实验1微生物显微镜的使用细菌形态的观察和细菌的革兰氏染色

注意事项
• 载玻片是否干净,取菌量、合
适的菌龄、 热固定及每一步 水洗和酒精脱色程度是实验成 功的关键 • 禁止把染液倒入水池中,回收 到废液桶中
影响革兰氏染色结果的因素
★菌龄：取处于对数生长期的细菌，此时结果典型。 ★操作： • • 热固定：温度不能太高，否则会造成细菌结构的破坏。 染色：染料应过量，避免结晶。 初染和媒染：时间在30-60s为宜。
复染：时间可稍长
• • 脱色：约30s，以流下的脱色液无色为准,否则制片上 会留有杂质或造成假阳性或假阴性。 水洗：要充分，否则制片上会留有杂质。
萋－纳氏抗酸染色法
• 染液：石炭酸复红，3％盐酸酒精，碱性 美蓝染液。
• 菌液：枯草芽孢杆菌
• 器具：显微镜，载玻片，酒精灯，接种环。
染色法：
（1）用接种环挑取一环枯草芽孢杆菌菌液，涂
3）观察几种常见细菌菌落； 4）进行革兰氏染色法的操作
实验原理
油镜的基本原理
显微镜的光学系统中，物镜的性能最为关键， 影响显微镜的分辨率。
显微镜物镜中的油镜放大倍数最大，可达100X,
油镜使用需在载玻片与镜头之间滴加镜油（香
柏油）。
总放大倍数(物镜放大倍数x目镜放大倍数) 物镜的数值孔径 N A
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为什么使用香柏油？ 当物镜与装片间的介质是空气（空气折射率 n=1.0）时，光线会发生折射，使进入物镜的
光线减少，降低了视野的照明度。
当介质为香柏油时，香柏油的折射率（1.52） 与玻璃相近，光线可经过载片直接进入物镜 而不发生折射，增加了照明度，更重要的是 增加了数值孔径达到提高分辨率的目的。
显微镜使用方法
于玻片上做成薄膜，自然干燥后经火焰固定。
（2)滴加石炭酸复红液于涂片上，用玻片夹住
涂片微火加热，保持染液冒蒸汽约5分钟，
切勿蒸发至干或使染液沸腾。 （3）冷后，水冲洗。
（4）以3％盐酸酒精脱 色，至片上红色全部脱
去为止。
（5）水冲洗后，以碱性 美蓝液复染1分钟，水洗， 待干，镜检。 结果：枯草芽孢杆菌芽孢被染成红色， 而菌体则被染成蓝色。
N A=n • sin
n是指介质（空气、浸油等）的折射率；
是孔径角的一半。
分辨率 显微镜所能分辨的两点之间的距离 分辨率＝ / 2×N.A.= / 2× n • sin （为所使用的光线的波长）
油镜的分辨率为0.2µ m左右
油镜的使用
• 增加照明亮度 油镜头焦距很短，直径很小，所需光照强 度最大 • 增加显微镜的分辨率 显微镜性能的优劣主要决定其分辨率的大 小。
实验一
• 显微镜油镜的使用与保护 • 细菌形态结构的观察 • 细菌的革兰氏染色
实验目的
1）掌握显微镜油镜的使用和保护法 2）认识细菌的基本形态与特殊结构。 3）掌握细菌涂片标本的制备、革兰氏染色法 的步骤、细菌的革兰氏染色结果。 4）学习无菌操作技术
实验内容：
1）显微镜油镜的使用方法；
2）观察细菌基本形态的染色装片；
A. arrangements of bacilli B. single bacillus C. streptobacillus
Spiral Forms
A. spiral forms B. spirillum C. spirochete (arrows) mixed with red blood cells D. vibrio
•(3)载玻片、盖玻片、接种环、酒精灯、
•(4)枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌 液体培养液、牙垢
实验原理
实验步骤
•涂片
左手持菌液试管,右手持接种 环在火焰中灼烧,冷却后从试 管中取菌液一滴,在洁净载玻 片上做一涂膜;
从固体斜面或平板上取菌时,
用无菌接种环取少量菌体,涂 抹均匀于玻片上预先滴有的 一滴自来水中;
细菌单菌落观察结果
显微镜各部分名称
油镜的维护与保养 • 透镜的清洁
用无水乙醇和无水乙醚（3:7/4:6）擦拭镜
头。尤其是用完油镜后。 • 干燥防止生霉
微生物形态观察 目的要求 •巩固显微镜油镜的使用方法
•认识细菌的基本形态和特殊结构
•观察并描绘几种常见微生物的基本形态与
特殊结构
实验仪器、材料和用具
细菌的鞭毛
arrangement of flagella鞭毛
细菌芽孢
细菌革兰氏染色
目的要求 •掌握细菌涂片标本的制备方法及革兰氏 染色法的步骤 •识别细菌的革兰氏染色结果
•学习无菌操作技术
实验仪器、材料和用具
•(1)显微镜、镜油、擦镜纸、擦镜液 •(2)结晶紫、革氏碘染液、95%酒精、番红染液
•显微镜、镜油、镜头纸、擦镜液 •细菌装片：细菌三种基本形态装片及细菌特殊 结构-芽孢、鞭毛、荚膜装片。
细菌基本形态观察 （1）观察金黄色葡萄球菌、八叠球菌装片。 注意菌体间的关系。 （2）观察枯草芽孢杆菌、大肠杆菌装片。 （3）观察螺菌装片。注意菌体的螺旋。
细菌的基本形态
Arrangement of Cocci球菌
• 干燥
在空气中自然干燥
固定
•用镊子夹住涂片一端,
在火焰上连续通过三次;以载玻
片在手背上试感觉不烫为宜.
染色步骤
1.结晶紫初染 ：滴加数滴结晶紫染液于细菌涂片上，
染色1分钟，水洗；
2.卢戈氏碘液媒染 ：用卢戈氏碘液覆盖涂片1分钟，水洗； 3.95%的乙醇脱色：滴加95%的乙醇，轻轻摇动玻片进行脱色，
细菌特殊结构观察
• （1）固氮菌（荚膜）装片：注意菌体和荚膜的 染色差异，荚膜的大小、以及与菌体的关系。
• （2）螺菌（鞭毛）装片：注意鞭毛的染色、位
置、数目、形状和大小。 • （3）巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、破伤风梭 菌装片，注意孢体和菌体的染色差异，芽孢的 形状、大小和位置。
细菌荚膜
Capsule stain of Enterobacter aerogenes
直至流出的乙醇无紫色时，水洗；
4.蕃红复染： 滴加蕃红染液复染2分钟以上，水洗，吸干 镜检。
镜检
•载玻片上滴加一滴香柏
油，放油镜下镜检;注意
标本中细菌的形态、大 小,排列,和颜色
染色结果：
革兰氏阳性菌呈紫色; 革兰氏阴性菌呈红色;
金黄色葡萄球菌的染色结果
讨论
• 记录革兰氏染色结果,并描述形状,菌体排列和颜 色, 看看与理论上是否相同;如不同,分析原因; • 分析影响革兰氏染色结果的因素; • 牙垢里大概能看到几类菌，哪几种较多？
A. arrangement of cocci B. staphylococcus arrangement C. streptococcus arrangement D. sarcina arrangement E. diplococcus arrangement
Arrangements of Bacilli牙孢杆菌