泛素-蛋白酶体通路-生命科学研究进展

应用实例
• 2003.5 美国食品医药管理局批准应用一种 新型的蛋白酶体抑制剂Velcade（PS-341， 万珂），治疗骨髓瘤； • 2004.4，欧洲药品评价机构也允许Velcade 在欧盟上市（46个国家）； • 雷公藤-雷公藤素也是一种蛋白酶体抑制剂 ，它能通过控制癌细胞的蛋白酶体活性进 而诱发癌细胞凋亡。 • 应用前景广阔
泛素—蛋白酶体途径( upp )的组成
泛素—蛋白酶体途径( upp )由泛素( ubiquitin, ub)以及 一系列相关的酶组成。除泛素以外还包括4 种酶家族:泛素 活化酶( ubiquitin - activating enzyme, E1 ) 、泛素偶连酶(
ubiquitin - conjugating enzymes, E2 s)也称泛素载体蛋白(
泛素介导的蛋白质降解
——2004年诺贝尔化学奖 主讲人：石武良 博士
2011.11.22
蛋白质合成
• 胞质合成途径（游离核糖体） • 内质网合成途径（结合态核糖体）
蛋白质是生命活动的直接执行者，生 命过程中几乎所有的环节都与蛋白质有关 。对于蛋白质的合成取得了辉煌的成就（5 项诺贝尔奖），但对于蛋白质降解这一领 域的研究长期被忽略。
• 蛋白质在行使其功能后，需要在特定的时空条件 下被降解； • 蛋白质在合成、折叠、转运、或行使功能过程中 发生错误或损伤时，需要被及时降解和清除；
• 食物中的蛋白质，也要经过蛋白质降解酶的作用 降解为多肽或氨基酸才能被人体吸收。
蛋白质的降解途径（2种）
• 溶酶体： 不需能量 主要降解细胞外和细胞膜蛋白质
1和3：E1、E2催化的泛素激活反应，消耗ATP；2：E3催化的蛋 白质激活反应，消耗ATP；4：依赖于E3的蛋白质泛素化反应； 5：不依赖于E3的蛋白质泛素化反应；6：26S蛋白体催化蛋白 质水解；7和8：异肽酶催化的水解反应，使泛素游离出来。
去泛素化作用是泛素化过程的逆转。在真核细胞内已发现 多种去泛素化酶,它们能够水解泛素和底物蛋白之间的硫酯键, 还能把错误识别的底物从泛素化复合体中释放出来。它们又可 以分为两类:
黑点表示活性区域，蛋白质降解的场所
泛素化和去泛素化
泛素通过E1和E2被激活的过程称为泛素的活化。 泛素的活化过程是一个依赖ATP的酶促反应：
①首先泛素活化酶( ubiquitin activatingenzyme E1 ) 催化泛 素C 末端的甘氨酸( Gly) 形成Ub－腺苷酸中间产物,然后激 活的泛素C末端被转移至E1酶内Cys残基的－SH键上,形成 高能硫酯键; ②含有高能硫酯键的泛素通过转酰基作用使其进一步转移 到泛素载体蛋白( ubiquitin conjugating enzyme, E2)特异的 Cys残基上,形成E2－Ub巯基酯;E2－Ub巯基酯提供泛素分 子,使泛素C端甘氨酸与底物蛋白的Lys残基的氨基形成共价 键,由第一个泛素单体与底物蛋白内部的Lys残基的ε氨基( 或β氨基)结合;
ห้องสมุดไป่ตู้
HECT型E3 RING finger/U-box型E3 APC复合体 SCF复合体 CUL3-BTB复合体
26S蛋白酶体
蛋白酶体是催化泛素与底物蛋白偶联体降解的关键酶,包括 20 s蛋白酶体和26 s蛋白酶体。26 s是由20 s和19 s复合体共同结 合装配而成,此组装过程需要耗能。20 s蛋白酶体是主要起催化 作用的复合体,它由14个不同的蛋白组装成一个筒状结构,由内层 2个β环和外层2个α环组成, 每个环含有7个亚基,基本结构可书写 成α7β7β7α7。α亚基主要用于底物识别,β亚基主要参与底物降 解。19 s复合体由17或18个亚基组成,在特定条件下又可分成2个 次级复合物,一个叫盖子( lid) ,一个叫底座( base) 。底座由10个亚 基组成,其中6个有ATP酶活性,它们与底物泛素化有关,盖子由8个 没有ATP酶活性的亚基组成,其中一个亚基Rpn11 /Pda / s13在泛 素循环方面起重要作用。
泛素含有76个氨基酸
残基,广泛存在于真核生物, 目前尚未发现泛素存在于 原核生物中，泛素的氨基 酸序列极其保守。泛素基 因主要编码两种泛素前体 蛋白质:一种是多聚泛素,
另一种是泛素融合蛋白。
泛素—蛋白酶体途径( upp ) 一系列相关的酶
E1（泛素激活酶）
• 泛素活化酶(ubqiuitin-activating enzyme,简称E1)是催化泛素 与底物结合所需的第一个酶。 •分子量110-130kDa，由1100个左右氨基酸残基组成，对靶蛋白 的识别几乎没有特异性。 •拟南芥E1由单基因编码的大小分别为110kDa和117kDa的两个亚 基组成。 •E1活性很高，低浓度即可激活泛素。
26S蛋白酶体的结构
细胞内的废弃物处理装置 ——蛋白酶体
一个细胞大约含30000个细胞废弃物处理装置即蛋白 酶复合体——蛋白酶体，这些桶状结构可以几乎将所有蛋 白质分解为7-9个氨基酸长度的缩氨酸，蛋白酶体的活性 表面在桶状结构的内部。蛋白酶体能辨别出与泛素结合的 蛋白质，一旦作为标签的泛素脱离蛋白质，即可利用三磷 酸腺苷提供的能量改变蛋白质的性质使其从一端进入蛋白 酶复合体内发生降解，并最终以缩氨酸的形式从另一端释 放出来。这一过程如此复杂，需要消耗能量。然而蛋白酶 体并不能选择待降解的蛋白质，细胞内主要是通过E3类酶 的特异性选择并利用泛素加以标签，从而选择正确的待降 解蛋白质。
E2（泛素结合酶）
泛素偶连酶( E2 )是泛素与蛋白底物结合所需的第二个 酶。拟南芥基因组中至少存在37个E2基因，分为12个 亚族。 E2有一个由150个氨基酸残基（分子量14-16kDa）组 成的保守区域,含有半胱氨酸残基，接受从E1-泛素复 合物转移过来的活化的泛素分子，形成E2-泛素复合物； 在E3的协同作用下，E2-Ub复合物把活化的泛素分子 转移到底物蛋白上，形成单泛素化蛋白或者多聚泛素
泛素—蛋白酶体途径( upp ) 介导的蛋白水解过程
由泛素介导的蛋白水解过程,分为2个阶段。第一阶段: 多个泛素分子与靶蛋白共价结合。首先,泛素经泛素活化 酶E1 活化,泛素上76位的Gly与泛素活化酶上特殊的Cys残 基形成一个高能硫酯键,并伴有ATP水解; 然后,通过转酯作 用,泛素从泛素活化酶转移到泛素结合酶E2 的Cys上,形成泛 素结合酶- 泛素;最后,在泛素连接酶E3 参与下,泛素又从泛 素结合酶转移到受体蛋白(靶蛋白)的Lys残基上,形成泛素靶蛋白,使靶蛋白发生泛素化。多个遍泛素分子重复地附 加到靶蛋白上,则形成分枝的多Ub链。泛素共有7个Lys残基 ,在多聚泛素链结构中,其中一个泛素的C - 末端Gly与相邻的 泛素之间通过Lys48、Lys63或Lys29连接。
意义
了解了泛素为媒介的蛋白质裂解作用和 过程，使得科学家对细胞如何控制及分裂蛋 白质的研究有可能深入到分子层级。而当蛋 白质裂解作用发生异常时，人体就会产生不 适甚至疾病，如子宫颈癌症和囊肿纤维症等， 因此，从分子层面角度去了解泛素调节的蛋 白质降解的化学过程和机理，及对生命过程 进一步的探索，具有十分重要的应用意义。
UPP参与的生物学功能
1、抗原提呈：抗原分子泛素化后被26 s蛋白酶体 降解成多肽,然后由组织相容性复合体(MHC) I类 分子提呈到细胞表面,再被细胞毒性T细胞(CTL) 识别。 2、调节细胞周期： UPP调节降解调节蛋白,如细胞 周期因子、信号传导蛋白等,在控制细胞周期尤 其是生殖细胞方面起重要作用。细胞周期因子 先被泛素化,然后由26 s蛋白酶体降解,导致周期 因子依赖的激酶失活,从而使细胞有丝分裂期中 止。细胞周期因子- 周期因子依赖的激酶复合体 可由它们特定的抑制因子使其失活,这些抑制因 子也由泛素- 蛋白酶体途径降解。
第二阶段: 靶蛋白在26 s蛋白酶体的作用下,由泛素介导的蛋白水解过程。 经泛素活化的底物蛋白被展平后,通过两个狭孔,进入26 s蛋白酶体的催化 中心,蛋白降解在20 s蛋白酶体内部发生。进入26 s蛋白酶体的底物蛋白质 被多次切割,最后形成3～22个氨基酸残基的小肽。 整个流程分为以下六个步骤： 1、E1类酶激活泛素，该过程需要ATP（三磷酸腺苷）提供一定能量； 2、泛素转移至E2类酶； 3、E3类酶具有特异性，可以识别出需破坏的目标蛋白质，与目标蛋白质 接近的E2-泛素复合体将泛素转移至目标蛋白质； 4、E3类酶释放出被泛素标记的蛋白质； 5、被标记的蛋白质分子尾端形成一小段泛素分子链； 6、泛素分子链在蛋白酶体的端口被识别并脱离蛋白质，目标蛋白质进入 蛋白酶复合体的桶状通道最终降解为缩氨酸并由另一端口释放出去。
（1）泛素羧端水解酶( ubiquitin C - terminal hydrolases (UCHs) )：分子 量为20～30 KD,水解去除和泛素C末端连接的小肽,也参与泛素多聚体 产生泛素单体的过程,促进泛素再循环,对泛素系统的正常运行是很有 必要的。 （2）泛素特异性加工酶( ubiquitin - spicific prote2ases - UBPs/USPs)： 分子量大约为100 KD,参与去除和解聚底物蛋白质上的多聚泛素键,从 而防止多聚泛素在底物蛋白的聚集。
Road map of protein sorting
Functions of cytoplasmic matrix:
The protein synthesis, degradation and modification.
Cells carefully monitor the amount of misfolded proteins. An accumulation of misfolded proteins in the cytosol triggers a heatshock response, which stimulates the transcription of genes encoding cytosolic chaperones that help to refold the proteins.
③泛素可以直接从E2转移给底物蛋白形成Ub蛋白复合物,这时 的底物多是些碱性蛋白(如组蛋白) ,而在大多数情况下,底物蛋 白先与泛素连接酶( ubiquitin ligating enzyme, E3)特异性结合,E3 可使E2和底物蛋白相互接近,继而蛋白底物与E2酶连接的泛素 结合,这样就完成了底物蛋白质的泛素化。
2004年
2004年10月16日瑞典皇家科学院将该年度诺贝尔化学奖授予 以色列科学家阿龙· 切哈诺沃、阿夫拉姆· 赫什科和美国科学家欧 文· 罗斯，以表彰他们在泛素调节的蛋白质降解研究领域中的卓越 成就。
蛋白质降解
调控动植物体内几乎所有的生命活动（细胞增殖、 分化、凋亡、DNA复制和修复、转录和蛋白质质 量控制等，参与病原体的入侵、致病和免疫等过 程）：
• 泛素-蛋白酶体通路： 需能 高效、特异的蛋白质降解过程，控 制着动植物体内绝大多数蛋白质的降解
泛素-蛋白酶体通路概述
蛋白质的降解是一个精细控制的过程，首先有待降 解的蛋白质被一种多肽（称之为泛素）所标记，接着这 些蛋白质进入细胞的蛋白酶复合体中，蛋白酶复合体是 一个上下有盖的圆桶状酵素，它们如同细胞的回收站， 专门负责蛋白质的分解及再循环利用，泛素在这一过程 中释出讯号，让蛋白酶复合体分辨出有待降解的蛋白质。
化蛋白。
E3（泛素连接酶）
E3是泛素蛋白酶体途径中种类最多的一种酶，是在底物的
特异性选择降解过程中作用最为关键成员。它的主要功能 是识别应该被泛素化的靶蛋白，然后使活化的泛素接近特 异靶蛋白的Lys，从而将泛素转移到底物上去。E3分子量 较大，约100-300 kDa。
植物中已鉴定的E3有5类
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ubiquitin -carrier protein) 、泛素-蛋白连接酶( ubiquitin ligating enzymes, E3 s)和蛋白酶体(proteasome) 。蛋白的 泛素化和去泛素化都需要多种酶介导, upp既有高度底物多 样性又具有针对不同调控机制的多样性。
泛素的结构与组成