根癌农杆菌介导的遗传转化
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4、影响根癌农杆菌介导的丝状真菌遗传转化效率的因素
转化效率高低是衡量一个转化系统好坏的重要指标．研究表明转化条件对农杆菌介导的遗传转化效率有明显的影响。影响转化效率的因素包括农杆菌菌株的类型、真菌受体类型、转化细胞的浓度、已酰丁香酮的用量、共培养时间和温度等。
4.1农杆菌菌株对转化效率的影响
能够转化丝状真菌的农杆菌有很多种，目前比较不同菌株对转化效率影响的实验还很少，因此不能判断哪个是最有效的转化菌株［2］。但是可以肯定菌株类型对转化效率是有影响的，而一些菌株根本不能用于特定真菌的转化。
3、根癌农杆菌介导的丝状真菌遗传转化的特点
通过基因插入失活获得能覆盖整个基因组的突变体库是功能基因组学研究的基础性工作，但是建立真菌突变体库的传统方法都存在缺点．如转座子法的插入位点不完全随机，而且倾向于插入非编码位点；REMI导致较高比例的非质粒插入突变体，而且易产生多拷贝插入，这给突变体分析带来很多麻烦。相对于转座子和REMI技术，农杆菌介导的真菌转化具有以下四个特点：
2、丝状真菌ATMT转化大致过程
丝状真菌ATMT遗传转化过程比较简单，不需要复杂的仪器设备，且基本相同，依次为构建二元载体、活化根癌农杆菌、准备真菌分生孢子和共转化，大致如下：根据实验目的构建二元载体，挑取携有双元载体的根癌农杆菌单菌落到含有相应抗生素的基本培养（minimalmedium，MM)中培养过夜；收集菌体用诱导培养液（inductionmedium，IM)洗涤并稀释至一定的浓度后待用［或在含有乙酰丁香酮（AS，acetosyringone)的诱导培养液中培养后再使用］；取前述农杆菌液与等量新鲜的真菌受体混合，并涂布于固体共培养基（co-cultivationmedium，CM)承载的滤膜上（或以液体形式混合振荡培养)，恒温培养一段时间；洗脱（或吸取)共培养物，涂布选择性平板，培养至菌落形成后挑取转化子，将抗性菌落转移至新鲜含有适宜抗生素的培养基上培养，收集菌丝体．提取抗性菌落的基因组DNA， 通过Southern杂交来鉴定阳性转化子和确定插入T-DNA 的拷贝数，以及通过TAIL-PCR（thermal asvmmetric interlaced PCR)技术来获取T-DNA 的侧翼序列。
4.2真菌受体对转化效率的影响
选择合适的受体组织对于实现丝状真菌高效快捷的转化非常重要。大多数丝状真菌很容易培养产生大量的分生孢子，因此采用孢子或刚萌发的孢子作为受体通常是真菌转化中最方便高效的选择［8］。对于产孢子能力差甚至于不产孢的菌株，可以直接以菌丝体组织为受体进行转化操作。采用不同受体组织，转化效率往往会受到影响。
4.5转化时间对转化效率的影响
转化时间是影响转化效率的另一因素．一些研究也证明48h为最佳共培养时间［14］，随着共培养时间的延长，抗性转化子的数目也随之增多。但是对于不同的丝状真菌来说．所采用的共培养时间差异很大［15］。
4.6转化温度对转化效率的影响
共转化温度也是影响转化效率的重要因素．研究者对20～37℃这一温度范围农杆菌的转化效率进行了研究．认为22～25℃是最适的转化温度［16］。过高的转化温度会使农杆菌的转化功能丧失，从而导致转化效率降低。
4.4菌体浓度对转化效率的影响
转化受体的细胞浓度和农杆菌的浓度都影响转化效率。较高的受体孢子浓度转化率相对较高。同样使用较高浓度的农杆菌也可以提高转化效率。但是对这两个因素来说其最高使用浓度都有一定的界限［12］．当受体真菌的细胞浓度过高时则导致真菌的过量生长而不能挑出转化子，使转化效率降低。［13］同样原因，当农杆菌浓度过高时由于农杆菌过度生长引起严重污染，也会导致转化率下降。
3.1多种类型转化受体
很多真菌在DNA 转化时仍然需要制备原生质体。不同真菌原生质体制备的条件差异很大，因此往往碰到原生质体制备率或再生率低［5］等问题。而ATMT转化的受体材料可以是多种类型的，既可以用原生质体，也可以用分生孢子、菌丝甚至真菌组织体［6］。
3.2转化效率高
同传统的真菌转化方法，如PEG．CaCI2法相比，ATMT方法的转化效率有明显提高。研究表明农杆菌介导丝状真菌的转化效率一般在300～7200个转化子每107个细胞． 比一般真菌转化方法高100～1000倍［6］。
与根癌农杆菌介导植物遗传转化相似，农杆菌转化真菌时，同样需要vir（virulence)基因的活化，即T-DNA（transferred DNA)转移至真菌同植物一样是依赖于毒性系统的。Michieise等利用一系列毒性蛋白基因缺失的农杆菌突变体转化Aspergillusawamori，以阐明不同毒性蛋白在T-DNA转移至A．awamori的作用。研究结果显示，任何一个调节蛋白（VirA，VirG)，或者是转运通道蛋白（virB)，或是T链复合物形成蛋白（VirD，VirC，VirE2)的失活都会严重的降低转化效率。这一结果表明，农杆菌介导A．awamori的高效转化需要一个完整的T-DNA转移机制。这些都证明农杆菌转化高等和低等真核生物的机理具有一定的保守性。然而，Michielse等的研究也显示，VirE3，VirH，VirF毒性蛋白，在农杆菌转化A．awamori的过程中并不是必需的。另有研究表明控制农杆菌向植物细胞附着的chvA，chvB及exoC基因在酵母的转化中也并非必不可少。因此，根癌农杆菌转化真菌的机理还需要由更多相关的试验研究来阐明。
［关键词］根癌农杆菌；丝状真菌；遗传转化
丝状真菌（filamentous fungi)是真菌中一个很大类群，通常指那些菌丝体比较发达而又不产生大型子实体的真菌。其在自然条件下常引起食物、工农业产品的霉变和植物的真菌病害，在工业、农业、医药及基础生物学研究中具有重要作用。丝状真菌中很多种具有重要的经济价值，还有一些是昆虫、植物、动物和人类的重要致病菌，如绿僵菌（Metarhizium anisopliae)、稻瘟菌（Magnaporthe grisea)和烟曲霉（Aspergillus fumigatus)等。而构巢曲霉（Aspergillus nidulans)和粗糙脉孢霉（Neurospora crassa)由于结构简单，通常被作为真核微生物的“模式”种用于基础研究［1］。由于丝状真菌在经济上和科学中的重要性，多年来一直被广泛地研究。
根癌农杆菌介导丝状真菌遗传转化的研究进展
摘要：根癌农杆菌介导的遗传转化系统因具有操作简便，转化效率高，容易得到单拷贝随机插入的转化子，并且转化子稳定等特点而成为近年来丝状真菌遗传转化的主要研究手段之一，也使该系统有可能成为丝状真菌基因组研究的有力工具。本文就根癌农杆菌转化丝状真菌原理、过程、种类、影响转化效率的因素及其应用等方面进行了综述。
1、根癌农杆菌介导遗传转化的丝状真菌的原理和种类
根癌农杆菌是革兰氏阴性土壤杆菌．自然情况下它可通过伤口侵入植物导致受伤部位产生瘿瘤，并将其T-DNA序列转入植物细胞并整合到植物染色体上［3］．利用这一原理得到第一批能表达外源基因的转基因植物。根癌农杆菌正被广泛地应用到植物的遗传转化中。在大肠杆菌与酵母菌能够通过接合的方式将前者的质粒转移到后者［4］和农杆菌转化植物等现象的启下，Bundock 等人尝试用根癌农杆菌介导酵母菌的遗传转化，发现根癌农杆菌可以转化酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)［5］，显示了根癌农杆菌能够转化除植物以外的其他物种。许多科研工作者也纷纷投入到利用该方法对其他真菌的遗传转化的工作中，拓宽了根癌农杆菌的转化范围。
5.2利用基因插入突变标记、克隆相关基因
插入突变是另一个反向遗传学的研究方法［19］。当T-DNA中不存在与受体染色体同源序列时，T-DNA主要以异源重组形式整合进染色体基因组中。因此，可利用T-DNA 标签法产生插入突变从而分离克隆真菌相关基因［20］。
6、前景及展望
真菌的遗传转化的效率极大的影响着真菌功能基因组学研究的开展和深入。根癌农杆菌介导的丝状真菌的转化，克服了丝状真菌用常规转化方法转化率低、操作繁杂等缺点。也正由于这一转化系统具有操作简便、转化高效稳定、T-DNA在真菌染色体基因组中的随机插入以单位点为主、位点整合精确且可转移大片段DNA等优点，非常适合于构建各种真菌的随机插入突变体库，有利于新基因的标记和快速克隆［21］，使该系统成为丝状真菌基因组研究的有力工具，并显示出了良好的发展潜力，具有广阔的应用前景［22］。相信随着对农杆菌介导真菌遗传转化各个因素的进一步深入研究和探讨， 更多的真菌将会利用该方法成功地实现遗传转化。
近年来发展了很多转化的方法，但并非所有方法都适用于丝状真菌。以往丝状真菌的常规转化方法有PEG介导的原生质体转化，限制酶介导的插入突变（Restriction enzyme-mediated insertional，REMI)等，但是这些转化技术或需要制备原生质体、或转化效率低．阻碍了它们在研究丝状真菌功能基因中的应用。根癌农杆菌介导的转化体系（Agrobacterium tumefaciens mediated transformation，ATMT)克服了这些缺点．为丝状真菌的遗传转化和功能基因研究提供了有力的工具，现已被广泛地运用于丝状真菌的遗传操作目前已经实现了对泡盛曲霉（Aspergilus awamori)、粗糙脉孢菌（Neurospora crassa)、尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum)和瓜类炭疽（Colletotrichum lagenarium)等60多种真菌的遗传转化［2］。
4.3乙酰丁香酮对转化效率的影响
Michielse等研究表明农杆菌介导的真菌转化系统和植物转化系统的原理相同，都需要一系列Vir蛋白的参与．其中VirF、VirH和VirE3是丝状真菌转化不可缺少［9］。乙酰丁香酮（AS)在转化中的作用是诱导Vir毒蛋白的产生。研究表明AS是转化成功与否的决定性因素．对Beauveria bassiana、Fusarium oxysporum和Trichode viride等真菌的转化条件研究表明．在诱导过程中不加入AS会导致转化效率的降低［10］。而共培养过程中缺少AS会导致无转化子的产生［11』另外乙酰丁香酮在诱导和共转化过程中的浓度也影响转化效率。
参考文献
[1]Yan PS (闫培生), Luo XC (罗信昌), Zhou Q (周启). Advanceand prospectof filamentous fungi gene engineering.ProgBiotech(生物工程进展), 1999,19: 36～41
[2] Michielse CB,Hoykaas PJ,v&n den Hondel CA,et 01．Agrobacterium-mediated transformation as tool for functional genomics in fungi[J]．Gurr Genet,2005,48:1
5、根癌农杆菌介导真菌遗传转化的应用
5.1利用基因敲除研究基因功能
利用基因敲除方法可为研究基因功能提供最直接最有力的证据［17］。当T-DNA中含有与宿主基因组同源的序列时，T-DNA就会以同源重组的方式整合进基因组，并且双交换同源重组占相当比例［18］。因此，将目标基因的部分序列克隆至T-DNA 两个边界之间，构建目标基因的打靶载体，然后利用Baidu Nhomakorabea杆菌介导进行转化，就可以实现目标基因的敲除，进而根据表型变化来研究该基因的功能。
3.3随机插入单拷贝
ATMT的非同源转化，大部分转化子为单拷贝的T-DNA 插入。转化子基因组中T-DNA插入比例高，且多为单拷贝插入。REMI方法转化的突变体20％～100％都不是由DNA插入引起的，而农杆菌转化的突变体有90％以上都是由DNA插入引起的［7］。
3.4转化子稳定
农杆菌介导的丝状真菌遗传转化体系可以利用各种形式的受体．因此当采用具有单核的分生孢子为转化受体时可以得到后代不分离的转化子，避免了真菌菌丝多核所造成的转化子不稳定的难题。而转座子法和REMI等转化方法都需要采用多核的菌丝为原料置备原生质体，产生不稳定的转化后代。
转化效率高低是衡量一个转化系统好坏的重要指标．研究表明转化条件对农杆菌介导的遗传转化效率有明显的影响。影响转化效率的因素包括农杆菌菌株的类型、真菌受体类型、转化细胞的浓度、已酰丁香酮的用量、共培养时间和温度等。
4.1农杆菌菌株对转化效率的影响
能够转化丝状真菌的农杆菌有很多种，目前比较不同菌株对转化效率影响的实验还很少，因此不能判断哪个是最有效的转化菌株［2］。但是可以肯定菌株类型对转化效率是有影响的，而一些菌株根本不能用于特定真菌的转化。
3、根癌农杆菌介导的丝状真菌遗传转化的特点
通过基因插入失活获得能覆盖整个基因组的突变体库是功能基因组学研究的基础性工作，但是建立真菌突变体库的传统方法都存在缺点．如转座子法的插入位点不完全随机，而且倾向于插入非编码位点；REMI导致较高比例的非质粒插入突变体，而且易产生多拷贝插入，这给突变体分析带来很多麻烦。相对于转座子和REMI技术，农杆菌介导的真菌转化具有以下四个特点：
2、丝状真菌ATMT转化大致过程
丝状真菌ATMT遗传转化过程比较简单，不需要复杂的仪器设备，且基本相同，依次为构建二元载体、活化根癌农杆菌、准备真菌分生孢子和共转化，大致如下：根据实验目的构建二元载体，挑取携有双元载体的根癌农杆菌单菌落到含有相应抗生素的基本培养（minimalmedium，MM)中培养过夜；收集菌体用诱导培养液（inductionmedium，IM)洗涤并稀释至一定的浓度后待用［或在含有乙酰丁香酮（AS，acetosyringone)的诱导培养液中培养后再使用］；取前述农杆菌液与等量新鲜的真菌受体混合，并涂布于固体共培养基（co-cultivationmedium，CM)承载的滤膜上（或以液体形式混合振荡培养)，恒温培养一段时间；洗脱（或吸取)共培养物，涂布选择性平板，培养至菌落形成后挑取转化子，将抗性菌落转移至新鲜含有适宜抗生素的培养基上培养，收集菌丝体．提取抗性菌落的基因组DNA， 通过Southern杂交来鉴定阳性转化子和确定插入T-DNA 的拷贝数，以及通过TAIL-PCR（thermal asvmmetric interlaced PCR)技术来获取T-DNA 的侧翼序列。
4.2真菌受体对转化效率的影响
选择合适的受体组织对于实现丝状真菌高效快捷的转化非常重要。大多数丝状真菌很容易培养产生大量的分生孢子，因此采用孢子或刚萌发的孢子作为受体通常是真菌转化中最方便高效的选择［8］。对于产孢子能力差甚至于不产孢的菌株，可以直接以菌丝体组织为受体进行转化操作。采用不同受体组织，转化效率往往会受到影响。
4.5转化时间对转化效率的影响
转化时间是影响转化效率的另一因素．一些研究也证明48h为最佳共培养时间［14］，随着共培养时间的延长，抗性转化子的数目也随之增多。但是对于不同的丝状真菌来说．所采用的共培养时间差异很大［15］。
4.6转化温度对转化效率的影响
共转化温度也是影响转化效率的重要因素．研究者对20～37℃这一温度范围农杆菌的转化效率进行了研究．认为22～25℃是最适的转化温度［16］。过高的转化温度会使农杆菌的转化功能丧失，从而导致转化效率降低。
4.4菌体浓度对转化效率的影响
转化受体的细胞浓度和农杆菌的浓度都影响转化效率。较高的受体孢子浓度转化率相对较高。同样使用较高浓度的农杆菌也可以提高转化效率。但是对这两个因素来说其最高使用浓度都有一定的界限［12］．当受体真菌的细胞浓度过高时则导致真菌的过量生长而不能挑出转化子，使转化效率降低。［13］同样原因，当农杆菌浓度过高时由于农杆菌过度生长引起严重污染，也会导致转化率下降。
3.1多种类型转化受体
很多真菌在DNA 转化时仍然需要制备原生质体。不同真菌原生质体制备的条件差异很大，因此往往碰到原生质体制备率或再生率低［5］等问题。而ATMT转化的受体材料可以是多种类型的，既可以用原生质体，也可以用分生孢子、菌丝甚至真菌组织体［6］。
3.2转化效率高
同传统的真菌转化方法，如PEG．CaCI2法相比，ATMT方法的转化效率有明显提高。研究表明农杆菌介导丝状真菌的转化效率一般在300～7200个转化子每107个细胞． 比一般真菌转化方法高100～1000倍［6］。
与根癌农杆菌介导植物遗传转化相似，农杆菌转化真菌时，同样需要vir（virulence)基因的活化，即T-DNA（transferred DNA)转移至真菌同植物一样是依赖于毒性系统的。Michieise等利用一系列毒性蛋白基因缺失的农杆菌突变体转化Aspergillusawamori，以阐明不同毒性蛋白在T-DNA转移至A．awamori的作用。研究结果显示，任何一个调节蛋白（VirA，VirG)，或者是转运通道蛋白（virB)，或是T链复合物形成蛋白（VirD，VirC，VirE2)的失活都会严重的降低转化效率。这一结果表明，农杆菌介导A．awamori的高效转化需要一个完整的T-DNA转移机制。这些都证明农杆菌转化高等和低等真核生物的机理具有一定的保守性。然而，Michielse等的研究也显示，VirE3，VirH，VirF毒性蛋白，在农杆菌转化A．awamori的过程中并不是必需的。另有研究表明控制农杆菌向植物细胞附着的chvA，chvB及exoC基因在酵母的转化中也并非必不可少。因此，根癌农杆菌转化真菌的机理还需要由更多相关的试验研究来阐明。
［关键词］根癌农杆菌；丝状真菌；遗传转化
丝状真菌（filamentous fungi)是真菌中一个很大类群，通常指那些菌丝体比较发达而又不产生大型子实体的真菌。其在自然条件下常引起食物、工农业产品的霉变和植物的真菌病害，在工业、农业、医药及基础生物学研究中具有重要作用。丝状真菌中很多种具有重要的经济价值，还有一些是昆虫、植物、动物和人类的重要致病菌，如绿僵菌（Metarhizium anisopliae)、稻瘟菌（Magnaporthe grisea)和烟曲霉（Aspergillus fumigatus)等。而构巢曲霉（Aspergillus nidulans)和粗糙脉孢霉（Neurospora crassa)由于结构简单，通常被作为真核微生物的“模式”种用于基础研究［1］。由于丝状真菌在经济上和科学中的重要性，多年来一直被广泛地研究。
根癌农杆菌介导丝状真菌遗传转化的研究进展
摘要：根癌农杆菌介导的遗传转化系统因具有操作简便，转化效率高，容易得到单拷贝随机插入的转化子，并且转化子稳定等特点而成为近年来丝状真菌遗传转化的主要研究手段之一，也使该系统有可能成为丝状真菌基因组研究的有力工具。本文就根癌农杆菌转化丝状真菌原理、过程、种类、影响转化效率的因素及其应用等方面进行了综述。
1、根癌农杆菌介导遗传转化的丝状真菌的原理和种类
根癌农杆菌是革兰氏阴性土壤杆菌．自然情况下它可通过伤口侵入植物导致受伤部位产生瘿瘤，并将其T-DNA序列转入植物细胞并整合到植物染色体上［3］．利用这一原理得到第一批能表达外源基因的转基因植物。根癌农杆菌正被广泛地应用到植物的遗传转化中。在大肠杆菌与酵母菌能够通过接合的方式将前者的质粒转移到后者［4］和农杆菌转化植物等现象的启下，Bundock 等人尝试用根癌农杆菌介导酵母菌的遗传转化，发现根癌农杆菌可以转化酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)［5］，显示了根癌农杆菌能够转化除植物以外的其他物种。许多科研工作者也纷纷投入到利用该方法对其他真菌的遗传转化的工作中，拓宽了根癌农杆菌的转化范围。
5.2利用基因插入突变标记、克隆相关基因
插入突变是另一个反向遗传学的研究方法［19］。当T-DNA中不存在与受体染色体同源序列时，T-DNA主要以异源重组形式整合进染色体基因组中。因此，可利用T-DNA 标签法产生插入突变从而分离克隆真菌相关基因［20］。
6、前景及展望
真菌的遗传转化的效率极大的影响着真菌功能基因组学研究的开展和深入。根癌农杆菌介导的丝状真菌的转化，克服了丝状真菌用常规转化方法转化率低、操作繁杂等缺点。也正由于这一转化系统具有操作简便、转化高效稳定、T-DNA在真菌染色体基因组中的随机插入以单位点为主、位点整合精确且可转移大片段DNA等优点，非常适合于构建各种真菌的随机插入突变体库，有利于新基因的标记和快速克隆［21］，使该系统成为丝状真菌基因组研究的有力工具，并显示出了良好的发展潜力，具有广阔的应用前景［22］。相信随着对农杆菌介导真菌遗传转化各个因素的进一步深入研究和探讨， 更多的真菌将会利用该方法成功地实现遗传转化。
近年来发展了很多转化的方法，但并非所有方法都适用于丝状真菌。以往丝状真菌的常规转化方法有PEG介导的原生质体转化，限制酶介导的插入突变（Restriction enzyme-mediated insertional，REMI)等，但是这些转化技术或需要制备原生质体、或转化效率低．阻碍了它们在研究丝状真菌功能基因中的应用。根癌农杆菌介导的转化体系（Agrobacterium tumefaciens mediated transformation，ATMT)克服了这些缺点．为丝状真菌的遗传转化和功能基因研究提供了有力的工具，现已被广泛地运用于丝状真菌的遗传操作目前已经实现了对泡盛曲霉（Aspergilus awamori)、粗糙脉孢菌（Neurospora crassa)、尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum)和瓜类炭疽（Colletotrichum lagenarium)等60多种真菌的遗传转化［2］。
4.3乙酰丁香酮对转化效率的影响
Michielse等研究表明农杆菌介导的真菌转化系统和植物转化系统的原理相同，都需要一系列Vir蛋白的参与．其中VirF、VirH和VirE3是丝状真菌转化不可缺少［9］。乙酰丁香酮（AS)在转化中的作用是诱导Vir毒蛋白的产生。研究表明AS是转化成功与否的决定性因素．对Beauveria bassiana、Fusarium oxysporum和Trichode viride等真菌的转化条件研究表明．在诱导过程中不加入AS会导致转化效率的降低［10］。而共培养过程中缺少AS会导致无转化子的产生［11』另外乙酰丁香酮在诱导和共转化过程中的浓度也影响转化效率。
参考文献
[1]Yan PS (闫培生), Luo XC (罗信昌), Zhou Q (周启). Advanceand prospectof filamentous fungi gene engineering.ProgBiotech(生物工程进展), 1999,19: 36～41
[2] Michielse CB,Hoykaas PJ,v&n den Hondel CA,et 01．Agrobacterium-mediated transformation as tool for functional genomics in fungi[J]．Gurr Genet,2005,48:1
5、根癌农杆菌介导真菌遗传转化的应用
5.1利用基因敲除研究基因功能
利用基因敲除方法可为研究基因功能提供最直接最有力的证据［17］。当T-DNA中含有与宿主基因组同源的序列时，T-DNA就会以同源重组的方式整合进基因组，并且双交换同源重组占相当比例［18］。因此，将目标基因的部分序列克隆至T-DNA 两个边界之间，构建目标基因的打靶载体，然后利用Baidu Nhomakorabea杆菌介导进行转化，就可以实现目标基因的敲除，进而根据表型变化来研究该基因的功能。
3.3随机插入单拷贝
ATMT的非同源转化，大部分转化子为单拷贝的T-DNA 插入。转化子基因组中T-DNA插入比例高，且多为单拷贝插入。REMI方法转化的突变体20％～100％都不是由DNA插入引起的，而农杆菌转化的突变体有90％以上都是由DNA插入引起的［7］。
3.4转化子稳定
农杆菌介导的丝状真菌遗传转化体系可以利用各种形式的受体．因此当采用具有单核的分生孢子为转化受体时可以得到后代不分离的转化子，避免了真菌菌丝多核所造成的转化子不稳定的难题。而转座子法和REMI等转化方法都需要采用多核的菌丝为原料置备原生质体，产生不稳定的转化后代。