Addgene---2016年最火的慢病毒质粒和腺病毒质粒
4-HNE在前列腺癌进展的作用的研究
2.3.5免疫荧光检测药物刺激后AR核定位情况：将LNCaP以及其相应的稳定转染4-HNE细胞以1×105接种于24孔板中，相应药物刺激（DHT，匹卡鲁胺）刺激5天。一抗孵育，4℃过夜，一般要大于18h或者37℃1-2h。PBS洗净，3min，5次。荧光二抗孵育，37℃，1h，荧光显微镜下观察AR核定位情况，并拍照。
4-HNE在前列腺癌进展的作用的研究
摘要】目的：探讨四羟基壬烯(4-hydroxynonenal，4-HNE)的表达及其在前列腺癌发生发展中的的作用。方法：将GSTcDNA转染人前列腺癌细胞以建立细胞内低4-HNE低水平细胞模型，检测其雄激素受体以及MAKP、AKT、PKC等相关调控基因的表达；以不同剂量4-HNE诱导前列腺癌细胞，检测其雄激素受体及相关调控基因的表达，研究细胞内外不同4-HNE水平的情况下前列腺癌细胞对双氢睾酮的敏感性变化。结果：DHT-LNCaP组AR蛋白更多定位于细胞核，Bicalutamide-LNCaP组细胞，AR核定位减少，同时人PSA ELISA结果表明DHT刺激后，LNCaP细胞中的PSA分泌量增高，Bicalutamide刺激后，LNCaP细胞中的PSA分泌量降低。DHT可以增强AR的活性，Bicalutamide能够抑制AR的活性。AR活性的改变，c-Myc蛋白和PSA蛋白有着正性的调控作用，而对4-HNE表达量的调控是一种正性作用。当AR的活性降低时，4-HNE的表达量降低。结论：4-HNE是前列腺癌的重要促进分子，并且是AR通路中的起关键调控作用。
2.3.6人PSA-ELISA检测将LNCaP以及其相应的稳定转染4-HNE细胞以5×105接种于6孔板中。各个药物刺激组用相应药物刺激5天后（药物剂量同前，对照同前），收集培养液上清，上清经过3000rpm，离心10min后，去除颗粒和聚合物，-20℃保存备用，而后进行ELISA检测。在450nm波长处测定各孔的光吸收值。绘制标准曲线：在Excel工作表中，以标准品浓度作横坐标，对应光吸收值作为纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线，按曲线方程计算各样本浓度值，而后汇总数据，进行统计学分析。
用于CRISPR文库筛选的N2a-Cas9细胞系的构建
中国预防兽医学报Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine第42卷第12期2020年12月V ol.42No.12Dec.2020doi ：10.3969/j.issn.1008-0589.202002012用于CRISPR 文库筛选的N2a-Cas9细胞系的构建张纪文，王露露，李芳，刘杏，赵东明*，步志高*（中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室，黑龙江哈尔滨150069）摘要：为了进行CRISPR 文库筛选，本研究采用慢病毒转导的方法利用N2a 细胞构建表达Cas9蛋白的N2a-Cas9单克隆细胞系。
实验将LentiCas9-Blast 、pSPA X2和pMD 2.G 3种质粒共转染人胚胎肾细胞（HEK293T ）获取高滴度的重组慢病毒，收集重组慢病毒并感染N2a 细胞，经杀稻瘟菌素（Blasticidin ）筛选，通过有限稀释法获得含有Cas9基因的多个单克隆细胞株。
Western blot 结果显示候选细胞系高水平表达Cas9蛋白；利用慢病毒表达报告基因载体系统检测显示候选细胞系的Cas9蛋白具有很高的切割活力；利用CellTiter-Glo 试剂检测结果显示，Cas9基因在候选细胞系内高表达但不影响细胞增殖活性。
本研究利用慢病毒转导系统构建了稳定表达Cas9蛋白的N2a-Cas9单克隆细胞系，为基于CRISPR/Cas9全基因组高通量筛选技术探究神经细胞内关键宿主基因调控狂犬病病毒嗜神经性提供研究基础。
关键词：基因编辑；慢病毒；高通量筛选；鼠神经瘤母细胞中图分类号：S852.65文献标识码：A文章编号：1008-0589（2020）12-1292-04Construction of N2a-Cas9cell line for genome-wide CRISPR screeningZHANG Ji-wen,WANG Lu-lu,LI Fang,LIU Xing,ZHAO Dong-ming *,BU Zhi-gao *(State Key Laboratory of Veterinary Biotechnology,Harbin Veterinary Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Harbin 150069,China)Abstract :In this study,mouse neuroblastoma (N2a)cells were used to construct N2a-Cas9cell line which stably expresses Cas9protein by using lentivirus transfection technology.This constrcted cells line laid the foundation for CRISPR library screening.First,three plasmids including LentiCas9-Blast,pSPA X2,and pMD 2.G were co-transfected into human renal epithelial cells (HEK293T)to obtain recombinant lentivirus with high titers.N2a cells were infected with the recombinant lentivirus,and then screened by Blasticidin.Finally,several monoclonal cell lines expressing Cas9protein were isolated by limiting dilution.The expression of Cas9expression in N2a-Cas9cell line was determined by western blot,and the high cleavage activity of Cas9was also examined by using lentivirus-based reporter vector system.By using CellTiter-Glo ®reagent,the cell proliferation activity was well detectable and not decreased in N2a-Cas9cell lines,where Cas9gene was expressed in a high level.Therefore,N2a-Cas9cell line was successfully constructed using a lentiviral transfection system,which can provide a basis for genome-wide CRISPR screening to identify crucial host factors regulating Rabies virus neuro-tropism.Key words :gene editing;lentivirus;genome-wide CRISPR screening;murine neuroblastoma收稿日期：2020-02-11基金项目：兽医生物技术国家重点实验室自主课题（SKLVBP201801）作者简介：张纪文（1993-），男，河南驻马店人，硕士研究生，主要从事兽医微生物及其分子生物学研究.*通信作者：E-mail ：****************；*********************Corresponding author张纪文，等.用于CRISPR文库筛选的N2a-Cas9细胞系的构建第12期CRISPR-Cas9（Clustered regularly interspaced short palindromic repeat sequences/CRISPR-associated protein 9）是存在于细菌或古生细菌中的一种抵御外源DNA 侵入的适应性免疫反应系统[1]。
CRISPR protocol2-质粒构建和建系
CRISPR/Cas9系统操作说明-2 ---基于lentiCRISPR v2应用指南-载体构建和建系汉恒生物提供CRISPR/Cas9载体的快速构建试剂盒，同时也提供各种载体构建和病毒包装（慢病毒、腺病毒和AAV）、建系服务lentiCRISPR v2载体是张锋实验室发布一个慢病毒载体，cas9和sgRNA 表达框在同一各载体上。
而且Cas9的C 端带有FLAG 融合标签，载体包含Puromycin 抗性基因，适合建系。
验证sgRNA 活性的时候也适合顺转；包装成慢病毒适合常规细胞系的建系。
构建非常方便。
说明lentiCRISPR v2https:///52961/☐克隆gDNA 使用BsmBI 位点，载体可以切出一个~1.9 kb 的filler 片段，便于confirm 酶切成功并利于载体回收；☐BsmBI 的位点是，酶切之后不需要CIP 脱磷也不会自连！☐Cas9的COOH 端带有FLAG tag,可以WB 或者Immunostaining；☐EFS promoter 被优化的小而强，极大提高了慢病毒包装的效率；☐载体带有Puromycin 抗性，可以富集转染/感染成功的细胞。
☐gDNA 设计方法和原则请参考上第一篇“CRISPR/Cas9系统操作说明”，链接如下：☐对于lentiCRISPR v2克隆，其合成的oligo 末端和pX330不同，请注意设计；☐怕大家看不懂，举个例子说明（克隆小白千万注意oligo 的方向）：gDNA 设计说明载体克隆说明☐Backbone的酶切体系同上一篇文章（说明：不脱磷处理参考黑框，脱磷参考红框内操作）；☐Oligo的退火条件也参考上一篇文章（说明：如果载体不脱磷，oligo不需要磷酸化；载体脱磷参考红框内操作，oligo就需要加磷处理！！！（红色框内是FengZhang提供的protocol，设计脱磷，可以参考））仅作参考病毒包装体系☐包装病毒使用的包装体系如下（for 100 mm dish ，6x106293T ）☐转染条件：用细胞转染试剂lipofiter （超便宜且好用）（汉恒生物，/cn/products/item/36，（或者lipo2000）DNA/lipofiter=1 μg ：2.5 μl☐收集48hr 和72hr 病毒上清，待用。
LvshRNAHsamicroRNA慢病毒表达载体的构建与鉴定
Lv—shRNA—Hsa—microRNA—691慢病毒表达载体的构建与鉴定龙源期刊网Lv—shRNA—Hsa—microRNA—691慢病毒表达载体的构建与鉴定作者:何燕浙唐德军来源:《饮食与健康·下旬刊》2016年第08期【摘要】目的:构建 Lv-shRNA-hsa-microRNA-691慢病毒表达载体。
方法:双酶切及测序鉴定正确后进行慢病毒包装与滴度检测。
构建成功后感染人胰腺癌细胞Panc-1, 48h后Real-time Q-PCR检测miR-691的表达。
结果:病毒感染后的Panc-1胰腺癌细胞在倒置荧光显微镜下观察可见绿色荧光,Real-time Q-PCR显示被感染细胞的miR-691表达量较未感染细胞显着增高。
结论:建立了高效稳定表达Lv-shRNA-hsa-miR-691 的慢病毒转染系统。
【关键词】microRNA; Lv-shRNA-hsa- miR-691;慢病毒表达载体microRNA是近年来在人体中发现一类长度约为22个核苷酸左右的非编码RNA,它不直接参与蛋白质的合成,通过对人体1/3左右的mRNA进行调节,控制着细胞分化、增殖和凋亡等生命活动,并能够特异性靶向mRNA实现对其转录后抑制[1]。
已有的研究表明:波形蛋白作为胰腺癌上皮-间质化标志蛋白之一,与胰腺癌的侵袭转移密切相关[2, 3]。
通过生物性息学预测Lv-shRNA-hsa-miR-691可靶向调控波形蛋白的表达。
本研究旨在构建针对Lv-shRNA-hsa-miR-691高效的慢病毒表达系统,为深入研究其靶向调控波形蛋白的表达对胰腺肿瘤细胞侵袭转移提供一种研究工具。
1.材料和方法材料1. 质粒、菌株和细胞及主要酶和试剂慢病毒质粒pLenti-CMV-GFP Puro (658-5)、包装质粒和购自Addgene 公司;大肠杆菌菌株PANC-1细胞妥善保存。
限制性内切酶AgeI、EcoR I、T4 连接酶购自Takara公司;;总RNA提取试剂盒购自Qiagen公司;Fugene HD转染试剂购自Roche 公司;Lv-shRNA-hsa-miR-691定量PCR引物及miRNA qRT-PCR 检测试剂盒购自GeneCopoeia公司。
质粒的写法规则
质粒的写法规则1.小写p开头，p在这里指代质粒（plasmid），所以我们常常看到pXXXXX-XXXX。
2.质粒骨架p后面接上质粒骨架名称，pBACKBONE-XXXX。
质粒骨架中包含promoter等等重要信息，一旦你对这个骨架熟悉，通过名称则很快能推测出质粒元件。
addgene有专门的VectorDatabase可供查阅许多已发表或商业化的质粒空骨架信息。
3.插入的基因名，pBACKBONE-hGene，可以看到h在这里的意思是human。
在质粒命名中经常会用小写字母来代替物种，小鼠m，大鼠r等等。
对于Cas9会写SpCas9，Sp则意为Streptococcuspyogenes（化脓性链球菌）。
4.贴Tags，通常插入的基因还会带有flag，需要按照出现顺序给出信息，比如我们前面文章提到的NLS-Cas9-NLS，这意味着Cas9前后各有一个核定位信号NLS，以保证Cas9的和核定位。
5.标记突变信息，插入的基因时常带有特定突变，因此需要额外标记出来。
而突变通常使用氨基酸表示，如Q295A代表：第295位谷氨酰胺（Glutamine）突变为丙氨酸（Alanine）。
以上是质粒命名的一些通用规则，有时候质粒不一定严格按照以上规则命名，但可以举一反三，窥得其中一些规律。
例子：（1）pSpCas9（BB）-2A-GFP（PX458）：以PX458为骨架，带有SpCas9表达元件，SpCas9后连接有2A-GFP元件，2A用于自我断裂，将Cas9和GFP分开，而GFP则作为筛选标记。
（2）px458_2A_GFP_sgRNA_TIAL1：以PX458为骨架（该骨架带有SpCas9），带有2A-GFP元件用于断裂和筛选，同时表达针对TIAL1基因的sgRNA，因此该质粒可用于TIAL1基因敲除，并且可使用GFP筛选。
（3）pLenti-U6sgbbBsmbI-puro-2A-Fluc：慢病毒骨架质粒，带有U6启动子，奇怪名称sgbbBsmbI（由于这是一个空骨架质粒，盲推这是酶切位点？）的sgRNA，筛选标记是puromycin，同时还会有荧光素酶表达用于体内成像。
维持人胚胎干细胞多能性顺式作用元件的筛选
基础医学与临床Basic&Clinical MedicineMay2021 Vol.41No.52021年5月第41卷第5期文章编号：1001-6325(2021)05-0636-05研究论文维持人胚胎干细胞多能性顺式作用元件的筛选孙梦瑶，刘思琪，周凡琦，马艳妮，余佳*(中国医学科学院基础医学研究所北京协和医学院基础学院医学分子生物学国家重点实验室，北京100005)摘要：目的在人胚胎干细胞(hESCs)中建立一种可行的CRISPR文库筛选方法，筛选参与维持hESCs多能性的顺式作用元件。
方法将诱导型Cas9蛋白表达元件插入hESC基因组中，构建诱导型Cas9稳定表达株(iCas9-hESC)。
通过分析已发表的hESCs中的染色质互作信息，确定可能参与多能性基因调控的顺式作用元件，并以此来构建双gRNA CRISPR敲除文库。
使用CIRSPR文库在低感染复数情况下感染iCas9-hESC,诱导Cas9蛋白表达，对细胞进行基因编辑。
以OCT4的表达水平作为衡量多能性的标准，对基因编辑后的细胞进行OCT4的流式抗体染色与分析，确定顺式元件敲除后是否影响到hESC的多能性。
结果成功构建iCas9-hESC,且该细胞仍保持多能性状态。
构建顺式元件的CRISPR敲除文库,成功感染目的细胞。
对文库感染后的细胞进行OCT4表达水平的流式分析，发现基因编辑后的细胞确实存在多能性下降的部分群体。
结论建立了在hESC中通过CRISPR文库筛选参与维持多能性顺式作用元件的可行性方案o关键词：人胚胎干细胞;多能性;顺式元件;CRISPR文库中图分类号:Q523文献标志码:AScreening of cis-acting elementsfor maintaining pluripotency of human embryonic stem cellsSUN Meng-yao,LIU Si-qi,ZHOU Fan-qi,MA Yan-ni,YU Jia*(State Key Laboratory of Medical Molecular Biology,Institute of Basic Medical Sciences CAMS,School of Basic Medicine PUMC,Beijing100005,China)Abstract:Objective To establish an inducible CRISPR library screening method for human embryonic stem cells (hESCs)to screen the cis-acting elements involed in the maintainance the pluripotency of hESCs.Methods The inducible Cas9expression elements were inserted into the hESC genome to construct an inducible Cas9stable expression strain(iCas9-hESC).Analyze the published chromatin interaction information in hESCs to identify the cis-acting elements that may be involved in the regulation of pluripotency genes,then to construct a double gRNA CRISPR knockout library.The CIRSPR library was used to infect iCas9-hESC at low multiplicity of infection followed by induction of Cas9expression,and gene ecKting of the cells・Using the expression level of OCT4as a standard to measure pluripotency,the cells after gene editing were stained with OCT4and analyzed by flow cytometry to determine whether the knockout of cis-elements would affect the pluripotency of hESCs.Results The iCas9-hESC was successfully constructed,and the cells still maintained a pluripotent state.Construct a CRISPR knockout library of ciselements收稿日期：2021-01-20修回日期:2021-03-20基金项目：国家自然科学基金(81970103)*通信作者(corresponding author):j-yu@孙梦瑶维持人胚胎干细胞多能性顺式作用元件的筛选637and successfully infect the target cells.Flow cytometric analysis of the expression level of OCT4was performed on the cells after the library infection,and it was found that there were indeed some populations with decreased pluripotency in the cells after gene editing.Conclusions A feasible scheme for screening cis-acting elements involved in maintaining pluripotency in hESCs through CRISPR library is established・Key words:human embryonic stem cell;pluripotency;cis-elements;CRISPR library人胚胎干细胞（human embryonic stem cells, hESCs）是一类源于人囊胚内细胞团，经过体外分离纯化及培养,所得到的稳定的多能干细胞,可在适当的条件下分化形成体内各种类型的细胞，因具有潜在的再生医学应用前景而被广泛研究⑴。
腺病毒的一些常见问题及解答----整理自丁香园
汇总了腺病毒的一些常见问题及解答！1.目前，对于基因治疗的载体选择，很难有一个统一的结论，文章也很多，我将在如下给出。
本人认为，无论选择哪种载体，关键在于此载体在局部的表达效率。
无论是采用IN VIVO 或者EX VIVO的方法，因为我们最终的目的是要在局部表达我的目的基因，并且使其具有一定的作用。
而对于载体的副作用，目前较为公认的就是病毒载体转染效率高，但副作用大；质粒载体毒性小，但转染效率比较低。
同时，对于目前所常用的一些带有报告基因的表达载体如BD公司所开发的系列载体，pEGFP、pDsRed、pEYFP和pECFP等：aaaclontechaaa这些载体如果用于细胞水平的检测，也许会更加的方便、直观，但是，如果用于体内的基因治疗，那就不是一个理想的载体了。
而传统的表达载体如INVITROGEN公司（aaainvitrogenaaa)的pCDNA载体系列，会更好一些。
同时，为了获得更加高效的表达，一些公司也开发出了具有信号肽的表达载体，以增加外源基因的分泌表达。
bbb:///vcore/Plasmids/pUMVC6a.htmbbb:///vcore/Plasmids/pUMVC7.htm正如一个疾病的治疗一样，治疗的方法越多，就证明还没有一个最有效地治疗手段。
基因治疗的载体也是同样，很难说哪个载体具有高转染、高表达、低毒性的全部优点。
以上是本人的一点愚见，还请各位同道指正。
2.转染过小鼠肝癌细胞H22，请赐教：用什么方法可以达到最佳效果，脂质体、电转还是重组病毒？如果用脂质体，哪家的最好？H22细胞为悬浮细胞，用病毒（逆转录病毒和腺病毒）最为理想，一是转染效率高，二是不用筛选直接用于实验。
但逆转录病毒的转染效率并不能达到100%，且影响因素多，而腺病毒感染效率高，几乎可达100%，但只能短期表达（7－10天），随着细胞传代，外源基因会逐渐丢失。
当然，H22也可用脂质体进行转染，筛选应在96孔板上进行，由于培养液少、细胞相对静止，两周后可见细胞克隆生长，在倒置显微镜下用吸管吸取克隆，进行扩大培养。
SREBP-1c基因过表达细胞模型的构建及对HepG2细胞脂滴含量的影响
SREBP-1c基因过表达细胞模型的构建及对HepG2细胞脂滴含量的影响刘芳;秦双红;赵燕霞【摘要】OBJECTIVE:Construction of a recombinant lentiviral vector overexpressed SREBP-1c,its transfection into human hepatocellular carcinoma cell lines (HepG2) with high transfection efficiency and its effect on cellular lipid storage.METHODS:SREBP-1c gene was cloned from pCMV5-HA-SREBP-1c by polymerase chain reaction and identified by gene sequencing.The SREBP-1c gene was cloned to lentiviral expression vector (pLenti6.3/V5) by recombing DNA technology.The 293T cells were co-transfected with lentiviral packaged systems and the SREBP-1c plasmid by Lipofectamine2000 reageant to package the lentiviral particles,viral supernatant was collected,HepG2 cells were then infected by pLenti6.3-SREBP-1c.After puromycin screening,HepG2 cells were constructed.Real time PCR and Western blot assays were performed to analyzed SREBP-1c expression levels.Cellular lipid storage was detected under fluorescent microscopy and the triacylglyceride(TAG) content by TLC analysis in SREBP-1c-overexpressing HepG2 cells.RESULTS:pLenti6.3-SREBP-1c was successfully constructed and verified by restriction analysis and sequencing.SREBP-1c gene expression level in HepG2 cells with SREBP-1c gene transfection was 11.4 times higher than the control.SREBP-1c protein level in HepG2 cells with SREBP-1c gene transfection was 3.2 times higher than the control.The number and size of lipid droplets (LDs) wasincreased,and a higher concentration of TAG was found in SREBP-1coverexpressing cells compared with the control (P＜0.01).CONCLUSION:Recombinant lentiviral vector pLenti6.3-SREBP-1c and SREBP-1c-overexpressing cell strain was successfully constructed.The high protein and mRNA levels of SREBP-1c were assessed after HepG2 cells were transfected.SREBP-1c increased the lipid storage of HepG2 cells.The constructed cells can become a useful tool for lipid metabolism research of liver carcinoma.%目的:构建SREBP-1c过表达HepG2细胞模型并观察其对脂滴含量的影响,为进一步深入研究肝癌脂滴代谢异常机制提供细胞模型.方法:采用DNA重组技术,将SREBP-1c基因克隆至慢病毒表达载体pLenti 6.3/V5中,并用脂质体介导法将慢病毒包装系统和带目的基因的质粒pLenti6.3-SREBP-1c共转染293T细胞,收集上清,感染HepG2细胞.通过Real-time PCR和Western blot对细胞株进行鉴定.采用免疫荧光检测HepG2细胞中脂滴的数量、大小及细胞内甘油三酯的含量.结果:成功构建了过表达SREBP-1c基因的慢病毒载体pLenti6.3-SREBP-1c,转染后HepG2细胞中可见明显的SREBP-1c蛋白表达.Real-time PCR 检测结果显示转染SREB P-1c基因的HepG2细胞中SREBP-1c mRNA水平较对照组升高了约11.4倍.Western blot结果显示SREBP-1c蛋白水平较对照组提高3.2倍.免疫荧光显示过表达SREBP-1c能够明显增加HepG2细胞内脂滴的数量和大小.细胞内甘油三酯定量结果显示甘油三酯含量较对照组明显升高(P＜0.01).结论:成功构建了,REBP-1c基因过表达的重组慢病毒载体及其稳定转染细胞株.高表达SREBP-1c的HepG2细胞增加了细胞中脂滴的数量、大小和甘油三酯的含量,可用于从脂滴代谢方面对肝癌发病分子机制的研究.【期刊名称】《癌变·畸变·突变》【年(卷),期】2018(030)001【总页数】6页(P14-19)【关键词】SREBP-1基因;慢病毒载体;人肝癌细胞HepG2;基因转染;脂滴【作者】刘芳;秦双红;赵燕霞【作者单位】第四军医大学西京医院皮肤科,陕西西安710032;第四军医大学西京医院病理科,陕西西安710032;解放军第518医院,陕西西安710043;解放军第518医院,陕西西安710043【正文语种】中文【中图分类】Q291肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)在全球最常见的恶性肿瘤中排名第5，每年有超过70万的新发病例，年死亡人数高达25万人 [1-2]。
质粒图谱查询方法
3.google scholar: / 有些质粒是经过改造的，所以通过上述方法不能查询到相应信息。这时，可以在google scholar中输入质粒名称，可以直观地看哪些学者在何文章中使用了该质粒，从而可了解到质粒的来源;或者籍此向作者咨询或索取。 4.尝试从各大生物公司，例如invitrogen网站查询. 5. 这个网站收录了大量图谱： http://www.embl-hamburg.de/~geerlof/webPP/vectordb/bact_vectors/table.html
By
0039--pET-24a--Novagene--原核表达--yanBaggio 0040--pGBKT7 和pGADT7--CLOTE--酵母表达--小迷糊 0041--PTXB1--BIOLABS--原核表达--小迷糊 0042--pET-43.1 Ek/LIC--Novagene--原核表达--mcli 0043--PIRES--BD BIOSCIENCES--穿梭载体---joeys008 0044--pBAD/Thio-TOPO--invitrogen--原核表达--mcli 0045--pESC-HIS--Stratagene--酵母表达--zhangqiongyu82 0046--pcDNA3.1/V5-His-TOPO--invitrogen--真核表达--mcli 0047--pMSCVneo--Clontech--真核表达--intron 0048--pCDNA6 /V5 HisB--invitrogen--真核表达--linct97 0049--pcDNA3.1(+)--invitrogen--真核表达--kinase 0050--pSecTag2--invitrogen--真核表达--sssusu 0051--pIRESneo--Clontech--真核表达--sssusu 0052--pBudCE4.1--invitrogen--真核表达--barbie 0053--pGEX-4T-3--amershambio--原核表达--linct97 0054--PESC-TRP--startgene--真核表达--zhangqiongyu82 0055--pPICZ--invitrogen--毕赤酵母表达--yshu3507 0056--pTrc99a--novogen--原核表达--Gmail 0057--pGEX-6p-1--amershambio--原核表达--erik 0058--pSFV1--invitrogen--真核表达--syfnet 0059--pSCA1--赠送--真核表达--syfnet 0060--pUC18--/--克隆--syfnet 0061--pshuttleCMV--KRACKELER--穿梭质粒--renke3333 0062--pdc315--microbix--shuttle--renke3333 0063--pBluescript SK(+)--tianwei--原核表达--fenqinzhuhe 0064--pPIC3.5K--Invitrogen--真核表达--mcli 0065--pFB-hrGFP--Stratagene--真核表达--zhangqiongyu82 0066--pSG5--Stratagene--真核表达--zhangqiongyu82 0067--pCMV-Tag4B--Stratagene--真核表达--小迷糊 0068--pET11a--invitrogen--原核表达--pinghw 0069--pET30a--invitrogen--原核表达--seasider 0070--pCI-NEO--PREMOGA--真核表达--syfnet 0071--phRL-null--PREMOGA--真核表达--kenmed 0072--pBC1--invitrogen--真核表达--竹影烟雨 0073--pGEMEX-1--Promega--体外转录--palmyard 0074--pGEM-T Easy--Promega--克隆--laohu200381 0075--pGEX-5x-1--Pharmacia--原核表达--laohu200381 0076--pshuttle--qbiogene--穿梭质粒--renke3333 0077--pet9c--promega--原核表达--renke3333 0078--trans-vector--qbiogene--穿梭质粒--renke3333 0079--PQBI PGK--QBIOGENE--真核表达--renke3333 0080--PQBI T7 GFP--QBIOGENE--真核表达--renke3333 0081--pcDNA5/FRT/CAT—INVITROGEN--真核表达--renke3333 0082--pBABE Hygro—Geron--真核表达--Jeffrey88 0083--pBABE puro--Geron--Jeffrey88 0084--pMSCV puro—Clontech—RNAi--tuterhu 0085--质粒名--PEGFPN3—Clontech--真核 GFP--renke3333 0086--质粒名称—PSHTULLE—Clontech--穿梭---renke3333 0087--pkk223-3--哈佛大学Brosius等构建--原核表达--kingtsh 0088--pcdna3-c-myc—invitroge--真核表达--giyon 0089—pSG-cmv--新基因--stevenvin 0090--PGEX-3x--BD Co--融合型蛋白原核表达载体--kingtsh 0091--PEGFPc2—Clontech--真核 GFP 0092--PEGFP－N2—Clontech--真核 GFP 0093—PMECA--不详--克隆载体 0094--PGEX 4T－2--不详--克隆载体 0095--siSTRIKE? U6—PROMEGA--RNAi载体 0096--pSilencer? neo—Ambion--RNAi载体 0097--pSilencer? hygro—Ambion--RNAi载体 0098--pSilencer? puro—Ambion--RNAi载体
稳定表达猪德尔塔冠状病毒N_蛋白的Vero_细胞系的建立及鉴定
·研究论文·Chinese Journal of Animal Infectious Diseases中国动物传染病学报摘 要：为获得稳定表达猪德尔塔冠状病毒（PDCoV ）核衣壳（N ）蛋白的非洲绿猴肾（Vero ）细胞系，本研究将PDCoV-N 基因克隆入慢病毒载体中，获得重组质粒pLVX-PDCoV-N ，利用慢病毒包装系统转染293T 细胞，包装成表达N 蛋白的慢病毒颗粒，慢病毒感染Vero 细胞，嘌呤霉素加压筛选目的细胞。
RT-PCR 扩增N 基因和测序表明细胞系基因组中存在N 蛋白编码序列，Western blot 和IFA 试验表明N 蛋白可在细胞系中稳定表达。
应用制备的细胞系对临床PDCoV 阳性血清样品进行检测，与ELISA 检测结果符合率达到100%。
本研究成功建立了稳定表达PDCoV N 蛋白的Vero 细胞系，为PDCoV N 蛋白生物学特性研究和PDCoV 的临床检测、流行病学调查奠定了基础。
关键词：猪德尔塔冠状病毒；核衣壳（N ）蛋白；慢病毒；稳转细胞系中图分类号：S858.28 文献标志码：A 文章编号：1674-6422（2024）01-0056-06Establishment and Characterization of a Vero Cell Line Stably Expressing NProtein of Porcine DeltacoronavirusQIAN Bingxu 1,2, BO Zongyi 1,3, BAI Xueyan 1, ZHANG Chengcheng 1, GUO Mengjiao 1, LI Mengjiao 1,LIAO Kai 1,2, XUE Feng 2, WU Yantao 1, ZHANG Xiaorong 1(1. College of V eterinary Medicine of Y angzhou University, Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses, Y angzhou 225000, China; 2. International Cooperative Laboratory for Animal Health and Food Safety, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China; 3. Joint International Research Laboratory of Agriculture and Agri-Product Safety, Ministry ofEducation of China, Y angzhou University, Y angzhou 225000, China)收稿日期：2021-08-23基金项目：扬州大学高端人才支持计划；江苏高校优势学科建设工程资助项目作者简介：钱炳旭，男，博士研究生，主要从事动物传染病防控研究；薄宗义，男，助理研究员，主要从事动物传染病防控研究通信作者：张小荣，E-mail：***********.cn稳定表达猪德尔塔冠状病毒N 蛋白的Vero 细胞系的建立及鉴定钱炳旭1,2，薄宗义1,3，白雪雁1，张成成1，郭梦娇1，李梦娇1，廖 凯1,2，薛 峰2，吴艳涛1，张小荣1（1.扬州大学兽医学院 江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，扬州225000；2.南京农业大学动物健康与食品安全国际合作实验室，南京210095；3.扬州大学农业科技发展研究院教育部农业与农产品安全国际合作联合实验室，扬州225000）2024,32(1):56-61Abstract: To obtain a African green monkey kidney cell (Vero) line stably expressing nucleocapsid (N) protein of Porcine deltacoronavirus (PDCoV), the PDCoV N gene was cloned into a lentiviral vector to obtain the recombinant plasmid PLVX-PDCoV-N. Then, the recombinant plasmid PLVX-PDCoV-N was transfected into 293T cells by lentivirus packaging system and packaged into lentivirus particles for N protein expression. Vero cells were infected then with the lentivirus and the target cells were screened by puromycin. The results of RT-PCR and sequencing of PCR product showed the genome of the resulting Vero cell line containing N gene. The N protein that was stably expressed in the Vero cell line was confi rmed by Western blot and IFA. The Vero cell line was used to detect clinical PDCoV positive serum samples and the coincidence with the results of ELISA was 100%. The study successfully established a· 57 ·钱炳旭等：稳定表达猪德尔塔冠状病毒N 蛋白的Vero 细胞系的建立及鉴定第32卷第1期猪德尔塔冠状病毒（Porcine delta coronavirus, PDCoV）是近年来新发的冠状病毒，2012年在中国香港被首次报道[1]，2014年在美国首次出现大规模流行[2-3]。
miR-194慢病毒表达质粒的构建及对人骨肉瘤细胞系U2-OS转移的相关研究
miR-194慢病毒表达质粒的构建及对人骨肉瘤细胞系U2-OS转移的相关研究韩康;杨彤涛;周勇;马保安;赵廷宝;卞娜;蔡成魁;颜世举;王鑫;马琼;沙浩;董川【摘要】Objective:This study aimed to construct a lentiviral expression vector for microRNA-194 and investigate its effect on the metastasis of human osteosarcoma cell line U2-OS. Methods:Pri-and mature miR-194 amplified by PCR were inserted into the plenty-GFP vector and identifiedby restriction endonuclease digestion and nucleotide sequencing. The osteosarcoma cell line U2-OS was transfected with the lentivirus. Then, the stable transfected cells were used in Transwell and wound healing assay. Results:Restric-tion analysis and sequencing showed that the recombinant lentiviral expression vector was constructed correctly. The titers of obtained overexpression and suppression expression recombinant lentivirus were 1.5*108 and 4*108 TU/ml. Cell metastasis ability was signifi-cantly different in different experimental groups (P<0.01). Conclusion:The lentiviral expression vector for microRNA-194 was suc-cessfully constructed. MicroRNA-194 could influence the metastasis of the osteosarcoma cell line U2-OS;thus, it could be further ex-plored as a potential target in osteosarcoma therapy.%目的：通过构建携带针对miR-194的慢病毒沉默及过表达载体，研究miR-194对骨肉瘤细胞转移的影响。
crispr-cas9进行全基因组的筛选
crispr-cas9进行全基因组的筛选Human CRISPR Knockout Pooled Library (Brunello) 一、lentiCas9-Blast质粒的基本信息：/pooled-library/broadgpp-human-knockout-b runello/由于cas9自待的抗性基因是我们不需要，在抗性基因两边突变出酶切位点，酶切掉原本的抗性基因。
换成另一种。
1.lentiCas9-Blast质粒购买来时是以细菌的形式存在的,先需要扩大培养。
2.试剂盒提取质粒，并测定浓度。
二、慢病毒包装质粒1转染前24 h，用胰蛋白酶消化对数生长期的HEK293T细胞，调整细胞为7*105在5ml的DMEM培养基中。
37 ℃、5% CO2培养箱内培养。
待细胞密度达70%～80%时即可用于转染。
2转染前2 h将细胞培养基更换为无血清培养5每瓶细胞中加入含10% 血清的细胞培养基25 ml，于37 ℃、5% CO2培养箱内继续培养48小时。
6收集转染后48小时（转染即可为0小时计起）的293T细胞上清液。
7于4 ℃，4000 g 离心10 min，除去细胞碎片。
8以0.45 μm滤器过滤上清液于15ml 离心管中。
三、慢病毒转染细胞参考网址：/protocols/generatin g-stable-cell-lines/1. 取六孔板铺50000个细胞， 37°C,5% CO 2 培养，待细胞长到70%，换含有8ug/ml polybrene的培养基培养。
2. 慢病毒悬液用含有10ug/ml的DMEM培养基稀释。
3. 六孔板中每个空加一种浓度的病毒稀释液，每空0.5ml。
4. 孵育48~72小时。
5. 换成含有适宜浓度的抗生素的培养基培养1.5ml，筛选出转染成功的细胞。
抗生素浓度的摸索:用培养基稀释抗生素为1ug/ml、2ug/ml、3 ug/ml、4 ug/ml、5 ug/ml、6 ug/ml、7 ug/ml、8 ug/ml、9 ug/ml、10 ug/ml，并用稀释后的浓度培养细胞，3~5天内使所有细胞死亡的最低浓度可用于筛选细胞。
Addgene---2016年最火的慢病毒质粒和腺病毒质粒
Addgene---2016年最⽕的慢病毒质粒和腺病毒质粒 2016年七⽉，Addgene推出了病毒服务，开始为世界各地的科学家提供可⽴即使⽤的慢病毒和腺相关病毒（AAV）。
最初只有⼏种有限的产品可以在美国供给，但到了2016年底，Addgene扩⼤其病毒库存⾄：25种慢病毒和25种腺病毒。
这些病毒被包装成200多个包裹，然后分发到全球20多个国家。
在初步的成功后，Addgene将继续提供和扩⼤这种多样化且有⽤的⼯具组合，使世界各地的研究⼈员可以加快他们的⼯作。
那么，你是否好奇：到⽬前为⽌，全球研究⼈员发现最有⽤的是哪种病毒质粒？为此，Addgene对现有的病毒服务进⾏了数据统计，并找到了2016年最⽕的慢病毒质粒和腺相关病毒质粒。
TOP慢病毒质粒:lentiCas9-BlastTipsAddgene⼤部分病毒库存是基于CRISPR⼯具，虽然我们提供⼀些⾮CRISPR相关的包装后病毒。
Cas9是⼤多数CRISPR应⽤的头条新闻，并且可以在你选择的细胞系转然这种病毒后进⾏表达。
⽽各种已设计完成的Cas9突变体可以完成独特的编辑任务，如lenticas9-Blast表达的经典Cas9核酸酶，可以介导DNA双链断裂。
Cas9的表达有典型的细胞毒性，所以，在得到⾼滴度的Cas9慢病毒时会遇到困难。
当利⽤lenticas9-Blast产⽣ Cas9表达细胞时，这种细胞毒性也会导致⽣长率的变化。
为了确保这种⽣长率的影响不混淆你的实验数据，Addgene建议在进⾏筛选甚⾄单基因敲除之前，产⽣单克隆Cas9表达细胞系。
Top AAV: pAAV-hSyn-DIO-hM4D(Gi)-mCherry当第⼀次使⽤这种病毒时，Roth实验室建议使⽤前先进⾏Cre重组酶表达的验证。
当对固定组织中的hM4D(Gi)-mCherry进⾏可视化时，实验室还建议使⽤抗mCherry的抗体⽽不是内源性的mCherry荧光。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
Addgene---2016年最火的慢病毒质粒和腺病毒质粒
2016年七月，Addgene推出了病毒服务，开始为世界
各地的科学家提供可立即使用的慢病毒和腺相关病毒（AAV）。
最初只有几种有限的产品可以在美国供给，但到
了2016年底，Addgene扩大其病毒库存至：25种慢病毒和25种腺病毒。
这些病毒被包装成200多个包裹，然后分发
到全球20多个国家。
在初步的成功后，Addgene将继续提供和扩大这种多样化且有用的工具组合，使世界各地的研究人员可以加快他们的工作。
那么，你是否好奇：到
目前为止，全球研究人员发现最有用的是哪种病毒质粒？为此，Addgene对现有的病毒服务进行了数据统计，并找到了2016年最火的慢病毒质粒和腺相关病毒质粒。
TOP慢病毒质粒: lentiCas9-Blast TipsAddgene大部分
病毒库存是基于CRISPR工具，虽然我们提供一些非CRISPR相关的包装后病毒。
Cas9是大多数CRISPR应用的头条新闻，并且可以在你选择的细胞系转然这种病毒后进行表达。
而各种已设计完成的Cas9突变体可以完成独特的编辑任务，如lenticas9-Blast表达的经典Cas9核酸酶，可以介导DNA双链断裂。
Lenticas9-Blast
（https:///52962/）是一个Cas9表达载体，是由Broad Institute 的张锋实验室发表的（Sanjana et al.，
2014）。
它是一个二元载体系统，即通常需要与一个传递gRNA的第二载体结合使用，例如：lentiGuide-Puro。
而单载体系统通常在同一个质粒中表达Cas9和gRNA。
lenticas9-Blast病毒可以用来产生Cas9的表达细胞系，可
用于筛选（using pooled CRISPR knockout libraries）和个别基因的敲除（using gRNA lentiviruses）。
Cas9的表达有
典型的细胞毒性，所以，在得到高滴度的Cas9慢病毒时会遇到困难。
当利用lenticas9-Blast产生Cas9表达细胞时，这种细胞毒性也会导致生长率的变化。
为了确保这种生长率的影响不混淆你的实验数据，Addgene建议在进行筛选甚至单基因敲除之前，产生单克隆Cas9表达细胞系。
Top AAV: pAAV-hSyn-DIO-hM4D(Gi)-mCherry
Addgene目前的AAV库存几乎完全来自于北卡罗来纳州大学的Bryan Roth实验室中表达DREADD（Designer Receptors Exclusively Activated by Designer Drugs）的病毒。
这些可以用来研究在特定的细胞类型（典型的神经元）中激活特定的信号通路的影响。
而这类病毒几乎都很受欢迎，PAAV-hSyn-DIO-hM4D(Gi)-mCherry
（https:///44362/）包含一个融合了mCherry的双floxed人毒蕈碱受体4（Gαi耦合）DREADD，其受人突触蛋白启动子的控制。
当第一次使用这种病毒时，Roth实验室建议使用前先进行Cre重组酶表达的验证。
当
对固定组织中的hM4D(Gi)-mCherry进行可视化时，实验室还建议使用抗mCherry的抗体而不是内源性的mCherry荧光。
关于本文的更多详细内容，可在Addgene网站上
/top-requested-lentiviruses-and-aa v-of-2016查询。