程辉辉 实验单元3：鱼类氧化应激指标的测定
最新实验3重金属对鱼肝脏过氧化氢酶-精品课件
（3）蛋白质含量测定： 1、标准曲线绘制：以1mg/mL牛血清白蛋白为标准蛋 白。取六支试管，按下表加入试剂。充分混合1min后 ，在595nm处测定吸光值。以蛋白质含量为横坐标， A595为纵坐标，绘制标准曲线。
试管编号 0
牛血清白 蛋白（μl）
0
蛋白质显 色液 （mL）
（2）活性测定： 在室温条件下，用紫外分光光度计测定过氧化氢酶活
性。参比池为0.01mL 酶样 + 3.0mL 磷酸缓冲液，以此 调零。样品池为0.01mL酶样 +3.0mL 反应液，混合后迅 速放入槽中，盖上盖子。当吸光值开始明显下降的时候， 按动秒表，同时记录当时的数值，随后每10sec 读取一 次数值，连续记录1min。分别测定对照组和污染组金鱼 肝脏过氧化氢酶活性。
三、 实验步骤
（1）组织处理 1、取样：每组取一条重金属染毒后的金鱼，记录污染 物和浓度，解剖，取出肝脏，用双蒸水洗净，擦干。 若肝脏难以识别，取整个内脏团。 2、匀浆：按1g 肝重加12.5mL 匀浆缓冲液的比例加入 缓冲液，在冰水浴（4℃）下用玻璃匀浆器匀浆，匀浆 过程始终保持冰浴，尽可能彻底。 3、离心：将匀浆液移入离心管离心，转速5000g，时 间10min，所得上清液用于过氧化氢酶活性测定。
100S内使H2O2分解一半时的酶蛋白含量。因此，酶 活性单位与一级反应的半衰期有关，半衰期=ln2/K， 半衰期与酶活性关系为：
Activity（Unit）=100（s）/半衰期=100K/ln2 用紫外分光光度计测定H2O2在0~60s内不同时刻的 吸光度A240，求得lnA240-t直线的斜率，即为反应速度 常数K。
由于不同酶样蛋白质含量不同，得到的酶活性必须用 蛋白质含量校正：
程辉辉 感染累枝虫黄颡鱼在患病和痊愈状态下血液生化指标的对比分析
结果分析
实验结论
累枝虫寄生于黄颡鱼可引起鱼体 显著的应激反应，导致鱼体非特 异性免疫能力降低。但治疗痊愈 后，黄颡鱼的非特异性免疫力得 到恢复，鱼体应激反应减弱并表 现出正常的游泳行为。
请各位老师同学 批评指正
患病状态 痊愈状态
皮质醇浓度值（ng/ml）
葡萄糖含量（mmol/L） 酸性磷酸酶活力(King/100ml） 碱性磷酸酶活力(King/100ml） 乳酸脱氢酶活性（U/L） 乳酸含量（mmol/L） 谷草转氨酶活力(U/L) 谷丙转氨酶活力(U/L)
79.27±16.07a
11.25±1.31a 52.45±7.14a 2.58±0.29a 315.40±53.13a 3.07±0.59a 13.32±2.96a 1.42±0.15a
实验设计
实验 结果
寄寄寄 生生生 于于于 头胸背 顶鳍鳍 皮硬硬 肤棘棘 的的的 累累累 枝枝枝 虫虫虫 包包包 囊囊囊
A.
(a), (b), (c)
B. 寄 生 于 下 颌 皮 肤 的 累 枝 虫 包 囊 (d)
C.10×10 显 微 镜 下 累 枝 虫
D. 痊 愈 黄 颡 鱼
黄颡鱼累枝虫患病状态和痊愈状态下血液生化指标的比较（N=10）
研究意义
• 本实验过程中发现累枝虫可感染1龄黄颡鱼成鱼。 • 关于黄颡鱼感染累枝虫后其生理机能变化的研究 ，目前国内外尚无文献报道。 • 血液指标多数用于病鱼和健康鱼的对比分析，并 未对鱼病进行诊治使其恢复健康。 • 黄颡鱼感染累枝虫病后的生理机能变化的研究为 黄颡鱼寄生虫疾病的诊断和治疗提供科学依据。
感染累枝虫黄颡鱼在患病和痊愈状态下 血液生化指标的对比分析
汇报人：程辉辉 导师：李大鹏
风味鱼中过氧化值和酸价的测定
一、 取样方法称取0.5kg 含油脂较多的试样，面包、饼干等含脂肪少的试样取1.0kg ，然后用对角线取四分之二或六分之二或根据试样情况取有代表性试样，在玻璃乳钵中研碎，混合均匀后放置广口瓶内保存于冰箱中。
二、 试样处理1、含油脂高的试样，如桃酥等：称取混合均匀的试样50g ，置于250ml 具塞锥形瓶中，加50ml 石油醚（沸程：30℃~60℃），放置过夜，用快速滤纸过滤后，减压回收溶剂，得到油脂供测定酸价、过氧化值用。
2、含油脂中等的试样，如蛋糕、江米条等：称取混合均匀后的试样100g 左右，置于500ml 具塞锥形瓶中，加100ml~200ml 石油醚，以下按1自“放置过夜”起依法操作。
3、含油脂少的试样，如面包、饼干等：称取混合均匀后的试样250~300g 于500ml 具塞锥形瓶中，加入适量石油醚浸泡试样，以下按1自“放置过夜”起依法操作。
三、原理油脂氧化过程中产生过氧化物，与碘化钾作用，生成游离碘，以硫代硫酸钠溶液滴定，计算含量。
三、 试剂饱和碘化钾溶液：称取14g 碘化钾，加10ml 水溶解，必要时微热使其溶解，冷却后贮与棕色瓶中。
三氯甲烷-冰乙酸混合液：量取40ml 三氯甲烷，加60ml 冰乙酸，混匀。
硫代硫酸钠标准滴定液〔c （Na2S2O3）=0.0020mol/L 〕。
定粉指示剂（10/L ）：称取可溶性定粉0.50g ，加少许水，调成糊状，倒入50ml 沸水中调匀，煮沸。
临时用时现配。
四、 分析步骤称取2.00~3.00g 混匀（必要时过滤）的试样，置于250ml 碘瓶中，加30ml 三氯甲烷-冰乙酸混合液，使试样完全溶解。
加入1.00ml 碘化钾溶液，紧密塞好瓶盖，并轻轻振摇0.5min ，然后在暗处放置3min 。
取出加100ml 水，摇匀，立即用硫代硫酸钠标准滴定液（0.0020mol/L ）滴定，至淡黄色时，加1ml 定粉指示液，继续滴定至蓝色消失为终点，取相同量三氯甲烷-冰乙酸、碘化钾溶液、水，按同一方法，做试剂空白实验。
程辉辉 实验报告1：鱼类采血技术
实验报告1：鱼类采血技术学号No.：2014308110001 姓名Name：程辉辉日期Date：2015.3.7 摘要：血液的生理生化特性是动物对生存环境的适应性反映，也是动物长期进化的结果，因此鱼类的采血技术和一些常规的血液生理生化指标测定是鱼类相关实验研究中的基础。
在鱼类血液相关指标的测定过程中，不同的取血方法对后续血液生理生化指标测定影响很大。
本实验主要学习鱼类尾动脉采血技术和一些基础血液学操作如红比容的测定、血细胞的计数以及血液涂片的观察和血液渗透压的测定。
本实验主要通过采集鲫鱼血液，测定其红细胞比容和血浆渗透压以了解血液组成特性和物理特性，计数其红细胞数目以了解血液中红细胞的数量，观察血涂片以了解血细胞形态。
关键词：鱼类；采血；红细胞比容；血涂片；血细胞计数；血浆渗透压【前言】血液作为动物体内循环系统的重要组成部分，除行使运输功能为身体各个细胞输送养分带走代谢废物外，对机体还具有体内防御、免疫、体液调节以及维持内环境稳定的作用。
因此鱼类的血液生理生化指标的测定是对鱼类生理机能最直观的反应，鱼类血液生理实验也成为了鱼类研究中最常规和最重要的环节之一。
鱼类的血液由红细胞、白细胞和血小板组成，其中红细胞数量最多。
作为机体自稳态系统，鱼类血液中的血细胞数目和形态一般保持着相对稳定的状态。
一旦平衡被打破，必定引起血液中的血细胞数目和形态等发生变化。
因此，血细胞数量和形态的的变化在某种程度上能反映出机体生理或者病理状态的变化。
在血液学研究中，在宏观上，可通过血细胞比容的测定衡量血液细胞组成的变化；在微观上，可通过血细胞计数来衡量血液细胞数目的变化，并通过血涂片以观察其形态的改变。
此外，血浆蛋白浓度和血浆的渗透压是衡量机体生理状态的重要指标。
血浆渗透压包括晶体渗透压和胶体渗透压，各自在维持渗透压平衡和组织液平衡中起到了重要作用。
【材料与方法】选取均重200g左右的鲫鱼，尾动脉采血6ml左右，分装于肝素钠抗凝管1、2和一个未抗凝的采血管3中，抗凝管1作为血浆管，抗凝管2作为全血管，采血管3作为血清管。
氧化应激的定量评价方法大致分做三类
氧化应激的定量评价方法大致分做三类：1）测定由活性氧修饰的化合物；2）测定活性氧消除系统酶和抗氧化物质的量；3）测定含有转录因子的氧化应激指示物。
而根据氧化应激的物质种类，又可主要分为蛋白质氧化损伤标志物检测、脂质过氧化标志物检测、核酸DNA/RNA损伤检测以及活性氧消除系统酶和抗氧化物质检测等。
检测的方法也是多种多样，化学法、免疫染色、ELISA等等就本人经验，核酸DNA/RNA损伤，如8-OHDG ELISA 等方法是比较可靠的，但是通常损伤较重才可能检测出，而传统MDA等脂质过氧化标志物、各种氧化酶化学检测是比较简便的，但却稳定性很差。
大家能否谈谈自己曾采用的相关方法，并从敏感性、简便性等方面谈谈自己的方法ROS氧化损伤碱基后，碱基不稳定，自己掉下去，可以形成AP site(apurinic/apyrimidinic site or abasic site)，或者损伤的碱基被碱基切除（base excision repair）机制切掉形成中间产物。
AP site一般不直接引起细胞凋亡，但是当量太大而又处在S期DNA复制时，细胞在修复AP site 时形成nick直接激活PARP，或者两条互补链上临近的APsite会导致双链断裂，这样激活ATM等，就会进一步传递信号触发细胞凋亡机制了。
一般活性氧才会损伤DNA，过氧化氢不会氧化应激（Oxidative Stress，OS）是指体内氧化与抗氧化作用失衡，倾向于氧化，导致中性粒细胞炎性浸润，蛋白酶分泌增加，产生大量氧化中间产物。
氧化应激是由自由基在体内产生的一种负面作用，并被认为是导致衰老和疾病的一个重要因素细胞氧化损伤后需证实细胞功能障碍可检测哪些指标啊?1.细胞存活率的测定在细胞氧化损伤过程中,每隔半小时吸取100μL细胞液置于96孔微量滴定板,存活细胞用MTT(噻唑兰,serva)染色法确定.MTT溶于pH7.2PBS(终浓度5g/L),过滤灭菌.每孔加入20μLMTT溶液,37℃孵育4h,每孔再加入100μL酸性异丙醇(100μL异丙醇中含0.04NHCl),混匀,静置5min后,将96孔滴定板置于酶联免疫检测仪上,于波长570nm处测定每孔光吸收值OD,用不加MTT的细胞孔作本底对照,细胞存活率=([OD]t/[OD]u)×100%,此处[OD]t为经3种处理方式处理过的细胞光吸收值,[OD]u为未经任何处理的细胞的光吸收值.2. 凋亡细胞DNA电泳分析以800g的速度离心收集处理过的细胞,弃上清后悬浮于40μL96%0.2M磷酸氢二钠于4%0.1M柠檬酸的PC缓冲液中(pH7.8)30min;1kg离心5min后将上清转移至0.5mL Eppendorf管,真空浓缩20min;加入3μL0.25%NP-40溶液和3μL RNaseA(1g/L)溶液,在37℃下孵育30min后,再加入3μL 1g/L蛋白酶K,37℃下继续孵育30min,最后加入12μL电泳指示剂溶液(含0.25%溴酚兰,40%蔗糖).将样品小心加入含溴乙啶的0.8%琼脂糖凝胶点样孔中,在25V电压下电泳10h,于紫外透射仪上观察电泳结果并拍照保存氧化损伤是引起许多组织细胞凋亡的一个重要机制。
鱼类增养殖学水质的检测实验报告
鱼类增养殖学水质的检测实验报告1. 背景鱼类增养殖是一种重要的养殖方式，但水质对养殖鱼类的生长和生存至关重要。
因此，了解水质的关键指标以及其对养殖鱼类的影响是非常重要的。
本实验旨在通过对鱼类增养殖水体进行水质检测，分析检测结果，并提出相应的改进建议，以提高养殖鱼类的健康和生产性能。
2. 实验目的•检测养殖鱼类水体的关键指标，包括溶解氧、pH值、氨氮、硝酸盐、总磷等。
•分析水质指标与养殖鱼类生长和生存的关系。
•提出相应的改进建议，以改善水质并提高养殖效益。
3. 实验方法3.1 测定溶解氧使用氧电极仪对水体中的溶解氧进行测定。
将仪器测量电极放入水中，待读数稳定后记录。
3.2 测定pH值使用pH计对水体的酸碱度进行测定。
将pH电极浸入水中，待读数稳定后记录。
3.3 测定氨氮使用氨氮试剂盒对水体中的氨氮含量进行测定。
根据试剂盒说明书操作，并记录测定结果。
3.4 测定硝酸盐使用硝酸盐试剂盒对水体中的硝酸盐含量进行测定。
根据试剂盒说明书操作，并记录测定结果。
3.5 测定总磷使用总磷试剂盒对水体中的总磷含量进行测定。
根据试剂盒说明书操作，并记录测定结果。
4. 结果分析通过对水质指标的测定，得到以下实验结果：指标测定结果溶解氧8.2 mg/LpH值7.5氨氮0.2 mg/L硝酸盐10 mg/L总磷0.05 mg/L根据对水质指标的分析，可以得到以下结论：•溶解氧：溶解氧水平正常，有利于鱼类呼吸和生长。
•pH值：水体酸碱度适中，有利于鱼类的消化和免疫系统健康。
•氨氮：低浓度的氨氮对鱼类生长无显著影响，但高浓度的氨氮会导致水质恶化和鱼类健康问题。
•硝酸盐：过高的硝酸盐含量可能导致水体富营养化和鱼类疾病发生。
•总磷：适当的总磷含量有利于鱼类的饲料摄取和生长。
5. 改进建议根据水质指标的分析结果，提出以下改进建议：•加强水体的通气和曝气，以提高溶解氧水平。
•定期监测和调节水体的酸碱度，确保pH值处于适宜范围。
•控制饲料投放量，避免过度喂养和过高的氨氮积累。
急性低氧应激对鲫鱼血液生化指标的影响
superoxide dismutase activity( B) in Carassius auratus
第6期
王雪芹等:急性低氧应激对鲫鱼血液生化指标的影响
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2. 4 血清 SOD 酶活力 由图 3B 可知,鲫鱼血清 SOD 活力在急性低
由图 1 B 可知,急性低氧应激过程中,MetHb 含量呈现先微微上升,后快速下降的变化趋势。 低氧应激 3 h、6 h,MetHb 含量与 0 h 均无显著性 差异( P>0. 05) ,12 h 和 24 h 的 MetHb 含量较 0 h 显著下降,24 h 的 MetHb 含量与 0 h 有极显著差 异( P<0. 01) 。
All Rights Reserved. 随着人们对鲜活水产品需求的日渐增大[1] , 水产动物运输量也不断增大,运输过程中环境胁 迫所引起的水产动物应激反应问题日渐突出,尤 其是长时间运输造成水体的溶氧不断消耗,会引 起鱼类强烈的应激反应甚至死亡。 适宜的溶氧水 平对鱼类的生物活动会起到积极作用,当水体低 氧时,会造成机体血液生化指标的变化,引起鱼类 应激反应[2-3] 。 应 激 作 用 下, 鱼 类 机 体 大 量 分 泌 皮 质 醇 ( COR) ,可调节糖原、脂肪和蛋白质的代谢[4-6] , 加速糖异生,为机体提供能量,对抗应激[7-8] 。 因 此血清 COR 和葡萄糖( GLU) 含量常被作为检测 鱼体应激的敏感指标[9] 。 低氧环境下,鱼体血液 摄取和携带氧气的能力会发生改变,引起血红蛋 白( Hb) 和 高 铁 血 红 蛋 白 ( MetHb ) 等 指 标 的 变 化[10] ;体内热休克蛋白 70( Hsp70) 基因的表达量 会 显 著 上 调[11] , 同 时, 机 体 超 氧 化 物 歧 化 酶 ( SOD) 等的活力上升,用以清除过量的活性氧自 由基( ROS) [14] ,维持正常的生理活动。 因此,研 究血液相关生化指标的变化,综合评价鱼类在持
营养素中氧化应激水平的测定实验报告
营养素中氧化应激水平的测定实验报告一、引言氧化应激是指机体内氧化还原平衡被打破，导致过多的自由基和氧化物质积累，从而引发一系列有害反应的过程。
氧化应激与许多疾病的发生发展密切相关，如心血管疾病、神经系统疾病和癌症等。
因此，研究氧化应激的水平对于预防和治疗这些疾病具有重要意义。
营养素在维持氧化还原平衡中起着重要作用。
许多研究表明，适当补充一些特定的营养素可以减轻氧化应激的程度，保护机体免受氧化损伤。
因此，本实验旨在通过测定不同营养素对氧化应激水平的影响，探讨其保护机制，并为人们选择适当的营养素补充方式提供依据。
二、材料与方法1. 实验材料：- 不同营养素：维生素C、维生素E、β-胡萝卜素、硒等；- 某一氧化应激指标的测定试剂盒；- 实验动物（如小鼠）；- 适当的实验设备：离心机、试管、显微镜等。
2. 实验步骤：此处应列出实验的具体步骤，包括：- 按照一定比例制备不同浓度的营养素溶液；- 随机分为不同实验组和对照组；- 将实验动物分组，分别给予不同营养素溶液；- 收集实验动物的血样或组织样本；- 使用氧化应激指标的测定试剂盒进行相关指标的测定；- 分析实验结果，得出结论。
三、结果与讨论1. 结果分析：- 比较不同实验组和对照组的氧化应激指标水平；- 观察实验动物在给予不同营养素后的体征变化。
2. 结果讨论：- 分析不同营养素对氧化应激水平的影响；- 探讨不同营养素的保护机制。
四、结论通过本实验的结果分析与讨论，我们得出以下结论：1. 维生素C、维生素E、β-胡萝卜素、硒等营养素对氧化应激水平具有一定的保护作用；2. 维生素C具有较强的抗氧化能力，可以减轻氧化应激引起的损伤；3. 维生素E可以抑制脂质过氧化反应，防止脂质氧化引起的氧化应激；4. β-胡萝卜素和硒等营养素可以通过激活抗氧化酶系统，增强机体的抗氧化能力。
五、结语本实验通过测定不同营养素对氧化应激水平的影响，揭示了营养素在维持氧化还原平衡中的重要作用。
柱形病对黄颡鱼血液生化指标的影响_程辉辉_李大鹏
第46卷第2期Vol.46No.2淡水渔业Freshwater Fisheries2016年3月Mar.2016收稿日期：2015－05－23；修订日期：2015－11－10资助项目：“十二五”农村领域国家科技计划课题（2012BAD25B06）；中央高校基本科研业务费专项资金资助项目（2014PY041）；湖北省自然科学基金重点项目（2012FFA029）第一作者简介：程辉辉（1990－），男，硕士研究生，专业方向为水产养殖。
E-mail ：chhwoter@通讯作者：李大鹏。
E-mail ：ldp@ ·研究简报·柱形病对黄颡鱼血液生化指标的影响程辉辉，李大鹏（华中农业大学水产学院，池塘健康养殖湖北省工程实验室，淡水水产健康养殖湖北省协同创新中心，农业部淡水生物繁育重点实验室，武汉430070）摘要：为探究柱形病对黄颡鱼（Pelteobagrus fulvidraco ）生理机能的影响，随机选取患病和健康黄颡鱼各10尾，采集其血液，静置后离心分离血清以测定血液生化指标如皮质醇、乳酸（LD ）含量，乳酸脱氢酶（LDH ）、碱性磷酸酶（ALP ）活性，葡萄糖、白蛋白（ALB ）、总蛋白（TP ）、尿素氮（BUN ）、总胆固醇（TCHO ）、高密度脂蛋白胆固醇（HDLC ）、低密度脂蛋白胆固醇（LDLC ）含量，谷草转氨酶（AST ）、谷丙转氨酶（ALT ）活性。
结果显示：患病黄颡鱼血清皮质醇浓度和LDH 、AST 活性均极显著高于健康鱼，LD 含量和ALT 活性显著高于健康鱼。
与健康鱼相比，患病黄颡鱼血清葡萄糖含量极显著降低，而HDLC 、LDLC 、TCHO 、ALB 、TP 、BUN 浓度和ALP 活性无显著差异。
健康鱼肝细胞呈近圆形，形状较规则，细胞界线清晰，细胞核多位于细胞中央，呈圆形或椭圆形，肝细胞以中央静脉为中心形成放射状排列。
患病鱼肝细胞出现局部坏死、空泡化，形成坏死灶，伴有大量中性粒细胞、淋巴细胞浸润。
鱼肉过氧化值测定方法的探讨
文献著录格式：杨天明，杨洋，宣佳娜，等•鱼肉过氧化值测定方法的探讨［J］；浙江农业科学，2019,60（9）：1678,1690. DOI：10.16178/j.issn.0528-9017.20190961鱼肉过氧化值测定方法的探讨杨天明，杨洋，宣佳娜，王朝杰（浙江公正检验中心有限公司赞宇科技集团股份有限公司，浙江临安311300）摘要：根据乳粉中过氧化值测定方法对鱼肉过氧化值的测定方法进行了探讨+对不同鱼肉样品经水解酶水解后采用分光光度法测定其过氧化值，研究鱼肉过氧化值的测定方法+关键词：鱼肉；过氧化值；分光光度法中图分类号：S9；TS254.7文献标志码：B文章编号：0528-9017（2019）09-1678-01鱼类中含有大量优质蛋白质，87%~98%的鱼肉蛋白可被人体吸收利用［1-+鱼肉蛋白质含量高,易发生氧化反应，产生异味+现由鱼肉过氧化值测定主要为滴定法，本研究通过蛋白酶水解鱼肉中蛋白质后［2-，采用石油醚提取鱼肉中的油脂进行测定+试样溶于三氯甲烷-甲醇混合液中，其含有的过氧化物将二价铁离子氧化成三价铁离子，三价铁离子与硫氧酸盐反应生成硫氧酸铁配合物后，用分光光度法测定其吸光度，与标准系列比较定量+1材料与方法1.1仪器与设备试验器材包括TU-1901双光束紫外可见分光光度计，控温水浴锅，AR224CN电子天平，旋转蒸发仪，分液漏斗和10mL具塞玻璃比色管+1.2试剂试验试剂包括石油醚，盐酸，过氧化氢，无水乙醇，木瓜蛋白酶，胰蛋白酶，胃蛋白酶+配置3.5g•‘一1氯化亚铁溶液、300g-‘一1硫氧酸钾溶液、1.0g•‘一1铁标准储备液、0.01g•‘一1铁标准使用液备用+所用试剂未说明纯度的均为AR级，实验室用水均为三级去离子水+1.3方法1.3.1样品提取将鱼样完全打碎［3］，取40g于锥形瓶中，加入胰蛋白酶10g、纯净水100mL，摇晃混匀，使样品完全浸没于水中，40k水浴120min，每隔10min用玻璃棒搅拌+将水解液转移到250mL分液漏斗中，并以50mL石油醚分洗锥形瓶，一并倒入分液漏斗中，加入5mL无水乙醇，加塞振摇1~ 2min后静置30-60min，直到上层液澄清+将上清液吸出置于圆底烧瓶中，38k旋转蒸发仪真空抽出石油醚+1.3.2过氧化值的测定精密吸取铁的标准使用液0.1、0.2、0.4、0.6、1.0、2.0、4.0mL于10mL干燥比色管中，用三氯甲烷-甲醇（7:3）混合溶液稀释至刻度，混匀+加100!L硫氧酸钾溶液，混匀，同时做空白参比溶液+室温避光放置10min后移入1cm比色皿中，于波长500nm处测定吸光度，绘制标准曲线+称取0.2~0.5g（精确至0.001g）样品于10mL干燥比色管中，加100!1氯化亚铁溶液后，用三氯甲烷-甲醇（7:3）混合溶液稀释至刻度，混匀+加100!L硫氧酸钾溶液，混匀，同时做空白参比溶液+室温避光放置10min后移入1cm比色皿中，于波长500nm处测定吸光度，通过标准曲线定量得出样品浓度+2结果与分析使用相同的带鱼样品［4］，在相同的条件和方法下，分别使用木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶作为蛋白质水解酶［5］，比较不同水解酶提取样品产物质量的差异，结果木瓜蛋白酶0.1673g，胰蛋白酶0.2231g，胃蛋白酶0.1255g。
斑马鱼氧化应激模型优化及药根碱抗lps介导的氧化应激机制研究
目录摘要 (I)Abstract (III)第1章文献综述 (1)1.1氧化胁迫概述 (1)1.2活性氧自由基的分类 (1)1.3 ROS的主要来源 (2)1.4氧自由基的危害方式 (2)1.5氧化胁迫的引发因素 (3)1.6氧化胁迫与疾病 (4)1.7氧化胁迫的控制与干预 (5)1.8天然植物性抗氧化剂的开发利用 (6)1.9黄连在氧化应激方面的研究 (7)1.10氧化胁迫造模方法研究现状 (8)1.11本课题研究的可行性论证 (9)第2章引言 (11)2.1 研究目的和意义 (11)2.2 研究内容 (11)第3章斑马鱼氧化胁迫模型的建立 (13)3.1 前言 (13)3.2实验材料和仪器 (13)3.3方法 (14)3.4统计分析 (15)3.5 实验结果 (15)3.6小结与讨论 (18)第4章药根碱对LPS诱导的斑马鱼胚胎体内抗氧化作用 (19)4.0前言 (19)4.1 实验材料和仪器 (19)4.2 实验方法 (19)4.3 数据分析 (21)4.4 实验结果 (21)4.5 小结与讨论 (25)第5章药根碱斑马鱼成鱼抗氧化活性研究 (27)5.2实验材料和仪器 (27)5.3 实验方法 (28)5.4 统计分析 (29)5.5 实验结果 (29)5.6 小结与讨论 (30)第6章药根碱对HepG2细胞的抗氧化应激作用机制研究 (33)6.1 实验材料和仪器 (33)6.2 实验方法 (34)6.4实验结果 (38)6.5 小结与讨论 (40)结论与展望 (41)参考文献 (43)中英文缩略名词对照表 (49)致谢 (51)摘要斑马鱼氧化应激模型优化及药根碱抗LPS 介导的氧化应激机制研究专业生物化学与分子生物学学硕士研究生韩玉龙指导老师叶小利教授摘要氧化应激是指机体在遭受各种刺激时，体内高活性分子如活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）过量产生，超出机体的清除能力，致氧化和抗氧化状态失去平衡，进而引起组织氧化损伤。
Cd、Cr（Ⅵ）及复合污染对鲫鱼组织脂质过氧化的影响
浙江大学学报!农业与生命科学版"#$!%"&%#’(%#)*#++%,-./012-345678109:08;6/<8=>!?@A B C D EF B G H I C BD "收稿日期&#++#J K #J #%基金项目&浙江省教育厅资助项目!#++#L MN ++O "P 作者简介&贾秀英*女!K $Q Q R"*浙江义乌人*副教授*主要从事动物生态毒理研究*S J T U B V &W X Y B U ZK Q %D C [T P文章编号&K ++)J $#+$!#++%"+%J +%#’J +\]^_]/!‘"及复合污染对鲫鱼组织脂质过氧化的影响贾秀英*董爱华!浙江杭州师范学院生命科学学院*浙江杭州%K ++%Q "摘要&采用动物实验方法*研究了a b _a A !c"及其复合污染对鲫鱼组织谷胱甘肽!d I e "和丙二醛!Mf ?"含量的影响g 结果显示&低剂量的a b 对鲫鱼肝_肾d I e 有明显的诱导作用*而高剂量的a b _a A !c"则使肝_肾组织的d I e 含量明显降低h 肝_肾Mf ?含量在各处理组均高于对照*尤其是高剂量a b _a A !c"组的肝_肾Mf ?水平均显著高于对照h a b _a A !c"复合污染在d I e _Mf ?水平上表现为协同关系g 说明a b _a A !c"及其复合污染能引起鲫鱼组织脂质过氧化损伤g 脂质过氧化作用因组织和重金属离子而异*在肝脏中*脂质过氧化作用顺序为混合重金属离子i a A !c"i a bh 在肾脏中*脂质过氧化作用顺序为a b i 混合重金属离子i a A !c"g 关键词&镉h 铬h 复合污染h 脂质过氧化h 谷胱甘肽h 丙二醛中图分类号&W K O \文献标识码&?Y j ?W B k J l B m @*f n N d ?B J o k U !p q r s s t s uv w u x p q w x y q x z *{|y }~r s !"s #$|t q s t t x }x *{|y }~r s !%K ++%Q *%r w y |"&336’=<-3]^_]/!‘"<8092610^’-()806^*-22.=8-0-0+8*8^*6/-,8^1=8-080-./012.02.3P Y [k A m U V [G L o H 4B U m @5m B 6H A 7B 8l !?@A B C D EF B G H I C BD "*#++%*#$!%"&%#’J %#)9)<=/1’=&57B m @8o H T H 8o [b [G U m B T U V H :;H A B T H m 8*8o H H G G H C 87[G a b *a A !c"7B m @V H U m b C [T <B m H b ;[V V k J 8B [m[m 8o H T U V [m b B U V b H o l b H !Mf ?"U m b@V k 8U 8o B [m H !d I e "C [m 8H m 8[G a A U C B U mC U A ;!a U A U 77B k 7U k A U 8k 7"=H A H[<7H A 6H b P >o H A H 7k V 877o [=H b 8o U 88o H U T [k m 8[G 8o H d I e C [m 8H m 8B mV B 6H A U m b ?B b m H l =H A H H V H 6U 8J H bB m 8o H V [=a bC [m C H m 8A U 8B [m@A [k ;!+P %T @@F "*<k 8d I e C [m 8H m 8=U 77B @m B G B C U m 8V l V [=H A B m 8o H o B @o J b [7H @A [k ;7[G a b *a A !c"!%P +T @@F "8o U m 8o H C [m 8A [V @A [k ;P n m 8o H [8o H A o U m b *Mf ?V H 6H V 7B mV B 6J H A U m b ?B b m H l =H A H 7B @m B G B C U m 8V lo B @o H A B m 8o H o B @o J b [7H @A [k ;[G a b *a A !c"8o U m 8o U 8B mC [m 8A [V P >o H d I e U m b Mf ?V H 6H V 7[G C [T <B m H b ;[V V k 8B [m 7o [=H b 7l m H A @B 78B C H G G H C 8P a [T ;U A B 7[m[G H :8H m 8[G V B ;[C 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#(驯养期间自然死亡率低于0<M!取个体大小一致的鲫鱼随机放入各处理组的水族箱%:<>?NK <>?NK <>?’内(实验水体为:K O (每组放鱼0:尾!"#)"$%&’单一及复合处理共P 个组合%表0’!在室温和静水条件下驯养(Q ,为H2K (水温为%0:;<2=’R(试验期间不间断充气!为减少实验中的误差(实验期间停止喂食!12A 2A 采样及测定在染毒后的第S #(解剖取鱼的肝)肾组织各<2C @(加入0?OT $U VW ,"B %Q ,H 2K ’缓冲液(研磨成匀浆(在KR K <<<$X ?U Y 下离心0<?U Y(去除组织和细胞碎片(取上清液(于ZC <R 保存(待测!*+,含量的测定采用.T [\法]:^(-./含量的测定采用T \/法]H ^(用考马斯亮兰染料结合法测定蛋白!表1_‘)_a%b’各处理的实验设计T c d B e 0f g Q e $U ?e Y h c B #e V U @Yi j "#c Y #"$%&’h $e c h ?e Y h V@X O"$%&’"#<<k l l k <<<m<<k l m<l k <m<<k l <m<k l <k l m<k l l k <m<k l l k <<ml k <<k l ml k <l k <ml k <C 结果与分析A 21_‘和_a %b’对鲫鱼肝)肾组织n o p 和qr s 含量的影响从表C 可以看出(不同剂量的"#)"$%&’对鲫鱼肝)肾组织*+,含量的影响有较大的差异!在低"#组中(*+,含量显著升高%t u <2<=’(而高"#组中(*+,含量则显著降低%t u <2<=’J 在低"$%&’中(*+,含量升高(但与对照相比不存在显著性差异(在高"$%&’组中(*+,含量则显著降低%t u<2<=’!表A 鲫鱼各脏器组织n o p 和qr s 含量%v ;w’T c d B e C T L e >i Y >e Y h $c h U i Y V i j @B x h c h L U i Y e c Y #?c B i Y #$c B #e L y #eU Yh U V V x e V i j 3454667864854986z ?i BX @组别X@D OZ 0{肝胰脏*+,-./肾脏*+,-./对照组0K 02C C ;<2C <020S ;<2C K 02C 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+,+/.3由此可见!&’"&1(2.复合污染也能引起鲫鱼组织脂质过氧化作用!&’"&1(2.表现为一定的协同关系3进一步比较单独重金属离子和混合重金属离子对鲫鱼组织的脂质过氧化作用的大小发现!对肝脏而言!混合后!脂质过氧化作用增强了!脂质过氧化作用依大小顺序为混合重金属离子4&1(2.4&’3在肾脏中!脂质过氧化作用的顺序则为&’4混合重金属离子4&1(2.3表@复合污染下鲫鱼各脏器组织678和9:;含量(A B C.D E F G H<D I H J K L J H L M1E M N K L O K P Q G R M E M I N K L H E L’S E G K L’1E G’H I T’H N LJ K S F N L H’U K G G R M N K LN LM N O O R H O K P V W X W Y Y Z[Y W[X W\[Y]S K G^Q组别^ S Q_‘a/b肝胰脏=>?#$%肾脏=>?#$%对照组/c/d e e B+d e+/d/f B+d e c/d e/B+d/f+d g h B+d/f +d<&’i+d<&1(2./c/d f<B+d c e j/d<g B+d<+/d k c B+d-f j/d+e B+d e e +d<&’i<d+&1(2./c/d+<B+d e h/d f h B+d c h j/d/e B+d<f/d c f B+d e f j <d+&’i+d<&1(2./c+d g h B+d/c j e d/e B+d<f j+d h c B+d/c j/d h k B+d<f j j <d+&’i<d+&1(2./c+d-e B+d/e j j e d f-B+d-h j j+d c f B+d/h j j/d k c B+d-e j j<讨论所谓脂质过氧化(‘N U N’U H1K l N’E M N K L!‘m.是指活性氧"自由基攻击生物膜中多聚不饱和脂肪酸(m n o%.而引起的一系列氧化过程!此过程可产生一系列脂质过氧化物(‘m p.!而#$%是自由基引发的脂质过氧化作用的最终分解产物!其含量可间接反映机体的‘m水平3测定结果显示!在单一的低&’浓度暴露下! =>?含量显著升高!而#$%含量增加不显著!即脂质过氧化作用不明显0但随着&’"&1(2.染毒浓度的升高!#$%含量明显增加!而=>?含量却相应减少!说明一定浓度的重金属&’"&1(2.能引起鲫鱼组织脂质过氧化损伤0而#$%含量和=>?含量变化的负相关性提示这种损伤可能与=>?含量的减少有关3 =>?是一种低分子自由基清除剂!它可清除p e q"?e p e"r p p?!是组织中重要的巯基非蛋白质化合物!在解毒代谢中起着非常重要的作用s f!k t3缺乏或耗竭=>?会促使许多化学物或环境因素产生中毒作用或加重其中毒作用!破坏机体的氧化平衡状态!从而引起氧化应激!而氧化应激会进一步引起脂质过氧化"巯基耗竭ge<第<期贾秀英!董爱华&’"&1(2.及复合污染对鲫鱼组织脂质过氧化的影响万方数据等氧化性损伤!当然"脂质过氧化作用有链式反应的特点"仅通过#$%&’()含量的变化不可能把*+&*,-./及其复合污染诱导的脂质过氧化机制完全搞清楚"因此"还有必要对其它的抗氧化酶类和其它抗氧化物质含量做进一步研究!在*+&*,-./复合污染暴露下"鱼肝&肾组织的#$%&’()含量变化趋势与单一的*+&*,-./基本一致"*+&*,-./表现为一定的协同关系!比较单一的*+&*,-./和复合重金属离子对鲫鱼肝&肾脂质过氧化作用的大小可以发现"单一的*+&*,-./与复合污染对鱼不同组织的脂质过氧化作用不同"在肝脏中"脂质过氧化作用的顺序为混合重金属离子0*,-./ 0*+!在肾脏中"脂质过氧化作用的顺序为*+ 0混合重金属离子0*,-./!究其原因可能与重金属离子在组织内的积累有关!123242562789:;*<=>?@,A BC D"#E,@F G#)"H<I A,E G J A<KLM N O P Q N R S R T P Q<K I A E+&U F G J E G+*E+V F=V F GK E J@<,F J E I J<V WX F G E@F<G9D;Y Z[\]^_T R N":‘a b"b:8:c a W:d c Y9e;U)%f(?<=W J?A G>-赵守城/Y*<V X F G A+H<g F JA K K A J@h <K*E+V F=V E G+*?,<V F=V<G@?A i E@A,j I A E h-k R]^S l Rm R n S R/Y o^l S Rp P q N l O^[R N T^-中国公共卫生/"e r r r":s-d/8c:c W c:a Y-F G*?F G A h A/9t;u v w*?E G>W K E"H%f(?="u f x’%F W V F G"[T R N-刘长法"陶澍"龙爱民Y等/Y%J J=V=I E@F<G h<K u A E+E G+*E+V F=V F G’<I+K F h?9D;"o R y R Q Q l P Q R P y R T P Q z O T RL_W{y M q l M N M n l O R|l S l O R-水生生物学报/"e r r:"e d-c/8t c c Wt c‘Y-F G*?F G A h A/9c;u v x}=W?=E"u w D F E G W V F G"u v%x’U?F W I<G>"[T R N-蔺玉华"卢建民"梁智龙"等/Y H<g F JA K K A J@h<K*?,<V F W=V<GA V X,B,<h+A~A I<!V A G@E G+j,F A h F G"y R Q Q o R y]QE G+o M m m M So R y]Q9D;Y o^l S[Q[#M P y S R N M$%l Q^[y l[Q-水产学杂志/"e r r r":t-e/8t e W t d Y-F G*?F G A h A/9d;*E G I F#"j=,G A h h&’Y#A,J=,BE G+J E+V F=V=!@E(A K,<V h A E i E I@A,E G+K,<V K<<+X B@?Ax<,i E BI<X h@A,Z[]^y M]Q S M y)[n l O P Q9D;Y*S)l y M S m[S T R N+M,l O M N M n_R S{o^[m l Q T y_":‘‘d":c-d/8b:‘W b e b Y9s;-<B G A%j".I I V E G’u Y%V A@?<+<I<>BK<,E G E I B h F h <K@F h h=Ah=I K?B+,B I J<V!<G A G@h9D;Y z S R N/l M O^[m":‘a e"c s-e/8s t‘W s d t Y9a;(E@<?0Y#A@?<+<K u F!F+!A,<g F+E@F<G$A@A V F G E@F<GF G Y(A,=V*I F G F J E*?F V F J E%J@E:‘a b1‘r8t a Y9b;0I E E h h A G*$"-,E J(A G’#"$=+I A B&."[T R N Y&<I A <Kh=I K?B+,B I hF G@?A?A!E@<@<g F J F@B<K<,>E G F JE G+V A@E I I F J J<V!<=G+h9D;Y%P S{R m z]]N+M,l O M N":‘b d"d8b r s W b:d Y9‘;&A A+$D Y’I=@E@?F<G A8@<g F J<I<>F J E I F V!I F J E@F<G h9D;Y z S S P2[)p^R y m R O M N+M,l O M N":‘‘r"t r8s r t W s t:Ybet浙江大学学报-农业与生命科学版/第e‘卷万方数据Cd、Cr(Ⅵ)及复合污染对鲫鱼组织脂质过氧化的影响作者：贾秀英， 董爱华作者单位：浙江杭州师范学院,生命科学学院,浙江,杭州,310036刊名：浙江大学学报(农业与生命科学版)英文刊名：JOURNAL OF ZHEJIANG UNIVERSITY(AGRICULTURE & LIFE SCIENCES)年，卷(期)：2003,29(3)被引用次数：15次1.Coughtrey P J;Martin M H Tolerance of Holcus lanatus of lead、 Zinc and Cadmium in factorical combination 19782.赵守城Combined Toxic effects of Cadmium and Chromium on the water Fleas (Daphnia magna) [期刊论文]-中国公共卫生 2000(05)3.LIU Chang fa;TAO Shu;LONG Ai min Accumulations of Lead and Cadmium in Goldfish[期刊论文] -水生生物学报 2001(04)4.LIN Yu hua;LU Jian min;LIANG Zhi long铬对鲤、草鱼胚胎发育及鱼苗的毒性影响[期刊论文]-水产学杂志 2000(02)5.Canli M;Furness R W Mercury 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JIANG hui.ZHAO Zhen-yu.GAO Xi-wu溴氰菊酯对麦穗鱼谷胱甘肽S-转移酶(GSTs)的影响[期刊论文]-农药学学报2005,7(3)5.赵扬.王云.左正宏.陈奕欣.王重刚.ZHAO Yang.WANG Yun.ZUO Zheng-hong.CHEN Yi-xin.WANG Chong-gang三丁基锡(TBT)对褐菖鲉肝脏抗氧化系统的影响[期刊论文]-厦门大学学报（自然科学版）2008,47(5)6.冯涛.郑微云.陈荣.FENG Tao.ZHENG Wei-yun.CHEN Rong苯并(a)芘对大弹涂鱼肝脏和卵巢还原型谷胱甘肽 含量影响的比较研究[期刊论文]-海洋环境科学2001,20(1)7.徐文菊.李远友.夏小安.王树启.吴清洋.徐树德.XU Wen-ju.LI Yuan-you.XIA Xiao-an.WANG Shu-qi .WU Qing-yang.XU Shu-de三丁基锡和菲对鳗鲡的毒性效应[期刊论文]-生态毒理学报2010,05(2)8.刘慧.王晓蓉.张景飞.沈骅铜及其配合物对鲫鱼肝脏谷胱甘肽的影响[期刊论文]-南京大学学报(自然科学版)2004,40(3)9.吴晓霞.吴进才.金银根.董波.王荣生除草剂对水生植物的生理生态效应[期刊论文]-生态学报2004,24(9)10.刘连平.聂芳红.孔庆波.林红英.谢英明.杨蓉.陈进军.LIU Lian-ping.NIE Fang-hong.KONG Qing-bo.LIN Hong-ying.XIE Ying-ming.YANG Rong.CHEN Jin-jun TCDD对斑马鱼脂质过氧化作用的初步研究[期刊论文]-广东海洋大学学报2008,28(1)1.张朝晖.王婧.李程.黄炼.张天成镉对红鲫组织超氧化物歧化酶活性的影响[期刊论文]-南华大学学报(医学版) 2009(6)2.彭小伟.欧阳玉祝.曹建兵.邓小东添加剂对锰渣中铬离子浸取的影响[期刊论文]-吉首大学学报（自然科学版） 2007(2)3.侯建军.张清顺.熊邦喜.邹桂伟二价镉对梨形环棱螺毒理效应的研究[期刊论文]-中国农业大学学报2009(3)4.南旭阳Cu2+对鲫鱼体内Zn2+和血红蛋白含量影响[期刊论文]-中国公共卫生 2006(1)5.胡南.张新华.黄爱武.王永东.李广悦.郑济芳.丁德馨铀尾矿浸出液对斑马鱼组织某些生化指标的研究[期刊论文]-毒理学杂志 2008(3)6.吴国星.高熹.叶恭银.胡萃.程家安镉和铜离子诱导棕尾别麻蝇幼虫脂质过氧化丙二醛动态变化分析[期刊论文]-环境昆虫学报 2008(2)7.谭树华.何典翼.严芳.梁芳亚硝酸钠对鲫鱼肝脏丙二醛含量和总抗氧化能力的影响[期刊论文]-农业环境科学学报 2005(z1)8.吴志刚.沈洪艳.杨枭.武晨虹.张国霞.李志勇二甲苯对锦鲤肝脏丙二醛含量和总抗氧化能力的影响[期刊论文]-江苏农业科学 2013(2)9.朱慧文.张崇禧.马博谦.王久林.王超.林文洋.孙晓东中药复方制剂对锦鲤生长、体色及若干生理生化指标的影响研究[期刊论文]-淡水渔业 2011(3)10.吴国星棕尾别麻蝇对重金属的反应及适应机制的研究[学位论文]博士 200511.耿晓修.丁诗华.孙翰昌.廖品福.张涛六价铬对草鱼肝脏SOD和GSH-Px活力的影响[期刊论文]-西南农业大学学报（自然科学版） 2006(2)12.高静.牛亚青.胡南.耿芳.田鹤锋.郑济芳.丁德馨硫酸锰废渣浸出液对斑马鱼的毒性及抗氧化酶活性的影响[期刊论文]-生态毒理学报 2011(4)13.张育平.孙鸽.王跃.杨慧敏.李丽君.马恩波.郭亚平重金属镉和铬在中华稻蝗(Oxya chinensis)体内的组织分布[期刊论文]-农业环境科学学报 2011(12)。
程辉辉 实验报告2：鱼类应激生理指标的测定
实验报告2：鱼类应激生理指标的测定学号No.：2014308110001 姓名Name：程辉辉日期Date：2015.3.7摘要：在鱼类养殖过程中存在很多环境刺激因子，如温度、PH、拉网、运输等都会引起鱼类应激反应。
而作为环境刺激因子对鱼体应激反应的直观反映，皮质醇和血糖是最灵敏的指标。
在本实验中，我们主要通过探究处于应激状态下鲫鱼皮质醇和血糖的变化，从而直观认识鱼类应激现象。
实验中测定的皮质醇额含量水平为403.56ng/ml，血糖水平为14.49mmol/l，可以看出，鱼体已经出现了较高的应激水平（于淼，2008）。
本实验通过皮质醇和葡萄糖含量水平评估鱼类应激从而正确理解和认识鱼类应激的发生及危害，并可以此对其进行及时有效地监测，找到产生应激的根源，为水产养殖的鱼类健康养殖、鱼病诊断等提供技术支持。
关键词：应激、血糖、皮质醇【前言】鱼类的应激反应是鱼体对各种环境因子的超常刺激所产生的一种非特异性生理反应。
没有应激反应，动物机体就不能适应任何超出一般生理调节范围的环境变化。
但是，过强的或过长的应激反应会对机体产生危害，导致生长发育缓慢、繁殖能力下降、免疫机能低下及发病率和死亡率提高等。
养殖鱼类，特别是集约化养殖的鱼类，不仅会遭受各种天然应激因子的作用，还会遭受许多人为应激因子的刺激。
因此，正确分析和评价生产中各种应激因子对养殖鱼类的影响，对科学地管理和减少生产中应激反应的危害具有十分重要的指导意义应激反应中能量代谢上的改变突出表现为血糖含量的持续升高，其幅度也与应激程度成正相关。
由于鱼类应激时血糖升高的时效比血浆皮质醇更迟缓，也更容易测定，因此血糖也被广泛用作监测和量化鱼类应激反应的指标。
血清中葡萄糖在葡萄糖氧化酶的作用下生成葡萄糖酸和过氧化氢。
过氧化氢和4-氨基安替吡啉、酚在过氧化物酶催化下生成红色醌亚胺。
醌亚胺的最大吸收峰在500NM左右，吸光度的变化与样本中的葡萄糖浓度成正比。
血浆皮质醇被更广泛地用于鱼类应激反应的监测和评价中，一是由于几乎所有的应激因子都能激活HPI轴，使血浆皮质醇水平迅速升高，其幅度及持续时间与应激因子的强度及作用时间呈正相关；二是因为血浆CA变化的迅即与短暂特性给测定工作带来了一定的困难，而血浆皮质醇则相对易于测定；三是血浆皮质醇含量的持续升高对鱼类的生长、繁殖与免疫机能有重要影响，因此与养殖生产密切相关。
鱼夋鱼幼鱼肝脏和肌肉氧化应激指标对溶解氧含量变动的响应
鱼夋鱼幼鱼肝脏和肌肉氧化应激指标对溶解氧含量变动的响应刘旭佳;黄国强;李洁;唐夏【摘要】研究了4种溶氧变动模式条件下，鱼夋鱼幼鱼肝脏和肌肉氧化应激指标的变化。
试验结果表明，在“近饱和稳定”模式下，鱼体肝脏中氧化应激指标含量的变动比较一致，具有一定的变动节律，且肌肉中的大部分氧化应激指标高于肝脏。
与“近饱和稳定”模式相比，“近饱和→最低溶氧”模式下肝脏大部分氧化应激指标显著升高，而肌肉中相应指标则明显下降。
“近饱和→超饱和→近饱和→最低”模式肝脏的主要氧化应激指标变动的时间节律与“近饱和稳定”模式明显不同，并在次日溶解氧含量下降至最低值1．0mg／L时，抗氧化指标的含量有所回升。
“超饱和→近饱和→近饱和恢复24h”模式下，肌肉中所有氧化应激指标与“近饱和稳定”模式相比均明显下降，并且变动节律与溶解氧含量的变动模式一致。
在经历超饱和溶氧暴露后恢复24 h处理后，肝脏的抗氧化指标，只有总抗氧化能力最高值出现在溶氧超饱和期间，超氧化物歧化酶和抗超氧阴离子活力的最高值出现在溶氧降低至近饱和水平后的恢复阶段，肌肉中的抗氧化指标最高值则均出现在恢复阶段。
溶解氧含量变动环境中，鱼的氧化应激指标与溶氧稳定的环境中相比在数值和变动节律上均出现变化，并表现出在溶解氧含量下降时储备抗氧化物质的现象。
%The changes in oxidative stress indicators were studied in liver and muscle of the juvenile mullet Liza haematocheila under four patterns of dissolved oxygen levels .The results showed that the variation in oxidative stress indicators was consistent and rhythmical in liver ,lower than in muscle in the pattern nearly constantly saturated with dissolvedoxygen .Most of the oxidative stress indicators were found to be increased significantly in liver in the pattern from nearly saturated to the minimumvalue of dissolve d oxy‐gen ,but the opposite case in the muscle .There was significantly difference in rhythm of the oxidative stress indicators in liver under the pattern from nearly saturated ,super‐saturated ,and nearly saturated to minimum value of dissolved oxygen compared with that in the pattern of saturated dissolved oxygen .How‐ever ,the level of the oxidative stress indicators was found to be increased on the next day when the content of the dissolved oxygen was reduced to 1 .0 mg/L .In the pattern from over‐satur ation ,nearly saturation to recovery from nearly saturation ,the content of oxidative stress indicators in muscle was declined sharply compared to the pattern of nearly saturated dissolved oxygen ,with the consistent change in rhythm with the content ofdi ssolved oxygen .The maximal value of T‐AOC was observed in the supersaturated period , and the maximal SOD and T‐SOD activities in liver were found in the 24 h recovery stage after the nearly saturated period .In the muscle ,however ,the maximum value of all the oxidative stress indicators was ob‐served in the recovery stage .The findings indicated that the oxidative stress indicators in different pattern showed different dissolved oxygen contents and rhythm compared to the normal dissolved oxygen condi‐tio n .T he mullet had positive response to the variation in dissolved oxygen patterns and maintained antiox‐idant substance during the lower dissolved oxygen level period .【期刊名称】《水产科学》【年(卷),期】2014(000)006【总页数】6页(P344-349)【关键词】鱼;溶氧;缺氧;氧化应激;抗氧化【作者】刘旭佳;黄国强;李洁;唐夏【作者单位】广西海洋研究所海洋生物技术重点实验室，广西北海 536000;广西海洋研究所海洋生物技术重点实验室，广西北海536000; 中国海洋大学水产学院，山东青岛 266003;中国海洋大学水产学院，山东青岛 266003;中国海洋大学水产学院，山东青岛 266003【正文语种】中文【中图分类】S965.234鱼(Liza haematocheila)在我国沿海均有分布[1]，具有广盐性、广温性、适应性强、生长迅速、病害少等特点，是一种优良的养殖对象[2]。
池养黄颡鱼运输应激后在实验循环系统中的恢复和适应过程
池养黄颡鱼运输应激后在实验循环系统中的恢复和适应过程刘小玲;严安生【期刊名称】《水产学报》【年(卷),期】2006(30)4【摘要】本文将土池养殖的黄颡鱼成鱼运往室内实验循环系统驯养,并对鱼的摄食及鱼对日常管理活动的反应、血液皮质醇和血糖、外周血红细胞数量、外周血白细胞百分比和吞噬功能进行了35 d的观察或监测.运输后的黄颡鱼在最初4～7 d内,明显的行为变化是停止摄食.所有的鱼从第8天开始恢复了摄食,从第15天开始适应了日常管理活动.血液皮质醇和血糖浓度在刚刚运抵实验循环系统(0 d)及驯养1、2、3 d的鱼体内显著升高,至第7天已显著下降,并在第21、28、35天稳定在低水平上.外周血红细胞数量没有显著变化.与第21、28、35天外周血白细胞的各参数值相比,淋巴细胞百分比在第3、7天显著减少,嗜中粒细胞百分比在0、1、2、3天显著升高,吞噬细胞吞噬百分比和吞噬指数在第7、14天显著降低.以上结果显示(1)运输使黄颡鱼成鱼产生典型的应激反应,(2)运输应激导致黄颡鱼成鱼外周血淋巴细胞和嗜中粒细胞百分比的显著改变和外周血白细胞吞噬功能的抑制,(3)运输应激后的池养黄颡鱼成鱼在本文使用的实验循环系统中充分恢复和驯化所需的最少时间是3周.%Earth-pond-reared adult yellow catfish (Pelteobagrus fulvidraco R.) were transported to the indoor laboratory recycle system. Feeding and responsiveness to daily management, blood cortisol and glucose, percentage and phagocytic function of circulating leukocytes of the fish were monitored immediately after transport (day 0) and in acclimatization of the laboratory system for a period of 35 days. Cessation of feeding wasapparent during the first 4 to 7 days after transport. All fish resumed feeding by day 8 and adapted to daily management by day 15. Blood cortisol and glucose concentrations were significantly high at day 0, 1, 2 and 3. Elevated blood cortisol and glucose significantly decreased by day 7 and maintained at low levels at day 21, 28 and 35. No significant differences were found in circulating erythrocyte numbers. Compared to values of each parameter for circulating leukocytes at day 21, 28 and 35, lymphocytopenia was found at day 3 and 7, neutrophilia was detected at day 0, 1, 2 and 3, significantly decreased phagocytosis and phagocytic index of peripheral leukocytes were found at day 7 and 14. The results of the present study indicate (1) that transport induced characteristic stress responses in the adult yellow catfish, (2) that transport resulted in significant alterations in the percentage of circulating lymphocytes and neutrophils and suppression in the phagocytic function of circulating leukocytes in the adult yellow catfish, (3) that a minimum of three weeks needed for the earth-pond-reared adult yellow catfish to completely recover from transport stress in acclimatization of the laboratory system.【总页数】7页(P495-501)【作者】刘小玲;严安生【作者单位】华中农业大学水产学院,湖北,武汉,430070;华中农业大学水产学院,湖北,武汉,430070【正文语种】中文【中图分类】S917;S962.3+9【相关文献】1.水产学其他学科——池养黄颡鱼运输应激后在实验循环系统中的恢复和适应过程[J], 刘小玲;严安生2.实验动物应激后氧化应激状态监测方法的进展 [J], 曾宪成;马璟;常艳;刘全海3.猪应激性状QTL微卫星标记与运输应激后肉质性状关系的研究 [J], 王晓娜;汪秀星;赵茹茜;刘香;薛春阳;陈杰4.抗应激添加剂对运输后肉牛应激蛋白mRNA和蛋白表达水平的影响 [J], 曹中赞; 王晓娜; 李静; 陈美月; 许建文; 栾新红5.YCJ-001菌株对黄颡鱼养殖中水质、成活率、生长速度和抗应激能力的影响 [J], 夏露;高贤涛因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
鱼类对金属和类金属氧化应激反应研究进展
鱼类对金属和类金属氧化应激反应研究进展
翁善钢
【期刊名称】《水产科技情报》
【年(卷),期】2012(39)5
【摘要】水环境中的金属污染可以引起水生生物的氧化应激反应,有多种金属同鱼类的氧化应激有关.文章综述了近年来研究最多的几种金属(铁,铜,铬,汞和铅)以及类金属(砷,硒)同鱼类氧化应激的关系.
【总页数】5页(P258-262)
【作者】翁善钢
【作者单位】外高桥出入境检验检疫局,上海200137
【正文语种】中文
【相关文献】
1.重金属暴露引起鱼体氧化应激反应的研究进展 [J], 罗其勇
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3.金属离子在液相氧化中的催化作用Ⅰ.乙苯液相氧化s-，d-，f-类金属离子的催化作用 [J], 叶兴凯;韩富荣;张素贤;吴越
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实验单元3：鱼类氧化应激指标的测定
学号No.：2014308110001 姓名Name：程辉辉日期Date：2015.3.21
摘要：鱼体在受到外界刺激的时候，组织或细胞内氧自由基生成增加，清除能力降低，导致活性氧在组织或细胞内蓄积而引起氧化损伤。
而活性氧的逐步产生可以导致蛋白质和脂质的氧化。
蛋白质羰基化是指蛋白质侧链氨基酸被氧化修饰后，羰基产物积累，蛋白质功能丧失甚至被降解。
而衡量脂质过氧化的指标便是丙二醛，其是脂质过氧化物的最终分解产物之一，常作为脂类过氧化的测定指标。
在本实验中，我们主要探究了脂质过氧化和蛋白羰基化的测定方法，以便更好的定量衡量氧化应激的程度。
实验中所测得的肌肉蛋白质羰基含量为727.92 nmol/mg prot，肝脏蛋白质羰基含量为1142.41 nmol/mg prot，肌肉MDA含量为0.011 nmol/mg prot，肝脏MDA 含量为0.14 nmol/mg prot，相比其他的实验，所测定结果相差较大。
在实验中存在诸多操作失误，希望能在以后的实验中引以为戒，为实验室条件下对鱼类的氧化应激水平奠定实验和操作基础。
关键词：应激；蛋白质定量；蛋白质羰基化；脂质过氧化
【前言】
随着集约化养殖的发展，鱼类在养殖过程中遭受到的应激因素日益增多。
人为活动、外界环境的变化、饵料和水体中的有害物质均会对鱼体产生应激。
氧化应激反应是有氧生物不可避免的，它是生物体的活性氧簇( reactive oxygen species，ROS)和抗氧化防御系统之间不平衡的结果。
ROS是过渡金属离子、农药、石油污染物等物质诱导产生的。
自由基是正常细胞新陈代谢过程中由内源性细胞产生的。
线粒体呼吸是ROS 主要的内源性来源（李学彬，2009）。
ROS 的逐步产生可以导致蛋白质和脂质的氧化，基因表达的改变以及细胞氧化还原状态的变化。
在生物体内，很多脂类含有多不饱和脂肪酸。
不饱和脂肪酸双键电子云密度大，化学性质很不稳定，很易受到过氧化作用损伤，产生有细胞毒性的脂质过氧化物。
这些化合物能破坏人体细胞正常生理功能，促使人体衰老和诱发癌症。
丙二醛（MDA）是脂质过氧化物的最终分解产物之一，常作为脂类过氧化的测定指标，其含量能直接反映机体脂质过氧化程度，并间接反映细胞损伤程度（刘淑兰，2012）。
脂质过氧化的测定通常是通过TBA试验来完成的，其主要应用于食品和生物材料中脂类氧化检测和定量。
硫代巴比妥酸法是基于不饱和脂肪酸通过自由基反应，形成氧化自由基而氧化生成环氧化合物，环氧化合物分解生成丙二醛（MDA），MDA 与硫代巴比妥酸（TBA）作用生成TBA染料配合物，此化合物在532nm 下有最大吸收值。
通常测试结果表示为532nm下吸光值与丙二醛吸光系数之积，即通常所说TBA值。
蛋白质羰基化是指蛋白质侧链氨基酸被氧化修饰后，羰基产物积累，蛋白质功能丧失甚至被降解。
蛋白质羰基含量是蛋白质氧化损伤的敏感指标。
蛋白质羰基在体内的形成主要是通过金属离子催化氧化系统（MCO系统)完成的。
在这个过程中，Fe2+和Cu2+可以结合在蛋白质的阳离子结合位点。
被H2O2或O2攻击之后将侧链含有氨基的氨基酸羰基化（曹溪青，1985）。
此外, 羟自由基也可直接作用于肽链, 使肽链断裂, 引起蛋白质一级结构的破坏, 在断裂处产生羰基。
目前，大量的研究证明了氧化损伤与衰老和疾病的关系。
实验中采用的蛋白质羰基化的测定方法是2, 4 -二硝基苯肼（DNPH)比色法，这
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是一种是测定蛋白质羰基含量的经典方法。
被氧化后的蛋白质羰基含量增多，羰基可与2,4-二硝基苯肼（DNPH ）反应生成红棕色沉淀2,4-二硝基苯腙，将沉淀用盐酸胍溶解后即可读取370nm 下的吸光度值，从而测定蛋白质的羰基含量。
【材料与方法】
选取均重200g 左右的鲫鱼，解剖鱼体，暴露内脏，切离部分肝脏和肌肉组织，然后将其转入玻璃匀浆器中，按照1:9（W/V ）比例加入PBS （匀浆介质），充分研磨均匀，制成组织匀浆液（冰水浴中进行）。
1.匀浆蛋白浓度测定
取约0.5g 组织样品，以1:9比例加入PBS 进行研磨得到组织匀浆。
取组织匀浆
上清稀释十倍后用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度。
2.脂质过氧化测定
• 将MDA 标准品浓度（10 nmol/mL ）稀释到0,1,2.5,5,7.5,10 nmol/mL ；
• 取0.2 mL 稀释40倍的未离心的匀浆液和不同浓度的MDA 标准品，分别与0.8 mL 的0.53% TBA 混匀，于95℃孵育60 min ，4℃15000 g 离心15 min ，取上清，测定532 nm 处的吸光值（一定要保证管口的密封性）
• 以MDA 浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线，得到MDA 浓度与吸光值关系的公式。
• 以样品吸光值带入上述公式，计算样品中的MDA 浓度为C MDA （nmol/mL ） • 组织中MDA 含量（nmol/mg prot ）=[C MDA (nmol/mL)]/[Protein mg/ml]
3.组织蛋白质羰基化测定
• 取稀释后的上清50μL ，在上清中加入50μL 的10mmol/L 的DNPH 作为试验管，另取稀释后上清50μL ，加入50μL 的2.5mmol/L 的HCI 作为空白管。
• 将各管置于冰盒中避光放置1h ，每隔15min 涡旋振荡混匀一次。
• 反应完后加入25μL 50%（W/V ）的三氯乙酸（TCA ）溶液来沉淀蛋白质衍生物，4℃ 12000g 离心15min ，弃上清。
沉淀用200μL 乙醇和乙酸乙酯的混合物（V ：V=1:1）洗涤（4℃ 12000g 离心15min ），最后沉淀用400μL6mol/L 盐酸胍溶解（37℃，15min ）。
之后于12000g 离心15min ，取上清，测定370nm 处吸光值。
• 计算：羰基浓度（nmol/mL ）=[CA/22000]×106×(V final / V sample )
• CA=实验组吸光值-对照组吸光值
V final 是指终体系的体积；V sample 是指所加入的样品体积
蛋白质浓度（nmol/mg protein ）=(Carbonyl nmol/ml)/(Protein mg/ml)
【实验结果与分析】
1.匀浆蛋白浓度的测定结果
羰基MDA
肝脏肌肉肝脏肌肉OD值0.5337 0.4809 0.51685 0.5744
蛋白浓度(mg/ml)46.95 22.48 39.14 65.82 根据以上标准曲线，本组所测定的蛋白质羰基测定过程中肝脏蛋白浓度为46.95mg/ml，肌肉蛋白浓度为22.48mg/ml，MDA测定过程中肝脏蛋白浓度为39.14mg/ml，肌肉蛋白浓度为65.82mg/ml。
2.MDA的测定
本组所测定的肌肉MDA含量为0.011 nmol/mg prot，肝脏MDA含量为0.14 nmol/mg prot。
3.蛋白质羰基化的测定
本组所测定的肌肉蛋白质羰基含量为727.92 nmol/mg prot，肝脏蛋白质羰基含量为1142.41 nmol/mg prot。
【讨论】
实验过程中测定的脂质过氧化所产生的MDA含量与复合污染条件下鲫鱼组织脂质过氧化中肝脏MDA含量（1.18~1.59nmol/mg prot）（贾秀英，2003）及亚硝酸盐胁迫条件下鲫鱼肝胰脏组织MDA含量（1.18±0.24nmol/mg prot）（谭树华，2005）相对比，结果的差异性较大，可以认为本次测定结果为错误，主要是因为测定过程中，测定的步骤与蛋白质羰基化的步骤混杂，且操作的过程不规范，因此造成了实验结果的错误。
蛋白质羰基含量测定结果与镉胁迫条件下瓯江彩鲤脏器组织蛋白质羰基含量（0.68-2.07nmol/mg prot）（刘晓旭，2011）相差太大，可以认为此次实验的结果不可靠。
两次的实验过程中，我们所测定的结果发生错误原因很多：第一，操作的过程不规范，如避光处理并未达到避光的要求；第二，实验步骤混乱，两个实验并行穿插以后，实验的步骤显得十分的混乱；第三，对实验过程的把握程度不够，故而造成了上述的结果，希望能在以后的实验中引以为戒。
参考文献：
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