程辉辉 实验单元3：鱼类氧化应激指标的测定

实验单元3：鱼类氧化应激指标的测定

学号No.：2014308110001 姓名Name：程辉辉日期Date：2015.3.21

摘要：鱼体在受到外界刺激的时候，组织或细胞内氧自由基生成增加，清除能力降低，导致活性氧在组织或细胞内蓄积而引起氧化损伤。而活性氧的逐步产生可以导致蛋白质和脂质的氧化。蛋白质羰基化是指蛋白质侧链氨基酸被氧化修饰后，羰基产物积累，蛋白质功能丧失甚至被降解。而衡量脂质过氧化的指标便是丙二醛，其是脂质过氧化物的最终分解产物之一，常作为脂类过氧化的测定指标。在本实验中，我们主要探究了脂质过氧化和蛋白羰基化的测定方法，以便更好的定量衡量氧化应激的程度。实验中所测得的肌肉蛋白质羰基含量为727.92 nmol/mg prot，肝脏蛋白质羰基含量为1142.41 nmol/mg prot，肌肉MDA含量为0.011 nmol/mg prot，肝脏MDA 含量为0.14 nmol/mg prot，相比其他的实验，所测定结果相差较大。在实验中存在诸多操作失误，希望能在以后的实验中引以为戒，为实验室条件下对鱼类的氧化应激水平奠定实验和操作基础。

关键词：应激；蛋白质定量；蛋白质羰基化；脂质过氧化

【前言】

随着集约化养殖的发展，鱼类在养殖过程中遭受到的应激因素日益增多。人为活动、外界环境的变化、饵料和水体中的有害物质均会对鱼体产生应激。氧化应激反应是有氧生物不可避免的，它是生物体的活性氧簇( reactive oxygen species，ROS)和抗氧化防御系统之间不平衡的结果。ROS是过渡金属离子、农药、石油污染物等物质诱导产生的。自由基是正常细胞新陈代谢过程中由内源性细胞产生的。线粒体呼吸是ROS 主要的内源性来源（李学彬，2009）。ROS 的逐步产生可以导致蛋白质和脂质的氧化，基因表达的改变以及细胞氧化还原状态的变化。

在生物体内，很多脂类含有多不饱和脂肪酸。不饱和脂肪酸双键电子云密度大，化学性质很不稳定，很易受到过氧化作用损伤，产生有细胞毒性的脂质过氧化物。这些化合物能破坏人体细胞正常生理功能，促使人体衰老和诱发癌症。丙二醛（MDA）是脂质过氧化物的最终分解产物之一，常作为脂类过氧化的测定指标，其含量能直接反映机体脂质过氧化程度，并间接反映细胞损伤程度（刘淑兰，2012）。

脂质过氧化的测定通常是通过TBA试验来完成的，其主要应用于食品和生物材料中脂类氧化检测和定量。硫代巴比妥酸法是基于不饱和脂肪酸通过自由基反应，形成氧化自由基而氧化生成环氧化合物，环氧化合物分解生成丙二醛（MDA），MDA 与硫代巴比妥酸（TBA）作用生成TBA染料配合物，此化合物在532nm 下有最大吸收值。通常测试结果表示为532nm下吸光值与丙二醛吸光系数之积，即通常所说TBA值。

蛋白质羰基化是指蛋白质侧链氨基酸被氧化修饰后，羰基产物积累，蛋白质功能丧失甚至被降解。蛋白质羰基含量是蛋白质氧化损伤的敏感指标。蛋白质羰基在体内的形成主要是通过金属离子催化氧化系统（MCO系统)完成的。在这个过程中，Fe2+和Cu2+可以结合在蛋白质的阳离子结合位点。被H2O2或O2攻击之后将侧链含有氨基的氨基酸羰基化（曹溪青，1985）。此外, 羟自由基也可直接作用于肽链, 使肽链断裂, 引起蛋白质一级结构的破坏, 在断裂处产生羰基。目前，大量的研究证明了氧化损伤与衰老和疾病的关系。

实验中采用的蛋白质羰基化的测定方法是2, 4 -二硝基苯肼（DNPH)比色法，这

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是一种是测定蛋白质羰基含量的经典方法。被氧化后的蛋白质羰基含量增多，羰基可与2,4-二硝基苯肼（DNPH ）反应生成红棕色沉淀2,4-二硝基苯腙，将沉淀用盐酸胍溶解后即可读取370nm 下的吸光度值，从而测定蛋白质的羰基含量。

【材料与方法】

选取均重200g 左右的鲫鱼，解剖鱼体，暴露内脏，切离部分肝脏和肌肉组织，然后将其转入玻璃匀浆器中，按照1:9（W/V ）比例加入PBS （匀浆介质），充分研磨均匀，制成组织匀浆液（冰水浴中进行）。

1.匀浆蛋白浓度测定

取约0.5g 组织样品，以1:9比例加入PBS 进行研磨得到组织匀浆。取组织匀浆

上清稀释十倍后用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度。

2.脂质过氧化测定

• 将MDA 标准品浓度（10 nmol/mL ）稀释到0,1,2.5,5,7.5,10 nmol/mL ；

• 取0.2 mL 稀释40倍的未离心的匀浆液和不同浓度的MDA 标准品，分别与0.8 mL 的0.53% TBA 混匀，于95℃孵育60 min ，4℃15000 g 离心15 min ，取上清，测定532 nm 处的吸光值（一定要保证管口的密封性）

• 以MDA 浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线，得到MDA 浓度与吸光值关系的公式。

• 以样品吸光值带入上述公式，计算样品中的MDA 浓度为C MDA （nmol/mL ） • 组织中MDA 含量（nmol/mg prot ）=[C MDA (nmol/mL)]/[Protein mg/ml]

3.组织蛋白质羰基化测定

• 取稀释后的上清50μL ，在上清中加入50μL 的10mmol/L 的DNPH 作为试验管，另取稀释后上清50μL ，加入50μL 的2.5mmol/L 的HCI 作为空白管。

• 将各管置于冰盒中避光放置1h ，每隔15min 涡旋振荡混匀一次。

• 反应完后加入25μL 50%（W/V ）的三氯乙酸（TCA ）溶液来沉淀蛋白质衍生物，4℃ 12000g 离心15min ，弃上清。沉淀用200μL 乙醇和乙酸乙酯的混合物（V ：V=1:1）洗涤（4℃ 12000g 离心15min ），最后沉淀用400μL6mol/L 盐酸胍溶解（37℃，15min ）。之后于12000g 离心15min ，取上清，测定370nm 处吸光值。

• 计算：羰基浓度（nmol/mL ）=[CA/22000]×106×(V final / V sample )

• CA=实验组吸光值-对照组吸光值

V final 是指终体系的体积；V sample 是指所加入的样品体积

蛋白质浓度（nmol/mg protein ）=(Carbonyl nmol/ml)/(Protein mg/ml)

【实验结果与分析】

1.匀浆蛋白浓度的测定结果