向电泳技术[1],双向电泳是指利用蛋白质的带电性和分子量大小的差异,通过两次凝胶电泳达到分离蛋白质群的技术。
双向电泳技术依据两个不同的物理化学原理分离蛋白质。
第一向电泳依据蛋白质的等电点不同,通过等电聚焦将带不同净电荷的蛋白质进行分离。
在此基础上进行第二向的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,它依据蛋白质分子量的不同将之分离。
双向电泳所得结果的斑点序列都对应着样品中的单一蛋白。
因此，上千种蛋白质均能被分离开来，并且各种蛋白质的等电点，分子量和含量的信息都能得到。
茭白茎部膨大前后应激响应的蛋白质组分析
茭白茎部膨大前后应激响应的蛋白质组分析茭白为多年生水生宿根草本植物,主要分布于亚洲东部,在我国有大量栽培,是国内第二大水生蔬菜,深受人们喜爱。
茭白肉质茎的形成与菰黑粉菌侵染密切相关。
茭白肉质茎的膨大过程是菰黑粉菌侵染茭白植株,并在其中生长从而诱发茭白植株产生系列应激响应的过程。
本研究显微观察和比较了菰黑粉菌在正常茭白(龙茭2号和梭子茭)与雄茭不同发育时期茎部组织中侵染分布情况,并采用蛋白双向电泳(two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis,2-DE)和基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(matrix-assisted laserdesorption/ionization time-of-flight/time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF-TOF MS)等技术筛选鉴定了茭白茎部膨大前后的差异蛋白,初步分析了茭白茎部膨大可能的应激响应机制。
一、茭白茎部膨大前后菰黑粉菌侵染分布差异分析雄茭与正常茭白茎部的显微观察发现:雄茭中未检测到菰黑粉菌存在;正常茭白5叶期时茎部已经有菰黑粉菌存在,并以少量的小菌丝簇的形式分布于茭白茎部生长点附近;8叶期时茭白薄壁组织中小菌丝簇数量增多,维管束内菌丝数量明显增加,菰黑粉菌沿着维管束轴向生长;菰黑粉菌在膨大初期的茭白茎部中大量增殖并在维管束周围形成网状结构,而茎部薄壁组织中散布有大量大小不等的菌丝簇。
二、正常茭白茎部膨大前后的差异蛋白的筛选鉴定通过蛋白双向电泳技术对正常茭白与雄茭不同时期(5叶期、8叶期与膨大初期)茎部蛋白质组进行比较分析,筛选获得120个差异蛋白,质谱成功鉴定90个。
根据差异蛋白的功能预测将它们分为7类:23个蛋白与转录与翻译相关,18个蛋白涉及糖类合成代谢,9个蛋白与脂肪酸合成代谢相关,15个蛋白与植物抗逆相关,5个蛋白与细胞分裂相关,9个蛋白参与蛋白酶体泛素途径,5个蛋白与能量合成代谢有关,6个蛋白为其他功能与未知功能。
蛋白质组学研究介绍结合双向电泳
蛋白质组学研究的主要内容和方法
蛋白质表达分析
研究不同生理或病理条件下蛋白质的表 达水平变化，揭示蛋白质的表达模式和
规律。
蛋白质相互作用研究
利用酵母双杂交、免疫共沉淀等技术 手段，研究蛋白质之的相互作用和
复合物的形成。
蛋白质功能研究
通过基因敲除、基因敲减、定点突变 等技术手段，研究蛋白质的功能和作 用机制。
智能化
结合人工智能和机器学习技术，实现双向电 泳的智能化分析，自动识别和鉴定蛋白质， 提高数据分析的准确性和可靠性。
拓展双向电泳技术的应用领域
临床诊断
01
将双向电泳技术应用于临床诊断，通过对生物标志物的检测和
分析，辅助医生进行疾病诊断和治疗方案的制定。
药物研发
02
利用双向电泳技术筛选和鉴定药物作用靶点，为新药研发提供
蛋白质芯片技术
高通量、快速、简便，但灵敏度和分辨率相对较低，且覆盖的蛋白质数量有限。
双向电泳与蛋白质免疫印迹技术的比较
双向电泳
可以对全蛋白质组进行分离和定性，分 辨率高。
VS
蛋白质免疫印迹技术
可以对特定蛋白质进行检测和定量，灵敏 度高，但只能针对已知的蛋白质进行检测 。
05
双向电泳技术的发展前景 和展望
蛋白质的纯化
通过双向电泳，可以去除样品中的杂 质，提高蛋白质的纯度，从而获得更 准确的鉴定结果。
蛋白质的表达和鉴定
蛋白质表达分析
通过比较不同生理状态或不同组织中 蛋白质的表达模式，可以研究蛋白质 的表达水平，进而了解其在生命活动 中的作用。
蛋白质鉴定
通过与已知蛋白质的数据库进行比对， 可以鉴定出双向电泳图谱中的蛋白质， 为后续的功能研究提供依据。
蛋白质组学研究中双向电泳技术的应用
胶中或膜上切取这些 目标蛋 白质作鉴定。现在绝 大多数蛋白质的鉴定是通过质谱分析来完成 的。
丙烯 酰胺 共 价聚 合而 成 ＩＧ胶 条 ，其 优势 主要 Ｐ 有 ［ ：ｐ ６ Ｈ梯度稳定 ，聚焦准确 ，精度高 ，梯度分 ］ 辨率可 达 ００ １Ｈ ． ｐ ；无 阴极漂移及碱性蛋 白丢失 ０
在主要和通用的一向等电聚焦方式［ 。 引
２ ３ 第二 向 电泳 ．
寻找和预分离未知蛋白及其翻译后修饰形式 （ ￣ ｔｓ ｘｔ
—
ｔｍｌ—ｔｎｌｍ ｄ ｅ ｒｓ ｌ ）的方 法 ｏ ｒ ａ ｉ ａｙ ｏｉ ｄｆｍ ，ｅ＇ ａ ｏ ｌ ｉ ｆ ｏ Ｍｓ
第二向是十二烷基磺酸钠 一聚丙烯酰胺凝胶
泳 ，进 行染 色 。 目前 实 验 室 最 常用 的显 色 方 法 是
第一向是等点聚焦电泳 ，根据一 向等 电聚焦
方 式 的不 同 ，可 将 双 向 电泳 分 为 ３种 系统 ： （ ） １
ＩＯ—Ｄ Ｌ （ｓ Ｓ ＡＴ ｉ ｏ—ｅ ｃ ｉ ｆ ｕｉ ｆｌ ｅ 锄 ・ ｌ ｔｃ ｏ ｓ ｇ ｌｗ ｄ ｂ ｅ ｒ ｃ ｎ ｏｏ ｔ ｎ ｉ ｒｓｅｔｍｏ ｕａｎｓ ｘｒ ｓｄ ａ ｏｓ 系 ｉ ｗｔ ｅｐｃｔ ｌ ｌ ａｓｅｐｅ ｅｉ ｄｌ ｎ ） ｏ ｈ ｏ ｅ ｎ ｃ ｓ ｎ ｔ
（ｎ ｎ — ｅ ｕ ｉｒ ｍ ｐ ｇａｉ ｔ ｅ ｃ ｏｈｒｓ ， ｏ ｑ ｉｂｉ ｌ ｕ Ｈ ｒ ｅ ｌ ｔｐｏ ｉ ｄｎ ｅｒ ｅｓ
Ｎ Ｐ Ｇ ）系 统 ，主 要 用 于 分 离 碱 性 蛋 白质 ，但 ＥＨ Ｅ 如果 聚焦 达到 平 衡 状 态 ，碱 性 蛋 白会 离 开 凝胶 基
概 念 出现之前 ，免 疫印迹 法就 已得 到广 泛 的应 用 。
方法与生物质谱技术 的不断进步，以及两者有效 的结合 ，使研究人员能够更加有效地分离蛋 白质
茭白总蛋白质双向电泳技术体系的建立
量、 １ ２ ｄ Ｌ的凝 胶 浓度 、 考 马 斯 亮蓝 Ｇ 一 ２ ５ ０胶 体 考 染法 染 色 ， 最 终可 获得 蛋 白质 点较 多， 背景 清
晰， 分辨 率较 高的 ２ 一 Ｄ Ｅ 图谱 ， 为进 一步 开展 茭 白差异蛋 白质 组 学研 究奠 定 了基 础 。
关 键词 ：茭 白 ； 蛋 白质 组 学 ； 双 向 电泳
（ １ ． Ｄ ｅ ｐ ａ ｒ ｔ ｍ ｅ ｎ ｔ ｏ ｆ Ｂ ｉ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ ａ ｎ ｄ Ｆ ｏ ｏ ｄ ， Ｚ ｈ ｅ ｊ ｉ ａ ｎ ｇ Ｐ ｈ ａ ｒ ｍａ ｃ ｅ ｕ ｔ ｉ ｃ ａ ｌ Ｃ ｏ ｌ ｌ ｅ ｇ ｅ ， Ｎ ｉ ｎ ｇ ｂ ｏ ３ １ ５ １ ０ ０ ， Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ ； ２ ．Ｃ ｏ ｌ ｌ ｅ ｇ ｅ ｏ ｆ Ｆ ｏ ｏ ｄ Ｓ ｃ ｉ ｅ ｎ ｃ ｅ ＆ Ｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ ， Ｎ ａ ｎ ｊ ｉ ｎ ｇ Ａ ｇ ｒ ｉ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ａ ｌ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ ， Ｎ ａ ｎ ｊ ｉ ｎ ｇ ２ １ ０ ０ ９ ５ ， Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ ； ３ ．Ｃ ｏ ｌ ｌ ｅ ｇ ｅ ｏ ｆ Ｂ ｉ ｏ ｌ ｏ ｇ ｉ ｃ ａ ｌ＆ Ｅ ｎ ｖ ｉ ｒ ｏ ｎ ｍ ｅ ｎ ｔ ａ ｌ Ｓ ｃ ｉ ｅ ｎ ｃ ｅ ， Ｚ ｈ ｅ ｊ ｉ ａ ｎ ｇ Ｗａ ｎ ｌ ｉ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ ， Ｎ ｉ ｎ ｇ ｂ ｏ ３ １ ５ １ ０ ０ ， Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ ）
２ １ ０ ０ ９ ５ ； 浙 江 万 里学 院 生 物 与环 境 学 院 ， 浙 汀 波 ３ １ ５ １ ０ ０ ）
摘要 ：为建 立 茭 白总蛋 白质双 向 电泳技 术体 系 ， 研究 了Ｔ Ｃ Ａ ／ 丙 酮沉 淀法 和改 良酚 抽 法 两种 不 同
双向电泳技术
4、蛋白样品应在等电聚焦前新鲜配制，或80度分装冻存，绝对避免将样品反复冻融。
5、通过超离心去除所有颗粒性物质，因为颗 粒性物质或脂会阻塞凝胶孔路。
6、为了防止蛋白质被修饰，加入尿素后不要 加热蛋白质样品。当样品中含有尿素时绝 对不要超过37度，升高温度会使尿素水解 成异氰酸盐，使蛋白发生氨甲酰化修饰。
蛋白质组分析的首要要求
将来自于全细胞、组织或生物体中所包含的多达几千种 混合蛋白质进行分离、检测和分析 。
双向电泳技术依然是大多数蛋白质组研究中分离复杂蛋 白质混合物的首选技术。对于蛋白质组学的研究来说，它的 最基本的实验手段就是利用双向凝胶电泳在整个基因组水平 上检测蛋白质表达的情况。
蛋白质组学技术流程
大基本支撑技术。
双向电泳 定义
双向电泳 （two-dimensional electrophoresis)是 一种平板电泳技术 ，是等电聚焦电泳和SDSPAGE的组合，即先进行等电聚焦电泳（按照PI 分离），然后再进行SDS-PAGE(按照分子大小）， 样品中的蛋白经过等电点和分子质量的两次分离 后，可以得到分子的等电点、分子质量和表达量 等信息。
2.减少对蛋白质的人为修饰； 3.破坏蛋白质与其他生物大分子的相互作用，并使
蛋白质处于完全变性状态。
制备样品的具体原则
1、样品制备步骤越简单越好，避免目的蛋白 的损失或丢失。
2、裂解细胞或组织要防止蛋白降解。裂解细 胞应在低温下进行（冰水浴或者4度），最 好用加有蛋白酶抑制剂的裂解液直接裂解。
3、样品裂解液应新鲜配制，或分装冻存，而 且要采用高纯度的去离子尿素。
4.起载体作用的两性电解质
即便在变性剂和表面活性剂存在的情况下，某些 蛋白质也需要在盐离子作用下才能保持其处于溶 解状态，否则这些蛋白质在其处于PI点时会发生 沉淀。
东北师范大学2020—2021学年第1学期生物科学《现代分子生物学》考试试卷(附答案)
东北师范大学2020—2021学年第1学期
《现代分子生物学》考试试卷（A卷）
院/系年级专业姓名学号
考生答题须知
1．所有题目答题答案必须做在考点发给的答题纸上，做在本试题册上无效。
请考生务必在答题纸上写清题号。
2．评卷时不评阅本试题册，答题如有做在本试题册上而影响成绩的，后果由考生自己负责。
3．答题时一律使用蓝、黑色墨水笔或圆珠笔作答（画图可用铅笔），用其它笔答题不给分。
4．答题时不准使用涂改液等具有明显标记的涂改用品。
东北师范大学2020—2021学年第1学期《现代分子生物学》考试试卷（A卷）
标准答案。
双向电泳法
双向电泳法双向电泳法（Bidimensional Electrophoresis，2-DE）是一种常用的蛋白质分离技术，可以同时分析样品中上千种蛋白质。
本文将详细介绍双向电泳法的原理、步骤和应用。
原理双向电泳法结合了等电聚焦（IEF）和SDS-PAGE两种技术，通过两个维度的分离将复杂的蛋白质混合物分解为一系列单独的斑点。
在第一维度中，根据蛋白质的等电点（pI）进行分离；在第二维度中，根据蛋白质的分子量进行分离。
通过将这两个维度的分离结果叠加，可以获得高分辨率的蛋白质图谱。
双向电泳法的关键步骤如下：1.等电聚焦（IEF）：在第一维度中，使用等电聚焦技术将样品中的蛋白质按照其等电点进行分离。
等电聚焦是一种基于蛋白质在电场中向氧化物离子（OH-）或氢离子（H+）方向移动的分离方法。
在等电聚焦过程中，蛋白质会在pH梯度中向其等电点迁移，直到净电荷为零。
通过控制pH梯度和应用的电压，可以将蛋白质在等电聚焦过程中分离开。
2.SDS-PAGE分离：在第二维度中，将第一维度的等电聚焦凝胶与SDS-PAGE凝胶垂直叠加。
在SDS-PAGE凝胶中，蛋白质通过聚丙烯酰胺凝胶的孔隙随着电场的作用向阳极迁移。
由于SDS（十二烷基硫酸钠）的存在，蛋白质在SDS-PAGE凝胶中的迁移速度与其分子量成反比。
因此，蛋白质在SDS-PAGE 凝胶中会根据其分子量进行分离。
3.染色和分析：经过双向电泳分离后，凝胶可以通过染色方法显示出一系列斑点，每个斑点代表一个蛋白质。
常用的染色方法包括银染法、荧光染色、贵金属染色等。
对于银染法，它在灵敏度和线性范围上具有优势。
染色后可以使用成像设备捕捉图像并进行定量分析。
通过对斑点的比较和定量，可以识别不同样品之间的差异和变化。
步骤双向电泳法的步骤如下：1.样品制备：将待分析的生物样品（如细胞提取物）进行蛋白质提取，并使得蛋白质在石蜡中可溶解。
常用的方法包括总蛋白提取、亲和层析、激光捕获等。
2.等电聚焦（IEF）：将蛋白质样品与具有连续pH梯度的凝胶进行接触。
陆地棉花药蛋白质组分析中双向电泳技术体系的建立与优化
ｔ ｎ ｉ ｅｅ ｔｉ ｆ ｃ ｓ ｇ ｅｅ ｔｏ ｈ ｒ ｓｓａ ｄ ｔ ｅ ｖ ｌｍ ｅｏ ｅ ｓ ｍｐ ｅ Ｉ ｉ ｅ ｐ ｃ ｅ ａ ｈ ｎ ｌ ｘ ｒ ｃｉ ｎ ｍ ｅｈ ｎ ｌ ｍｍｏ ｉ ｉ ， ｓ ｌｃ ｒ ｏ ｕ ｉ ｌｃ ｒ ｐ ｏ ｅ ｉ ｎ ｈ ｏ ｕ ｆ ｈ ａ ｌ ． ｔ ｓ ｘ ｅ ｔ ｄ ｔ ｔ ｅ ｏ ｔａ ｔ — ｔ ａ ｏ／ ｏ ｏ ｃ ｎ ｔ ｈ ｐ ｅ ｏ ａ ｎ—
（ ． 京农 业大 学 农 学 院 ， 京 ２ ０ ９ ； ． 家 海 洋 局 海 洋 三所 ， 门 ３ １ ０ ） １南 南 １０ ５ ２国 厦 ６０５
ห้องสมุดไป่ตู้
摘 要 ： 立 了适 用 于 陆 地 棉 花 药 蛋 白质 组研 究 的双 向 电泳 技 术 。以 陆地 棉 花 药 为材 料 ， 用液 氮研 磨 的方 法 破 建 采
ｌｎ ｏ ｏ （ ｏ ｓｐｕ ｈ ｓ ｔｍ Ｌ） ａ ｄＣ ｔ ｎＧ ｓ ｙ ｉ ｔ ｍ ｉ ｕｕ ． ｒ
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双向电泳比较两种方法获得的水稻叶片蛋白
双向电泳比较两种方法获得的水稻叶片蛋白梁书剑;张萌;王巍;关双红;孙野青【期刊名称】《生物学杂志》【年(卷),期】2009(26)3【摘要】水稻是研究单子叶植物遗传和分子生物学的模式植物,是研究植物基因组学和蛋白质组学的一个重要的生物材料.双向电泳作为蛋白质组学中蛋白分离的主要方法,其关键步骤在于蛋白质的提取.为了比较不同蛋白提取方法,采用TCA/丙酮沉淀法和Mg/NP-40提取法分别提取水稻叶片总蛋白,用双向凝胶电泳分离两种方法获得的蛋白.结果表明,在双向图谱中,Mg/NP-40提取法分离的蛋白点数较多,RuBisCO大亚基的含量较低,适于分离等电点在5～7范围内、分子量在14～20kD和高于67kD的水稻叶片蛋白质;TCA/丙酮沉淀法分离的蛋白点数较少,适于分离等电点在4～5范围内、分子量在31～67kD内的水稻叶片蛋白质.【总页数】4页(P68-71)【作者】梁书剑;张萌;王巍;关双红;孙野青【作者单位】哈尔滨工业大学生物系,哈尔滨,150001;哈尔滨工业大学生物系,哈尔滨,150001;哈尔滨工业大学生物系,哈尔滨,150001;哈尔滨工业大学生物系,哈尔滨,150001;哈尔滨工业大学生物系,哈尔滨,150001;大连海事大学系统生物学研究所,大连,116026【正文语种】中文【中图分类】Q331【相关文献】1.双向电泳中不同样品裂解液对水稻叶片疏水蛋白溶解效果比较 [J], 王琳;范云峰;粱建生2.佳辐占和广陆矮4号水稻叶片蛋白质的双向电泳比较研究 [J], 林建峰;石艳;陈清西3.缺铁逆境胁迫下水稻叶片蛋白的双向电泳及其蛋白质组图谱分析 [J], 张艳萍;靳飞;柴小青;卫功宏;印莉萍4.佳辐占和广陆矮4号水稻叶片蛋白质的双向电泳比较研究 [J], 林建峰;石艳;陈清西5.双向电泳分离水稻叶片蛋白实验教学的探索 [J], 王琳;陆添宇;杨晓勤;王梦芝因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
双向电泳技术2008a
双向电泳实验流程
样品制备（Sample preparation） 固相预制胶条的水化（IPG strip rehydration） 第一向等电聚焦（IEF） 胶条的平衡（IPG strip equilibration） 第二向SDS-PAGE电泳（SDS-PAGE electrophresis） 凝胶的染色及检测（Detection/Staining） PDQuest软件分析（Software analysis） 质谱鉴定（Protein identification）
RM M RMM
RMM M RMMM
单体和双体在凝胶中的总浓度（T）
ab T 100 （％） m
a代表单体的重量（g）；b代表双体的重量（g）；m代表溶 液中的体积（ml）
交联度（表
PAG浓度与蛋白质分离物分子量之间的关系
Two-dimensional gel electrophoresis
双向凝胶电泳技术的应用
• 用于分离细胞或组织蛋白质粗提物 • 构建特定组织或细胞的蛋白质“二维参考图谱”； • 分析特定时间与生理状态下蛋白质的表达情况，进 行蛋白质组差异比较。 • 已构建特定组织或细胞的蛋白质2DE图谱数据库 • 不同生物、不同器官、组织、细胞的专一性2DE数据 库，为实现对已知蛋白质的分析鉴定、未知蛋白的 发现、总结蛋白质结构、性质与功能的规律以及实 现模拟与预测等奠定了基础。
十二烷基磺酸钠
原态蛋白质
当蛋白质的分子量在 15，000－200，000之间时，样 品的迁移率与其分子量的对数呈 线性关系，符合如下方程式：
lg
MW
= －b m
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适于蛋白双向电泳的水稻叶片样品提取方法初探
适于蛋白双向电泳的水稻叶片样品提取方法初探应雯;陆徐忠;李莉;倪大虎;宋丰顺;汪秀峰;杨剑波【摘要】在水稻基因组测序完成后,利用蛋白质组学技术揭示水稻基因功能的研究,已成为水稻分子生物学研究的热点之一.水稻叶片作为DNA研究的便利材料被经常使用,但对蛋白质研究来说,占叶片全蛋白50%～60%的核酮糖二磷酸羧化酶(RuBP羧化酶)对低丰度蛋白常常造成掩盖.以水稻叶片为材料,用不同浓度的聚乙二醇(PEG)去除叶片中RuBP羧化酶.通过SDS-PAGE垂直电泳比较发现,浓度为17%的PEG对去除RuBP羧化酶效果最好,所获得的蛋白质样品可以得到质量较高的双向电泳图谱.【期刊名称】《生物学杂志》【年(卷),期】2010(027)003【总页数】4页(P84-87)【关键词】水稻叶片;RuBP羧化酶;聚乙二醇;双向电泳【作者】应雯;陆徐忠;李莉;倪大虎;宋丰顺;汪秀峰;杨剑波【作者单位】安徽农业大学生命科学学院,合肥,230036;安徽农业科学院水稻所,合肥,230031;安徽农业科学院水稻所,合肥,230031;安徽农业科学院水稻所,合肥,230031;安徽农业科学院水稻所,合肥,230031;安徽农业科学院水稻所,合肥,230031;安徽农业科学院水稻所,合肥,230031;安徽农业科学院水稻所,合肥,230031【正文语种】中文【中图分类】Q503生物的生长发育是基因的表达过程，蛋白质是基因的表达产物，在蛋白质组水平上揭示生命现象的本质和活动规律，是现代分子生物学研究的热点之一[1-2]。
双向电泳(two-dimensional electrophoresis, 2-DE)作为蛋白质组研究的专门技术，倍受研究者的重视。
2-DE 技术的第一向等电聚焦(isoelectricfocusing, IEF)是基于蛋白质等电点不同而将其分离；第二向SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)是基于蛋白质亚基分子质量不同将第一向分离后的蛋白质进一步分离。
双向电泳
双向电泳（two-dimensional gel electrophoresis, 2-DE）是一种分析从细胞、组织或其他生物样本中提取的蛋白质混合物的有力手段，是目前唯一能将数千种蛋白质同时分离与展示的分离技术，其高分辨率、高重复性和兼具微量制备的性能是其他分离方法所无与伦比的。
双向电泳技术、计算机图像分析与大规模数据处理技术以及质谱技术被称为蛋白质组研究的三大基本支撑技术。
2D 电泳优越性●对未处理样本耐受性好●不需要预纯化(如：色谱层析)●分辨率非常高●2D 可以有效的组分收集器●蛋白在凝胶介质中受到保护●在蛋白质组学技术中应用范围最广（front-end ）●与其他技术相比，在一次试验中可检测到的蛋白点更多●与后续分析技术兼容性好一、基本原理：先将蛋白质根据其等电点在pH梯度胶内（载体两性电解质pH梯度或固相pH 梯度）进行等电聚焦，即按照它们等电点的不同进行分离。
然后按照它们的相对分子质量大小进行SDS-PAGE第二次电泳分离。
样品中的蛋白经过等点电和分子质量的两次分离后，可以得到分子的等电点、分子质量和表达量等信息。
值得注意的是，双向电泳分离的结果使蛋白质点而不是条带。
根据Cartesin坐标系统，从左到右是pI的增加，从下到上是分子质量的增加。
第一向：等电聚焦1．[基本原理]从电泳观点看，蛋白质最主要的特征是它的带电行为。
蛋白质是由20种不同的氨基酸按不同比例通过肽键的连接构成的。
由于蛋白质的一些氨基酸侧链在一定的pH值的溶液中是可解离的，从而带有一定的电荷。
构成蛋白质的所有氨基酸残基上所带正负电荷的总和便是蛋白质所带的净电荷。
蛋白质在不同的pH环境中带不同数量的正电或负电，在低pH时，蛋白质的净电荷是正的，在高pH时，其净电荷是负的，但在某一pH时，它的净电荷为零，此pH即为该蛋白质的等电点（isoelectric pointpI）。
蛋白质的等电点值取决于其氨基酸的组成，是一个物理化学常数。
双向电泳技术原理及其应用
向电泳 图谱 ， 拼接 成 一 张 完整 的 双 向 电泳 图谱 但
因细胞 内含 有 ３ —５万 种 蛋 白 质 ， 远 不 能 满 足 需 远
１ 双向 电泳 的基本 原理 首先 根据 蛋 白质 等 电点不 同在 Ｄ Ｈ梯 度 胶 中 等
要 尽 管在 膜 蛋自制 备 和 双 向 电泳 ｐ Ｈ梯 度范 围扩 白质组 已有 报道 ” ， 。但对 细胞 内 的低拷 贝蛋 白、 端 极 酸性或 碱性 蛋 白、 分子 量 过 大或 过小 蛋 白 、 溶蛋 白 难 （ 包括膜 蛋 白） 的 电 泳 分 离 和 检 测仍 面 临 很 大 困 等
实验表 明“ 虽然其 蛋 白质 点 相 对 位置 有 较 好 的重 ，
较 ； 果第 一 向电泳 使用 丙烯 酰 胺 和 ｈｍ ｂｌｅ 共 复性 ， 如 ｎ ｏｉｎｓ ｌ 但其 蛋 白质 点 数 最 多 可 相 差 ５０多 点 通 过 ０ 聚 ， 成 具 有 ｐ 梯 度 的 凝 胶 ， 种 系统 称 为 ＩＧ 简化程 序可 以提高重 复 性 ， 如省去 浓 缩胶 ， 第二 形 Ｈ 这 Ｐ－ 例 在
称 为 Ｉ Ａ Ｔ Ｓ Ｄ Ｌ 。其 主 要 缺 点是 ｐ 梯度 不 稳 定 ， Ｏ Ｈ 重 复性差 ， 上样 量低 ， 利于不 同实验 室 问进 行 图 谱 比 不
入 了 固 定 的 载 体 两 性 电解 质 ｌｍ ｂ ｉ ， 是 由 ｍ ｏｉ ｅ 可 ｌ ｎ Ｉ ｍ ｂｌｅ２Ｄ ｍ ｏ ｉｎ一一 Ｅ凝胶 难 以 获 得 同等 的 重 复 性 数 据 ， ｌ
复性 和 上样 量均优 于 ＩＯＤ Ｌ ； 三种是 非平 衡 口 整 个 ２Ｄ Ｓ —￣ Ｔ 第 Ｈ －Ｅ过 程 的 自动 化 已经 做 了初 步尝试 。 。 梯度 电 泳 （ｏｅｕｉｉｍ ｐ ｒｄ ｎ ｜ ｔｐｏｅｉ， ｎｎｑ￣ｂｕ Ｈ ｇａｉ ｔｅ ｃｏｈｒｓ Ｉｒ ｅ ｅｒ ｓ
木本植物叶片蛋白质双向电泳技术体系的建立
１ 材 料 与 方 法
１ １ 材 料 ．
材 料取 自南京林 业 大学 校 园内 中 国鹅 掌楸 和北 美鹅 掌楸 的成 年植 株 ， 片样 品 采集 后 先 于液 氮 中 叶
文章编 号 ： ０ ２８ （０６ ０ ０５ ０ １ ０— ２６２０ ）５— ７８— ４ ０
木 本植物 叶片蛋 白质双 向电泳 技 术体 系 的建 立
刘 建 ， 坚 周
（ ． 京 林 业 大 学 森 林 资 源 与 环 境 学 院 ， 苏 南 京 ２ ０ ３ ；． 西 林 业 科 学 研 究 院 中 南 速 生 材 繁 育 实验 室 ， 西 １南 江 ｌ０ ７ ２ 广 广
Ｐｒ ｔ ｉ ｓ ｆ ｏ ａ ｆＷ ｏ ｄ ａ ｔ ｏ ｅ ｎ ｒ ｍ Ｌｅ ｆｏ ｏ ｙ Ｐｌ ｎ
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究 的前提 ， 否则 这些 物质 会干 扰 电泳 。 因此 ， 文 以木 本植 物 中国鹅 掌 楸 （ ｉｏｅｄｏ ｈｎｎｅ 和北 美 本 Ｌｒ ｄ ｎ ｒｎｃｉ ｓ） ｉ ｅ
鹅 掌楸 （ ｉｏ ｅｄｏ ｕｐ ｅ ） 熟 功能 叶 片为材料 ， Ｌｒ ｄｎ ｒｎｔ ｉｉｒ 成 ｉ ｌｆ ａ 建立 以木本植 物 叶片 为研 究 对象 的 实验 体系 ， 仅 不
分析效果 。 关键 词 ： 本 植 物 ； 木 叶片 蛋 白 质 ； 向 电泳 双 中图 分 类 号 ：６ ；７ ８ ￥６ ｓ １ 文 献 标 识 码 ： Ａ
适于双向电泳分析的番茄叶片总蛋白提取方法的优化
适于双向电泳分析的番茄叶片总蛋白提取方法的优化徐幼平;徐秋芳;蔡新忠【期刊名称】《浙江农业学报》【年(卷),期】2007(019)002【摘要】比较了三氯乙酸(TCA)、酚和十二烷基硫酸钠(SDS)3种提取方法在所获番茄叶片总蛋白产量及其在SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨率等方面的区别,并对3种蛋白溶解液以及超声处理在蛋白质溶解中的作用进行了分析探讨.结果表明,TCA 提取法最佳,该方法提取番茄叶片总蛋白的得率最高、所获蛋白在SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳中形成条带数目最多,最清晰;酚法次之;SDS法最差.由离液剂和去污剂组成的蛋白溶解液复溶蛋白沉淀所获蛋白产量显著高于Tris-NaCl溶解液.还原剂和两性电解质以及超声处理显著增进蛋白质的溶解,提高蛋白产量.采用TCA提取法获得蛋白沉淀,再以溶解液Ⅱ(7 mol/L尿素,2 mol/L 硫尿,2%CHAPS,2%SB3-10,65 mmol/L DTT,0.2%两性电解质)溶解,结合超声助溶的方法体系可以获得高得率和高电泳分辨率的番茄叶片总蛋白样品,该方法适用于双向电泳分析等下游操作.【总页数】4页(P71-74)【作者】徐幼平;徐秋芳;蔡新忠【作者单位】浙江大学,分析测试中心,浙江,杭州,310029;浙江大学,生物技术研究所,植物保护系,浙江,杭州,310029;浙江大学,生物技术研究所,植物保护系,浙江,杭州,310029【正文语种】中文【中图分类】Q503【相关文献】1.适于番茄叶片蛋白质组分析的双向电泳优化体系的建立 [J], 王强;王娟;李宁;唐亚萍;杨涛;王柏柯;杨生保;帕提古丽;余庆辉2.适于双向电泳分析的苹果叶片蛋白质提取方法 [J], 曾广娟;李春敏;张新忠;滕云龙;董文轩3.适于双向电泳分析的酵母胞外蛋白提取方法 [J], 杜维;朴永哲;黄玮;谷月;赵长新4.西藏巨柏双向电泳叶片总蛋白提取方法优化 [J], 尹泽超;王玉婷;王耀杰;桑利群;罗秋香;孟凡娟5.苹果叶片总蛋白提取及其双向电泳分析 [J], 张彩霞;李壮;张利义;田义;康国栋;陈莹;丛佩华因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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向聚丙烯 酰胺 凝胶电泳 的方法 。结果表明 ： 应川 ¨ 氯 乙酸 （ Ｃ 一丙 酮沉淀法 在研磨 时加 入聚 乙烯 吡咯烷 二 Ｔ Ａ） 酮（ Ｖ ） 适 当增加 离心 、 ＰＰ ， 沉淀 的次数 和时 】 外 捉 高裂解浓 度 ， 以得 到浓度 较高 ， ， 可 质量 较好 的蛋 白质样 品； 在蛋 白含量测定 中减少误差 ， ２Ｄ ‘ ｆｆ 艟的 多少 、 对 －Ｅ力 法ｔ ， 等电聚 焦的程序 进行 优化 ， 比较并 选择染 色 方法 ， 最终得到蛋 白质点数 目多 ， 背景清晰 ， 条纹较少 ， 拖尾现象 明显的电泳图谱 。
浙 江 农 业 学 报 Ａｔ ｇｉ ｈ ｒｅＺ ｅａ ｇｎｉ２ （ ）２ １ ８ ２ １ ｃ Ａ ｒ ｕ ｕａ ｈ ｉ ｅｓ ２ ３ ：８ —２６，００ ａ ｃ ｊｎ ｓ
适 于 茭 白茎 部 蛋 白质 组 分 析 的双 向 电泳 技 术 体 系 的 建 立
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（ 中国计量学院 生命科学学 ； 浙 １ ８ 杭州市农业科 学研究 院 生物技术研 ０
究 所 ， 江 杭 州 ３０ ２ ） 浙 １０ ４
摘
要： 对茭 白茎部总蛋 白的提取方法 ， 以及 ２Ｄ －Ｅ的条件进行 了摸 索比较 ， 以期得 到适 合于茭 白茎部组织 双
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