培训_第四章色谱分析法的应用

b l
Rf = 0 ~ 1
Rf = 0 ，表明在原点不动
a
Rf = 1，表明随溶剂一起移动
b
l 定性分析
将标准和样品的 Rf 值进行 比较，可以对样品进行定性分
析定量分析
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一．薄层色谱实验技术
（一）吸附剂的选择
硅胶略带酸性，适用于分离酸性和中性物质，商品硅 胶分为两类：硅胶H（不加石膏），硅胶G（加石膏） ；
由于色谱分析具有分离与“在线”分析两种 功能，能很好的排除组分间的相互干扰，逐个 将组分进行定性、定量分析，还能制备纯成分 ，因此在药物分析中，特别是中药材、中成药 、复方制剂分析、痕量分析、杂质检查、药材 鉴别时，一般首选色谱分析法。
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第一节 色谱法的分类与柱色谱的 应用
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一．色谱法的分类
有一定浓度的硫酸溶液或其他调节相对湿度的无机盐水 溶液，密闭旋转一定时间后，取出，立即在箱中36 展开
影响薄层色谱分析的主要因素：
3．吸附剂的活性与相对湿度的影响——湿度
牛胆汁中胆酸类成 分
的TLC扫描图
苍术薄层色谱图
32％
88％
胆酸类成分适宜低相对湿度下展开 苍术适宜在较高相对湿度环境下展开
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吸附剂应具备的条件
能可逆地吸附待分离的物质； 不会引起被吸附物质的化学变化； 吸附剂的粒度适当，能使洗脱剂以一定速率流出 （5~6ml/min）。
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续：柱色谱法的应用
展开示意图
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续：柱色谱法的应用
常用吸附剂的种类
（1）硅胶 （2）氧化铝 （3）大孔树脂 （4）硅藻土 （5）Sephadex LH 20 （6）C-18,C-8
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（二）薄层板的制备
1．干法 2．湿法
常用粘合剂有煅石膏、羧甲基纤维素钠（CMC-Na ）和淀粉。煅石膏用量一般为吸附剂的10 % ~20 %； CMC-Na溶液一般配成0.3 % ~1.0 %；淀粉为5 % ， 可用于铺制不同需求的薄层板。铺好的薄层板在室温 下晾干后，再入烘箱内活化 。
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（三）上样方式
薄层扫描仪的单色光透过薄层板上的斑点，此时部 分单色光被斑点吸收，使透射光的强度减弱，通过直 接测量透射光的强度来测定的方法称为透射法。
使单色光从薄层板上的斑点表面反射出来，此时部 分单色光被斑点吸收，使反射光的强度减弱，通过直 接测量反射光的强度来测定的方法则称为反射法。
若利用两束不同波长的单色光λS和 λR交替照射在同 一位置上，测定其吸收值差△A来计算样品含量的方 法称为
线分离，R>1.5 3）使展开后的组分斑点圆而集中，不应有拖尾现象 4）使待测组分的Rf值最好在0.4 ~ 0.6；组分多，也可在
0.2 ~ 0.8之间 5）混合溶剂应临时新配，一般只能使用一次，因为
a.低沸点的溶剂容易挥发 b.极性大的溶剂优先被吸附剂吸附，使比例变小 c.在第一次展开后，吸附剂的杂质可能被带入
为消除实验中难以避免的误差，提高Ｒƒ值的重现性 ，可采用相对比移值Ｒst定性，即用一个待测化合物 相近的已知化合物做相对标准，在同一条件下平行展 开测定，求两者Ｒƒ值的比值作为鉴定的依据。
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对照品的选择 （包括对照品和阴阳对照溶液）
（1）对照品

化学成分单体
（2）阴阳对照溶液 （3）对照药材和对照品同时对照
1．样品的预处理及供试液的制备 制备样品供试液所用的溶剂一般要求溶
解度不宜太大，粘度不宜太高，沸点适中；但 中药制剂往往希望各成分尽量多地提取出来， 最常被选用的是甲醇或乙醇，欲测成分和许多 其他“杂质”均可能被提取出来，因此供试液 的净化就显得更为必要。
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影响薄层色谱分析的主要因素：
2．薄层色谱的点样技术 一般在常规薄层板上原点的直径不大于3mm， 高效薄层板要求原点直径不大于2mm。 点样量不宜过大，最好控制在10μl以下，
状态
操作方法
分离原理
• 气相色谱法 • 液相色谱法 • 超临界流体色
谱法
• 柱色谱法 • 纸色谱法 • 薄层色谱法
• 吸附色谱法
• 分配色谱法
• 离子交换色谱
法
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二．柱色谱法的应用
洗脱ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ的选择
所用溶剂的吸附力应较弱，一般石油醚、苯、氯仿等 为弱洗脱剂；
乙醚、异丙醚为中等强度的洗脱剂； 低分子量醇及酮为强洗脱剂。
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续：展开
6）与组分能发生化学反应或在某些吸附剂上能聚合的溶 剂 不宜用 有些有机溶剂含有少量或微量杂质，会影响色谱行 为
7）具有适中的沸点和小的粘度
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续：展开
2．展开剂的选择
0在.2 吸~ 0附.8薄之层间色的谱清中晰，斑理点想。的展分开离剂是的得极到性一愈组大R，f值则在对 同一化合物的洗脱能力也愈大，Rf值增加。
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续：柱色谱法的应用
分析示例——应用大孔树脂柱层析分离重楼正丁醇萃
取物 将处理好的D101大孔吸附树脂，溶胀装柱，以水
-乙醇系统梯度洗脱，依次采用100%水、30%乙醇 、50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇，将其中所含的 无机盐、氨基酸、低糖类及色素等杂质除去，使皂 苷得到初步分离；再用硅胶柱细分，以氯仿-甲醇-水 三元系统梯度洗脱，根据该配比依次为95：5：0、9 ：1：0.1、8：2：0.2、7：3：0.3、6：4：0.4分离 纯化，甲醇重结晶、制备色谱制备，最终得到多个 皂苷单体。
实际工作中常用两种或两种以上混合溶剂作展开剂， 有利于调配展开剂的极性。
“基础溶剂” 、“洗脱溶剂”
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（五）显色
1. 显色方式 2. 显色剂的种类
1）通用显色剂 碘 碳化试剂 磷钼酸 三氯化锑或五氯化锑 罗丹明B 水 2）专属性显色剂
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二. 薄层扫描法
测定原理
影响薄层色谱分析的主要因素：
4．溶剂蒸气在薄层色谱中的作用
薄层色谱与柱色谱的区别之一就是溶剂的蒸气相在 展开缸中也参与色谱的展开而形成三维的层析过程。
吸附剂的粒度大小，对层析速度、分离效果及 Rƒ值均有明显影响，颗粒太大，则其总面积相 对减小 ，吸附量降低，展开速度快，层析后 组分的斑点扩散，使分离效果变差。颗粒较小 ，层析速度较慢，但颗粒太小，不易于干法铺 板一般颗粒以150~200目比较合适，湿法铺板 以250~300目为好。
根据薄层分离的需要，还可制成酸性，碱性 或pH缓冲薄层和荧光薄层等。
选择展开剂时一般要考虑吸附活度、被分离化合物 的极性及溶剂的极性这三者的关系。
选择展开剂有两个原则：一是展开剂对被分离物质 应有一定的解吸能力，但又不能太大。一般展开剂极 性应比被分离物质极性略小。另一是展开剂应对被分 离物质有一定的溶解度，如被分离的物质不能溶解于 展开剂中，就不能随展开剂向前移动。
双波长测定法。
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三．薄层色谱定性分析
（一）薄层色谱定性分析（以Rf值为基准）
薄层色谱中的Ｒƒ值可作为定性鉴别的依据。应用Ｒƒ 定性，一般用待测化合物的纯品作对照，在两种或两 种以上展开剂系统中展开，若样品中斑点的Ｒƒ值与纯 品Ｒƒ值都相同，可肯定两者为同一化合物。但在中药 鉴定中也常用标准药材为对照品，用以鉴别药材的真 伪。
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概述
薄层色谱的优点是： （1）设备简单； （2）展开时间短； （3）分离效果好； （4）显色方便，也可喷洒腐蚀性显色剂、加热等 （5）灵敏度高。 应用最广泛的是吸附薄层色谱，主要是利用吸附过程
的两个规律： （1）吸附是可逆的、吸附与解吸附处于一个动态平衡中
； （2）吸附剂对不同物质的吸附行为有差异；主要的吸附
氧化铝略带碱性，适用于分离碱性和中性物质； 聚酰胺多用于分离黄酮类成分。
应该根据被分离物质的极性大小来选择吸附活度合适 的吸附剂，对极性小的试样可选择吸附活性较高的吸 附剂，对极性大的试样，选择活度较低的吸附剂。
吸附剂的活化主要是通过一定温度烘烤，除去颗粒中 的水分
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（一）吸附剂的选择
分子中极性官能团数目增大，一般情况下吸附力增 加，但是若两个官能团处于邻位，能发生分子内氢键 缔合时，则它们与吸附剂形成氢键的能力削弱。
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Rƒ值的定义 相对比移值Rst
原点到被测组分斑点中心的距离 R
st 原点至参考物斑点中心的距离
影响Rƒ值的因素： 如色谱层析条件中的流动相组成，展开时的温度，
样品溶于易挥发的有机溶剂中，如甲醇、 乙醇、氯仿、丙酮等，尽量不用水，否则会 降低吸附剂活性。用毛细管、微量注射器、 微量点样器（定量毛细管）、微量吸管等将 样品液滴加在薄层板上，注意展开剂不能浸 过起始线。 接触上样 TAS法
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（四）展开
1.展开剂的基本要求
1）能使待测组分很好的溶解 2）使待测组分与杂质分开，而待测各组分之间能达到基
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第二节 薄层色谱法的应用
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概述
吸附薄层的分离原理是将A、B两组分的混合试样 溶液，点在薄层板的一端，在密闭的容器中，用适当 的展开剂（developer）展开。此时A、B组分不断地被 吸附剂所吸附，又被展开剂所溶解而解吸，且随之向 前移动。由于吸附剂对A、B具有不同的吸附能力，展 开剂对A、B也有不同的溶解、解吸能力，因此当展开 剂不断展开，A、B会在吸附剂和展开剂之间发生连续 不断的吸附、解吸附，从而产生差速迁移得到分离。
阳性对照溶液的制备： 取制剂处方中欲鉴定的某单味原药材，按制剂
的制法处理后，再以与制备样品供试液相同的 比例、方法、条件制成溶液。
阴性对照溶液的制备： 将制剂处方中减去欲鉴定药味后的其它所有各
味药材，按制剂方法处理后，再以制备样品供 试液相同的比例、方法、条件制成溶液。
三．薄层色谱定性分析
剂有硅胶、氧化铝、聚酰胺等。被吸附物与吸附剂之 间的作用力包括色散力、静电力、诱导力和氢键作用