丝状真菌异源蛋白表达系统研究进展_姜天一
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通过基因融合表达融合蛋白的方法虽然得到了广泛的应 用， 但是其背景知识仍然不是很清楚， 也有一些试图通过融合基 因提高表达量但不成功的例子［２６］。尽管如此， 基因融合仍然是提 高曲霉中异源基因表达量的首选办法。
３ 抑制丝状真菌自身的蛋白酶系统
为了能在丝状真菌中过量表达异源蛋白， 可采用融合表达 技术、使用真菌特异的强启动子， 有时甚 至 还 用 高 拷 贝 数 的 强 启 动子， 但有时仍然不能获得高的异源蛋白产量。有研究显示， 在 很多情况下， 异源蛋白基因的转录水平并未受到影响， 问题仅仅 在 于 分 泌 途 径 和 分 泌 后 ［２７］。应 该 对 丝 状 真 菌 分 泌 途 径 进 行 深 入 探
１ 选择丝状真菌自身的强启动子
为使异源蛋白能够过量表达， 往往选用一些宿主自身的强 启动子来进行调控。
报 道 最 多 的 是 ｃｂｈ１ 启 动 子 。 ｃｂｈ１ 启 动 子 启 动 木 霉 菌 属 （ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ） 的 Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ 外切葡 聚 糖 纤 维 二 糖 水 解 酶Ⅰ基 因 的 转录。曾有研究表明， 用 Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ 发酵生产以外切葡聚 糖 纤 维 二 糖 水 解 酶Ⅰ为 主 的 纤 维 素 酶 ， 产 量 能 达 到 ４０ ｇ ／Ｌ， 是 Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ 胞 外分泌性蛋白总量的 ５０％， 比一般细菌高出好几百倍［１０］。ｃｂｈ１ 启 动子在 Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ 中最大有效个数为 ３ 个， 即超过 ３ 个启 动 子 拷 贝 不会继续增加目的蛋白产率， 其原因可能是特异性识别启动子 的反式作用因子有限， 只能保证一定量的启动子被识别［１１］。但研 究 表 明 ， 这 个 启 动 子 在 黑 曲 霉 （ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ） 中 则 表 现 为 拷 贝数越多增强效果越明显［１２］。最近对 Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ 中木聚糖酶表达调 控机制的研究表明， 其中的调控机制非常复杂［１３， １４］。因此， 意图通 过 过 量 表 达 转 录 调 节 蛋 白 来 无 限 地 增 加 ｃｂｈ１ 启 动 子 启 动 效 率 的方法是不现实的［１５］。但在黑曲霉中情况却相对简单。ｇｌａＡ 启动 子 是 黑 曲 霉 作 为 异 源 表 达 宿 主 时 普 遍 使 用 的 强 启 动 子［１６， １７］， 它 是 黑曲霉的葡萄糖淀粉酶启动子， 能够得到产量非常高的葡糖淀 粉酶［６］。现已阐明， ＡｍｙＲ 和 ＣｒｅＡ 分别是这个启动子的正向和反 向调节蛋白 ［１８］， 通过改变这些反式因子的表达水平 ， 即可影响
１０５１
讨， 以便于寻找适合用作表达宿主的真菌株系。 在这些研究中， 具有突破性进展的是 Ｄｕｎｎ－ Ｃｏｌｅｍａｎ 等 发 现
丝状真菌自身表达的蛋白酶能够明显影响异源蛋白的产量［２８］， 而 不同的丝状真菌和同种真菌不同株系表达的蛋白酶谱有很大不 同。可以根据此特点， 选择不同的种株系用于表达不同的目的蛋 白 ［２９］。解 决 这 个 问 题 的 另 一 种 方 法 是 通 过 诱 变 或 基 因 敲 除 等 技 术 筛 选 出 特 异 的 蛋 白 酶 缺 陷 的 丝 状 真 菌 突 变 株 ［３０］。中 国 科 学 院 微 生 物研究所的刘丽等利用自外诱变技术成功筛选出一株酸性蛋白 酶活性缺陷的黑曲霉菌株， 其生长特性和糖化能力与一般菌株 无异， 但其胞外酸性蛋白酶活性只有正常菌株的 ０．７６％。他们还 利 用 ｖｈｂ 报 告 基 因 比 较 这 株 黑 曲 霉 在 转 录 和 分 泌 水 平 上 的 差 异， 结果显示， ＶＨＢ 的分泌量与酸性蛋白酶活性成明显的负相关 性［３１］， 蛋白酶缺陷型菌株表达量比出发菌株量增加了约 ５００％。由 此可见， 在某些时候宿主分泌的蛋白酶系是决定异源表达成败 的关键因素。
为了使丝状真菌表达分泌异源蛋白的量与表达同源蛋白达 到相当的水平， 研究者进行了多方面的努力， 分别通过不同的途 径提高异源蛋白的表达量和分泌量。这些途径主要包括： ①选择 以丝状真菌自身的强启动子构建的表达盒 来 表 达 外 源 基 因［８］； ② 通过构建融合蛋白提高异源蛋白的分泌水平； ③抑制丝状真菌 自 身 的 蛋 白 酶 系 统 ， 以 降 低 对 异 源 蛋 白 的 水 解［９］； ④优 化 发 酵 条 件和改变发酵方式。
［ 摘要］ 丝状真菌， 俗称霉菌， 在食品工业中被用于生产多种生物酶和有机酸。近年来， 人们发现丝状真菌具有分泌量大、
表达的蛋白有天然活性等特点， 非常适合作为同源和异源重组蛋白的表达宿主， 因此被广泛研究和探讨。简要综述了以黑
曲霉为代表的几种常被用作蛋白表达宿主的丝状真菌的特点、应用中的主要问题和基本解决方案 ， 以及近年关于丝够分泌到细胞外， 不仅便于分离 纯化， 也有利于蛋白的累积。丝状真菌表达的很多自身的蛋白能 够高效分泌到胞外［２３］。利用这个特性 ， 可用异源基因取代某个分 泌性良好的同源蛋白基因的 ３＇ 端， 表达出融合蛋白， 用这个丝状 真菌自身的蛋白作为载体将目的蛋白“运 出 ”细 胞 。 这 种 方 法 能 使异源蛋白的 分 泌 量 提 高 ５～１００ 倍［４］。Ｗａｒｄ 等 最 先 报 道 了 使 用 基因融合技术提高蛋白产量的方法。他们通过将黑曲霉编码葡 糖淀粉酶的基因和牛凝乳酶的基因相融合， 发现通过融合基因 表 达 的 凝 乳 酶 产 量 大 大 超 过 单 纯 异 源 表 达 的 未 融 合 的 凝 乳 酶 ［２４］， 并且融合蛋白在分泌到胞外后会自动水解， 产生凝乳酶。随着研 究的深入和基因融合技术的成熟， 现在大多数融合蛋白表达操 作只使用葡糖淀粉酶的催化结构域融合目的蛋白， 表达的融和 蛋白可用蛋白水解酶特异性水解 Ｎ 端氨基酸序列， 得到目的蛋 白 产 物［２５］。
表达系统的最佳培养条件和发酵条件的研究进展。
［ 关键词］ 丝状真菌； 黑曲霉； 异源表达
［ 中图分类号］ Ｑ７８C Ｑ９４９．３２７．１
［ 文献标识码］ Ａ
Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｒｅｓｅａｒ ｃｈ ｏｆ Ｈｅｔｅｒ ｏｌｏｇｏｕｓ Ｅｘｐｒ ｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ Ｆｕｎｇｉ
ＪＩＡＮＧ Ｔｉａｎ－ ｙｉ， ＺＨＵ Ｐｉｎｇ
长久以来， 丝状真菌不仅在饮料、奶 酪 等 食 品 工 业 和 酶 的 商 业 化 生 产 中 被 广 泛 使 用［１， ２］， 同 时 也 由 于 其 在 商 业 领 域 的 重 要 地 位而得到长期深入的研究。丝状真菌的一些重要特性已逐渐被 人 们 所 认 识 ， 这 些 特 性 包 括 表 达 量 大 、胞 外 分 泌 率 高 、蛋 白 质 分 子折叠和修饰系统接近高等真核细胞、生产的外源蛋白具有天 然活性等［３］。因此， 丝状真菌很快成了颇具 吸 引 力 的 可 用 于 生 产 异源重组蛋白的表达宿主系统［４， ５］。
１０５０
文章编号：１００９－ ０００２（２００７）０６－ １０５０－ ０３
生物技术通讯 ＬＥＴＴＥＲＳ ＩＮ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ Ｖｏｌ．１８ Ｎｏ．６ Ｎｏｖ．， ２００７
综述
丝状真菌异源蛋白表达系统研究进展
姜天一， 朱平 中国医学科学院， 协和医科大学 药物研究所生物合成室， 北京 １０００５１
［ 收稿日期］ ２００７－ ０４－ ０３ ［ 作者简介］ 姜天一（ １９８１－ ） ， 男， 硕士研究生 ［ 通讯作者］ 朱平， （ Ｅ－ ｍａｉｌ） ｚｈｕｐｉｎｇ＠ｉｍｍ．ａｃ．ｃｎ
姜天一等： 丝状真菌异源蛋白表达系统研究进展
ｇｌａＡ 的启动转录效率。还有一些 常 用 的 启 动 子 ， 如 构 巢 曲 霉 （ Ａ． ｎｉｄｕｌａｎｓ） 的 持 家 基 因 ｇｐｄＡ 启 动 子 、受 乙 醇 、乙 胺 和 酮 类 物 质 诱 导的 ａｌｃＡ ／ａｌｃＲ 启动子， 都已被成功地用作异源蛋白在丝状真菌 表达系统的有效启动子［１９， ２０］。阿根廷科学家研究发现［２１］， 用来自粗 糙链孢霉的 ｃｆｐ 基因启动子在丝状真菌中表达异源蛋白时， 其表 达量受到碳源的控制， 可以通过改变碳源来阻遏或诱导异源蛋 白的产生。Ａｎｄｒｉｅ［２２］等使用来自 Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ ｔｒｉｔｉｃｉ ｒｅｐｅｎｔｉｓ（ 属于 半知菌亚门） 的 ＴｏｘＡ 和 ＴｏｘＢ 启动子异源表达了多种报告基因， 并详细阐述了 ＴｏｘＡ 和 ＴｏｘＢ 作为丝状真菌异源表达启动子的 潜 力， 为今后使用这 ２ 种启动子提供了基础。
５ 内质网因素
大多数蛋白需要在内质网中经过正确折叠后才具有生物活 性， 没有正确折叠的蛋白会滞留在内质网中或者被降解清除。细 胞自身具有蛋白质折叠的质量控制机制， 这使得未能正确折叠 的蛋白不能分泌到胞外［３５］。内质网的这种“校读（ ｐｒｏｏｆｒｅａｄｉｎｇ） ”功
丝状真菌卓越的表达和分泌能力一直是吸引人们的最大特 点。丝状真菌中的曲霉属和赤霉属的一些种， 在理想的培养条件 下发酵分泌葡糖淀粉酶的产率可 达 ２０ ｇ ／Ｌ 发 酵 液 ， 分 泌 纤 维 素 酶可达到 ４０ ｇ ／Ｌ 发酵液［６］， 并具有真核 分 泌 机 制 ， 很 可 能 还 具 有 与哺乳动物系统相似的蛋白修饰性 能 ， 如 高 甘 露 糖 型 和 Ｎ－ 糖 基 化等［７］。相比较而言， 细菌表达的蛋白质往往以无活性的、难溶的 包涵体形式存在［３］。因此可以认为， 丝状真 菌 具 有 成 为 理 想 的 表 达宿主的潜力。但是在使用丝状真菌作为宿主表达外源蛋白， 尤 其是非丝状真菌蛋白时， 其分泌效率往往不尽如人意， 产率一般 比表达同源蛋白低 ２ 到 ３ 个数量级［４］。
４ 形态学因素
不同的培养方法产生的丝状真菌具有不同的形态， 其分泌 效 率 也 不 同 。其 中 一 个 原 因 是 菌 体 生 长 改 变 了 培 养 液 的 流 动 性 ， 造成营养物质和氧气在发酵罐中梯度分布； 另一个原因是不同 生长形态往往导致不同的生物量。几种常见的丝状真菌与其相 应的发酵形态见表 １。有人在研究了产黄青霉药瓶培养产生的菌 球后发现， 小于 ４００ μｍ 的菌球全部由具有代谢活性的活细胞组 成； 而直径更大一些的菌球则分成 ４ 个区域， 最外层是具生长活 性的菌丝， 接下来是 ２ 层代谢活性依次减弱的细胞， 最里面是空 心层［３２］。还有人研究了黑曲霉 ＡＢ４．１ 菌株在不同培养系统中、不 同菌体形态时蛋白质分泌产量的变化， 比较了几种发酵系统， 发 现 其 目 的 蛋 白 葡 糖 淀 粉 酶－ ＧＦＰ 的 产 量 在 固 定 化 细 胞 培 养 系 统 中得率最高， 而在传统的药瓶培养系统中得率最低， 两者相差 １０ 倍； 并因此推测， 异源蛋白的合成和分泌主要发生在菌丝尖端生 长 的 过 程 中［３２， ３３］。
Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍａｔｅｒｉａ Ｍｅｄｉｃａ， Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｐｅｋｉｎｇ Ｕｎｉｏｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ， Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００５１， Ｃｈｉｎａ
［ Ａｂｓｔｒ ａｃｔ］ Ｔｈｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ ｏｆ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｔｈｅ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ａｎｄ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｓｏｍｅ ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ ｓｐａｃｅｓ ｏｆ ｆｉｌａ－ ｍｅｎｔｏｕｓ ｆｕｎｇｉ ｗａｓ ｒｅｖｉｅｗｅｄ． Ａｎｄ ｔｈｅ ｂａｓｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ， ｔｈｅ ｐｕｔａｔｉｖｅ ｐｒｏｂｌｅｍｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｕｔａｔｉｖｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ｉｎ－ ｔｒｏｄｕｃｅｄ． Ｉｎ ｔｈｅ ｅｎｄ， ｔｈｅ ａｕｔｈｏｒ ｒｅｖｉｅｗｅｄ ｒｅｃｅｎｔ ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｆｕｎｇａｌ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ｏｎ ｈｅｔ－ ｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ． ［ Ｋｅｙ ｗｏｒ ｄｓ］ ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｆｕｎｇｉC Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒC ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
３ 抑制丝状真菌自身的蛋白酶系统
为了能在丝状真菌中过量表达异源蛋白， 可采用融合表达 技术、使用真菌特异的强启动子， 有时甚 至 还 用 高 拷 贝 数 的 强 启 动子， 但有时仍然不能获得高的异源蛋白产量。有研究显示， 在 很多情况下， 异源蛋白基因的转录水平并未受到影响， 问题仅仅 在 于 分 泌 途 径 和 分 泌 后 ［２７］。应 该 对 丝 状 真 菌 分 泌 途 径 进 行 深 入 探
１ 选择丝状真菌自身的强启动子
为使异源蛋白能够过量表达， 往往选用一些宿主自身的强 启动子来进行调控。
报 道 最 多 的 是 ｃｂｈ１ 启 动 子 。 ｃｂｈ１ 启 动 子 启 动 木 霉 菌 属 （ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ） 的 Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ 外切葡 聚 糖 纤 维 二 糖 水 解 酶Ⅰ基 因 的 转录。曾有研究表明， 用 Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ 发酵生产以外切葡聚 糖 纤 维 二 糖 水 解 酶Ⅰ为 主 的 纤 维 素 酶 ， 产 量 能 达 到 ４０ ｇ ／Ｌ， 是 Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ 胞 外分泌性蛋白总量的 ５０％， 比一般细菌高出好几百倍［１０］。ｃｂｈ１ 启 动子在 Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ 中最大有效个数为 ３ 个， 即超过 ３ 个启 动 子 拷 贝 不会继续增加目的蛋白产率， 其原因可能是特异性识别启动子 的反式作用因子有限， 只能保证一定量的启动子被识别［１１］。但研 究 表 明 ， 这 个 启 动 子 在 黑 曲 霉 （ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ） 中 则 表 现 为 拷 贝数越多增强效果越明显［１２］。最近对 Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ 中木聚糖酶表达调 控机制的研究表明， 其中的调控机制非常复杂［１３， １４］。因此， 意图通 过 过 量 表 达 转 录 调 节 蛋 白 来 无 限 地 增 加 ｃｂｈ１ 启 动 子 启 动 效 率 的方法是不现实的［１５］。但在黑曲霉中情况却相对简单。ｇｌａＡ 启动 子 是 黑 曲 霉 作 为 异 源 表 达 宿 主 时 普 遍 使 用 的 强 启 动 子［１６， １７］， 它 是 黑曲霉的葡萄糖淀粉酶启动子， 能够得到产量非常高的葡糖淀 粉酶［６］。现已阐明， ＡｍｙＲ 和 ＣｒｅＡ 分别是这个启动子的正向和反 向调节蛋白 ［１８］， 通过改变这些反式因子的表达水平 ， 即可影响
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讨， 以便于寻找适合用作表达宿主的真菌株系。 在这些研究中， 具有突破性进展的是 Ｄｕｎｎ－ Ｃｏｌｅｍａｎ 等 发 现
丝状真菌自身表达的蛋白酶能够明显影响异源蛋白的产量［２８］， 而 不同的丝状真菌和同种真菌不同株系表达的蛋白酶谱有很大不 同。可以根据此特点， 选择不同的种株系用于表达不同的目的蛋 白 ［２９］。解 决 这 个 问 题 的 另 一 种 方 法 是 通 过 诱 变 或 基 因 敲 除 等 技 术 筛 选 出 特 异 的 蛋 白 酶 缺 陷 的 丝 状 真 菌 突 变 株 ［３０］。中 国 科 学 院 微 生 物研究所的刘丽等利用自外诱变技术成功筛选出一株酸性蛋白 酶活性缺陷的黑曲霉菌株， 其生长特性和糖化能力与一般菌株 无异， 但其胞外酸性蛋白酶活性只有正常菌株的 ０．７６％。他们还 利 用 ｖｈｂ 报 告 基 因 比 较 这 株 黑 曲 霉 在 转 录 和 分 泌 水 平 上 的 差 异， 结果显示， ＶＨＢ 的分泌量与酸性蛋白酶活性成明显的负相关 性［３１］， 蛋白酶缺陷型菌株表达量比出发菌株量增加了约 ５００％。由 此可见， 在某些时候宿主分泌的蛋白酶系是决定异源表达成败 的关键因素。
为了使丝状真菌表达分泌异源蛋白的量与表达同源蛋白达 到相当的水平， 研究者进行了多方面的努力， 分别通过不同的途 径提高异源蛋白的表达量和分泌量。这些途径主要包括： ①选择 以丝状真菌自身的强启动子构建的表达盒 来 表 达 外 源 基 因［８］； ② 通过构建融合蛋白提高异源蛋白的分泌水平； ③抑制丝状真菌 自 身 的 蛋 白 酶 系 统 ， 以 降 低 对 异 源 蛋 白 的 水 解［９］； ④优 化 发 酵 条 件和改变发酵方式。
［ 摘要］ 丝状真菌， 俗称霉菌， 在食品工业中被用于生产多种生物酶和有机酸。近年来， 人们发现丝状真菌具有分泌量大、
表达的蛋白有天然活性等特点， 非常适合作为同源和异源重组蛋白的表达宿主， 因此被广泛研究和探讨。简要综述了以黑
曲霉为代表的几种常被用作蛋白表达宿主的丝状真菌的特点、应用中的主要问题和基本解决方案 ， 以及近年关于丝够分泌到细胞外， 不仅便于分离 纯化， 也有利于蛋白的累积。丝状真菌表达的很多自身的蛋白能 够高效分泌到胞外［２３］。利用这个特性 ， 可用异源基因取代某个分 泌性良好的同源蛋白基因的 ３＇ 端， 表达出融合蛋白， 用这个丝状 真菌自身的蛋白作为载体将目的蛋白“运 出 ”细 胞 。 这 种 方 法 能 使异源蛋白的 分 泌 量 提 高 ５～１００ 倍［４］。Ｗａｒｄ 等 最 先 报 道 了 使 用 基因融合技术提高蛋白产量的方法。他们通过将黑曲霉编码葡 糖淀粉酶的基因和牛凝乳酶的基因相融合， 发现通过融合基因 表 达 的 凝 乳 酶 产 量 大 大 超 过 单 纯 异 源 表 达 的 未 融 合 的 凝 乳 酶 ［２４］， 并且融合蛋白在分泌到胞外后会自动水解， 产生凝乳酶。随着研 究的深入和基因融合技术的成熟， 现在大多数融合蛋白表达操 作只使用葡糖淀粉酶的催化结构域融合目的蛋白， 表达的融和 蛋白可用蛋白水解酶特异性水解 Ｎ 端氨基酸序列， 得到目的蛋 白 产 物［２５］。
表达系统的最佳培养条件和发酵条件的研究进展。
［ 关键词］ 丝状真菌； 黑曲霉； 异源表达
［ 中图分类号］ Ｑ７８C Ｑ９４９．３２７．１
［ 文献标识码］ Ａ
Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｒｅｓｅａｒ ｃｈ ｏｆ Ｈｅｔｅｒ ｏｌｏｇｏｕｓ Ｅｘｐｒ ｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ Ｆｕｎｇｉ
ＪＩＡＮＧ Ｔｉａｎ－ ｙｉ， ＺＨＵ Ｐｉｎｇ
长久以来， 丝状真菌不仅在饮料、奶 酪 等 食 品 工 业 和 酶 的 商 业 化 生 产 中 被 广 泛 使 用［１， ２］， 同 时 也 由 于 其 在 商 业 领 域 的 重 要 地 位而得到长期深入的研究。丝状真菌的一些重要特性已逐渐被 人 们 所 认 识 ， 这 些 特 性 包 括 表 达 量 大 、胞 外 分 泌 率 高 、蛋 白 质 分 子折叠和修饰系统接近高等真核细胞、生产的外源蛋白具有天 然活性等［３］。因此， 丝状真菌很快成了颇具 吸 引 力 的 可 用 于 生 产 异源重组蛋白的表达宿主系统［４， ５］。
１０５０
文章编号：１００９－ ０００２（２００７）０６－ １０５０－ ０３
生物技术通讯 ＬＥＴＴＥＲＳ ＩＮ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ Ｖｏｌ．１８ Ｎｏ．６ Ｎｏｖ．， ２００７
综述
丝状真菌异源蛋白表达系统研究进展
姜天一， 朱平 中国医学科学院， 协和医科大学 药物研究所生物合成室， 北京 １０００５１
［ 收稿日期］ ２００７－ ０４－ ０３ ［ 作者简介］ 姜天一（ １９８１－ ） ， 男， 硕士研究生 ［ 通讯作者］ 朱平， （ Ｅ－ ｍａｉｌ） ｚｈｕｐｉｎｇ＠ｉｍｍ．ａｃ．ｃｎ
姜天一等： 丝状真菌异源蛋白表达系统研究进展
ｇｌａＡ 的启动转录效率。还有一些 常 用 的 启 动 子 ， 如 构 巢 曲 霉 （ Ａ． ｎｉｄｕｌａｎｓ） 的 持 家 基 因 ｇｐｄＡ 启 动 子 、受 乙 醇 、乙 胺 和 酮 类 物 质 诱 导的 ａｌｃＡ ／ａｌｃＲ 启动子， 都已被成功地用作异源蛋白在丝状真菌 表达系统的有效启动子［１９， ２０］。阿根廷科学家研究发现［２１］， 用来自粗 糙链孢霉的 ｃｆｐ 基因启动子在丝状真菌中表达异源蛋白时， 其表 达量受到碳源的控制， 可以通过改变碳源来阻遏或诱导异源蛋 白的产生。Ａｎｄｒｉｅ［２２］等使用来自 Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ ｔｒｉｔｉｃｉ ｒｅｐｅｎｔｉｓ（ 属于 半知菌亚门） 的 ＴｏｘＡ 和 ＴｏｘＢ 启动子异源表达了多种报告基因， 并详细阐述了 ＴｏｘＡ 和 ＴｏｘＢ 作为丝状真菌异源表达启动子的 潜 力， 为今后使用这 ２ 种启动子提供了基础。
５ 内质网因素
大多数蛋白需要在内质网中经过正确折叠后才具有生物活 性， 没有正确折叠的蛋白会滞留在内质网中或者被降解清除。细 胞自身具有蛋白质折叠的质量控制机制， 这使得未能正确折叠 的蛋白不能分泌到胞外［３５］。内质网的这种“校读（ ｐｒｏｏｆｒｅａｄｉｎｇ） ”功
丝状真菌卓越的表达和分泌能力一直是吸引人们的最大特 点。丝状真菌中的曲霉属和赤霉属的一些种， 在理想的培养条件 下发酵分泌葡糖淀粉酶的产率可 达 ２０ ｇ ／Ｌ 发 酵 液 ， 分 泌 纤 维 素 酶可达到 ４０ ｇ ／Ｌ 发酵液［６］， 并具有真核 分 泌 机 制 ， 很 可 能 还 具 有 与哺乳动物系统相似的蛋白修饰性 能 ， 如 高 甘 露 糖 型 和 Ｎ－ 糖 基 化等［７］。相比较而言， 细菌表达的蛋白质往往以无活性的、难溶的 包涵体形式存在［３］。因此可以认为， 丝状真 菌 具 有 成 为 理 想 的 表 达宿主的潜力。但是在使用丝状真菌作为宿主表达外源蛋白， 尤 其是非丝状真菌蛋白时， 其分泌效率往往不尽如人意， 产率一般 比表达同源蛋白低 ２ 到 ３ 个数量级［４］。
４ 形态学因素
不同的培养方法产生的丝状真菌具有不同的形态， 其分泌 效 率 也 不 同 。其 中 一 个 原 因 是 菌 体 生 长 改 变 了 培 养 液 的 流 动 性 ， 造成营养物质和氧气在发酵罐中梯度分布； 另一个原因是不同 生长形态往往导致不同的生物量。几种常见的丝状真菌与其相 应的发酵形态见表 １。有人在研究了产黄青霉药瓶培养产生的菌 球后发现， 小于 ４００ μｍ 的菌球全部由具有代谢活性的活细胞组 成； 而直径更大一些的菌球则分成 ４ 个区域， 最外层是具生长活 性的菌丝， 接下来是 ２ 层代谢活性依次减弱的细胞， 最里面是空 心层［３２］。还有人研究了黑曲霉 ＡＢ４．１ 菌株在不同培养系统中、不 同菌体形态时蛋白质分泌产量的变化， 比较了几种发酵系统， 发 现 其 目 的 蛋 白 葡 糖 淀 粉 酶－ ＧＦＰ 的 产 量 在 固 定 化 细 胞 培 养 系 统 中得率最高， 而在传统的药瓶培养系统中得率最低， 两者相差 １０ 倍； 并因此推测， 异源蛋白的合成和分泌主要发生在菌丝尖端生 长 的 过 程 中［３２， ３３］。
Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍａｔｅｒｉａ Ｍｅｄｉｃａ， Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｐｅｋｉｎｇ Ｕｎｉｏｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ， Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００５１， Ｃｈｉｎａ
［ Ａｂｓｔｒ ａｃｔ］ Ｔｈｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ ｏｆ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｔｈｅ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ａｎｄ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｓｏｍｅ ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ ｓｐａｃｅｓ ｏｆ ｆｉｌａ－ ｍｅｎｔｏｕｓ ｆｕｎｇｉ ｗａｓ ｒｅｖｉｅｗｅｄ． Ａｎｄ ｔｈｅ ｂａｓｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ， ｔｈｅ ｐｕｔａｔｉｖｅ ｐｒｏｂｌｅｍｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｕｔａｔｉｖｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ｉｎ－ ｔｒｏｄｕｃｅｄ． Ｉｎ ｔｈｅ ｅｎｄ， ｔｈｅ ａｕｔｈｏｒ ｒｅｖｉｅｗｅｄ ｒｅｃｅｎｔ ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｆｕｎｇａｌ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ｏｎ ｈｅｔ－ ｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ． ［ Ｋｅｙ ｗｏｒ ｄｓ］ ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｆｕｎｇｉC Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒC ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ