微生物实验操作规范

细菌实验操作部分

㈠培养基的配置

操作步骤

1.称量：按培养基配方比例依次准确称量放入烧杯中（用称量勺，称量纸和电子天平）。

2.在烧杯中先加入少量所需蒸馏水，用玻璃棒搅匀，然后再石棉网上加热使其溶解。待药品完全溶解后，补充水分到所需总体积。如果配制固体培养基，将称好的琼脂放入已溶化的药品中，再加热溶化，在琼脂溶化过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底。

3.调pH：在未调pH前，先用精密pH试纸测量培养基pH值，如果偏酸，用滴管向培养基中加入1mol/L NaOH,边加边搅拌，并随时用pH试纸测，反之用1mol/L HCL。

4.分装：（1）液体分装高度以试管高度的1/4左右为宜。

（2）固体分装分装试管，其装量不超过管高的1/5，灭菌后制成斜面，分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶容积的一半为宜。

（3）半固体分装试管一般以试管高度的1/3为宜，灭菌后垂直待凝。

5.加塞：培养基分装完毕后，在试管口或三角烧瓶口上塞上棉塞或硅胶塞，以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能。

6.包扎：加赛后，将全部试管用皮筋捆好，再在棉塞外包一层牛皮纸（报纸即可），以防止灭菌时冷凝水润湿。用记号笔注明日期名称。

7.灭菌：将上述培养基放入121摄氏度，20分钟高压蒸汽灭菌。

8.搁置斜面：将灭菌的试管培养基冷至50°C左右，将试管塞端搁在玻璃帮上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜。

9.无菌检查：将灭菌的培养基放入37℃的温室中培养24至48小时，以检查灭菌是否彻底。

几种常用培养基成分

1．LB Medium (LB 培养基)

Yeast extact (酵母膏) 5g Peptone (蛋白胨) 10g

NaCl 10g Agar (琼脂) 1-2%

Distilled water (蒸馏水) 1000ml pH 7.0

适用范围：大肠埃希氏菌（大肠杆菌）

2.Trypton Soy Agar

胰蛋白胨17.0g 大豆胨 3.0g

葡萄糖2.5g 琼脂20.0g

NaCl 5.0g K2HPO4 2.5g

蒸馏水1000ml

3.Nutrient Agar (营养肉汁琼脂)

Pepton (蛋白胨) 5g Beef extract (牛肉膏) 30g

NaCl 5g Agar (琼脂) 15g

Distilled water (蒸馏水) Adjust (调) pH to 7.0-7.2

4.RS

L-盐酸鸟氨酸6.5g 氯化钠5.0g

L-盐酸赖氨酸5.0g 脱氧胆酸钠1.0g

L-盐酸半胱氨酸0.3g 酵母提取物3.0g

麦芽糖 3.5g 溴麝香草酚蓝0.03g

硫代硫酸钠6.8g 新生毒素0.005g

枸橼酸铁铵0.8g 琼脂12.5g

蒸馏水1000mL

5.麦康凯

蛋白胨20.0g 乳糖10.0g

牛胆盐5.0g 氯化钠5.0g

中性红0.03g 琼脂14.0g

pH 6.9-7.3

㈡几种试剂的制备

波恩试剂：75% 饱和苦味酸25%福尔马林5%冰乙酸

㈢细菌的分离

1．待检材料的处理

无菌采集的病料不经处理可直接用于分离；污染较严重的病料，接种前必须处理后方可进行分离培养。

（1）加热处理法

当怀疑病原菌为芽胞菌时，可加入5-10倍灭菌生理盐水研磨(液体病料除外)，75℃水浴30min(或80℃ 15-20min)，可杀死细菌繁殖体(包括杂菌及病原菌)；然后将处理过的病料接种到适当的培养基上。

（2）接种易感动物

把病料接种易感动物，待其发病死亡后，取其血液或组织器官，接种到培养基上。利用此方法不但可以从污染的材料中分离出病原菌，而且还可以确定病原菌的毒力。

（3）化学药品处理

有些化学药品对某些细菌有极强的抑制力，而对另一些细菌则没有抑制作用或很小。因此可将适宜的化学药品加入培养基中。如龙胆紫则可抑制许多G＋菌的繁殖，有利于G－菌的分离培养；

2．平板划线分离培养法

（1）培养基平板的准备

取普通琼脂培养基或含有特殊成分的琼脂培养基，融化并让其冷却至50℃左右，倾入灭菌平皿中，每个平皿约15mL，使其分布均匀，冷却凝固后即为固体平板培养基。

（2）各种物品的准备

取出待检病料，置于工作台上；接种前准备好酒精灯、接种环、火柴、酒精棉球、试管架等。如有超净工作台，应先打开通风机，过滤除尘，如有紫外线灯应同时打开，10-15min后可开始工作。不论在桌面上还是在超净工作台上接种，都要事先作好准备工作，把所用的物品器械摆好。

（3）平板划线

以左手持平板，中指、无名指和小指托着平板底,拇指和食指打开上盖，使盖与底成30o角，以便划线。

右手握接种环，先灭菌铂丝部分，待丝烧红后，再于火焰上灭菌金属棒部分。把接种环上的病料涂在培养基一侧，一般作5-8次划线。将环上的多余细菌材料烧掉后，从第1次划线引出第2次划线；再从第2次划线引出第3次划线，如此反

复3-4次划线后，即可把整个平板表面划满，注意每一次划线只能与上一次划线重叠，这样就可在最后的1-2次划线上出现多量的单个菌落，以便进行纯培养。（4）培养物的观察

病料在接种培养基后，经过一段时间，应取出来检查其生长状况。首先用肉眼检查有无细菌生长；若有，则需进一步检查菌落是否纯一。

当从临床病料中分离细菌时：多数情况下，沿划线生长较多的菌落，是待检病原菌的可能性较大；少数零散分布或不在划线上生长的菌落，多为杂菌。为慎重起见，可挑选若干个可疑菌落分别进行鉴定。

3．厌氧菌的分离培养法

通常使用物理去氧、化学去氧和生物去氧，实验室常用：厌氧培养箱、厌氧肉汤4．细菌的纯培养与移植接种

分离培养的目的就是要获得纯培养。细菌的纯培养就是只含一种细菌的培养物，最理想的纯培养是一个细菌的后代。细菌的移植接种就是把某种细菌材料移种到一个新的培养基上，使它在其上生长。

㈣接种

接种标本是细菌实验室的一项基本操作技能，目的是使细菌能得到充分的生长和能分离出单个菌落获得纯培养而供分析鉴定只用，所以

此项技术的操作应按以下方式进行：

1.左手的操作要点：左手负责持平板、试管、烧瓶等物品，操作中，左手应尽

量减少摆动，否则，不利于保持物品的无菌状态。

1.1左手持物品时，最好固定在一个空间方位上，以避免因移动使空气中的细菌进入器皿，造成随机性污染。

1.2 所持器皿其开口尽量避免向上，持平皿时，可以让平板的表面与桌面尽量垂直，试管与烧瓶也可倾斜。当从标本器皿或平板上挑去接种物或菌落后应立即塞上试管塞或扣上平皿，随即接种标本。

2.右手的操作要点：握有接种工具的右手，将接种环沿伸到标本之前应作好接种环用酒精灯消毒的工作，待冷却后到容器中挑取接种物，在挑去标本后，其接种工具应尽量避免接触试管及试管口等。随后将接种物在培养基上分离划线。

3.接种的基本步骤：

3.1 右手持接种工具，在火焰上灼烧3次灭菌

3.2 左手持原代培养物的平皿或试管

3.3 用接种环挑去适量标本或细菌，纯化细菌应从原代培养物上挑取单个菌落。从液体培养基中取菌，只需将接种环在培养液中蘸取一环即可。

3.4 平板划线：接种环，先灭菌铂丝部分，待丝烧红后，再于火焰上灭菌金属棒部分。把接种环上的病料涂在培养基一侧，一般作5-8次划线。将环上的多余细菌材料烧掉后，从第1次划线引出第2次划线；再从第2次划线引出第3次划线，如此反复3-4次划线后，即可把整个平板表面划满，注意每一次划线只能与上一次划线重叠，这样就可在最后的1-2次划线上出现多量的单个菌落，以便进行纯培养。

3.5接种后，应在火焰上反复灼烧接种工具并作一定的编号记录。

㈤细菌的生化试验

1、氧化型与发酵型（O/F）的测定

试验方法：将菌液分别注射到两个O/F生化反应管中

加lmL灭菌的液状石蜡油到一个O/F管作发酵试验