聚酰胺树脂纯化

第一章前言1.1 甘草简介甘草 (Licorice)是豆科(Leguminosae)蝶形花亚科(Papiliantae Taub)甘草属植物，是一种应用极广的中药，素有“十方九草”之称[1]。

深秋，荚果裂开，籽粒随风散步大地上，天然繁殖。

茎挺拔直立，根如圆柱，直径三四厘米，大的五六厘米，长一米多，最长者达三四米。

甘草多生长在干旱、半干旱的荒漠草原、沙漠边缘和黄土丘陵地带，在引黄灌区的田野和河滩地里也易于繁殖。

它适应性强，抗逆性强，不愧是植物界抗干旱的能手，斗风沙的先锋。

甘草在中草药中具有“众药之王”的美誉，是重要市用中药, 来源于豆科(leguminosae) 植物甘草、欧甘草、胀果甘草的干燥根和茎。

国产甘草主要有：乌拉尔甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch)、胀果甘草(G. inflata Batal)、光果甘草(Glucyrrhizic acid)、黄甘草(G. eurycarpa P.C.Li)、粗毛甘草(Glycyrrhiza aspera Pall.)、云南甘草(Glycyrrhiza yunnanensis Cheng f.et L.K.Ti)、园果甘草(G. squamulosaFranch)、刺果甘草(G. pallidifloraMaxim)、欧甘草(Glycyrrhiza glabra L.)和欧甘草变种(G. glabra var.glandalifera)等。

其中以乌拉尔甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch)分布最广、产量最大[2]。

甘草具有补脾益气，清热解毒，祛痰止咳，缓急止痛，调和诸药的功效。

用于脾胃虚弱，倦怠乏力，心悸气短，咳嗽痰多，脘腹，四肢疼痛，痈肿疮毒，缓解药物毒性、烈性[3]。

1.2 主要有效成分及药理作用国内外学者对甘草的化学成分和药理作用进行了许多研究，主要有效成分是黄酮类化合物和三萜皂苷。

据现有资料报道，甘草的化学组成极为复杂，已从甘草中分离得到100多种黄酮类化合物，60多种三萜类化合物以及香豆素类、18种氨基酸、多种生物碱、雌性激素和多种有机酸等[4]。

其中，黄酮类成分具有明显的抗溃疡、解痉、抗炎、降血脂、镇痛和雌性激素样作用[5]。

近年来还发现甘草黄酮对艾滋病毒(HIV)有很强的抑制增殖作用，对甘草黄酮的研究应用已经引起人们的重视[6]。

1.2.1 甘草黄酮的化学成分近年来的研究表明，甘草中存在着一种重要的生理活性物质，即黄酮类化合物。

黄酮类化合物的基本母核早期是指2-苯基色原酮,近年来泛指两个苯基通过三碳链相连形成的化合物,即具有C6-C3-C6 基本骨架,包括黄酮、黄酮醇、异黄酮、查尔酮及它们的二氢衍生物和黄烷醇、花青素等。

甘草黄酮(Glycyrrhiza flavonoids ,FG) 是从甘草提取物中得到的一类生物活性较强的成分,许多学者对其化学成分进行了大量的研究工作。

邢国秀等人[7]在文章中给出甘草黄酮类150 多个化合物的结构和名称,它们分别属于黄酮类、黄酮醇类、异黄酮类、查尔酮类、双氢黄酮类、双氢查尔酮类等十几大类。

甘草黄酮类的中药化学成分主要有甘草素、异甘草素、甘草甙、异甘草甙、新甘草甙、新异甘草甙等。

1.2.2 甘草黄酮的药理作用（1）抗肿瘤作用[8]：日本德岛文理大学佐藤利夫教授领导的研究小组,近几年开发出一种能有效抑制癌细胞扩散的新药，研究小组发现,天然甘草中含有查尔酮衍生物,它对上述两种酶都有抑制作用。

（2）抗氧化作用[8]：甘草黄酮类物质可以防止低密度脂蛋白(LDL)发生脂质过氧化反应,降低病人血浆中的低密度脂蛋白被氧化的易感系数,提高血浆中的低密度脂蛋白的抗氧化、抗凝聚、抗滞留的能力,可以用来治疗各种由于血脂高、脂质氧化所引起的疾病。

（3）黄酮类化合物抗糖尿病(DM)的作用研究：给糖尿病大鼠每日腹腔注射，能显著降低糖尿病大鼠空腹血糖及胰岛素水平，同时能显著地降低糖尿病大鼠血清总胆固醇、甘油三酯、脂质过氧化物含量，而对正常大鼠血糖无影响。

（4）抗HIV病毒作用[8]：日本学者从甘草鞣质活性成分研究中所得到的酚性成分(包括黄酮类成分) 加强了人体免疫缺陷病毒(HIV) 对ATL - IK(来源于成人T 细胞性白血病患者的细胞株) 的拮抗作用。

其中两种新甘草查尔酮低浓度时显示出对HIV 增殖的抑制作用。

（5）抗心律失常作用：实验证实了甘草总黄酮具有抗心律失常作用,又证明:对乌头碱诱发的心律失常甘草甜素无对抗作用,而甘草类黄酮与异甘草素有明显拮抗作用,并在此基础上发明了一种含有异甘草素的抗心律失常药物。

（6）抗衰老作用[9]：黄酮类化合物是优良的活性氧清除剂和脂质抗氧化剂,能与超氧阴离子反应,阻止自由基反应发生。

与铁离子络合阻止羟基自由基生成,与脂质过氧化基反应阻止脂质过氧化过程。

（7）抗炎和抗变态反应作用[9]：前苏联学者研究表明，glycycoumarin有较强的消炎和抗变态作用，比磺胺和抗生素的药效要好。

1.3 甘草黄酮提取和分离纯化方法的研究进展1.3.1 甘草黄酮提取方法的研究进展现有的甘草黄酮提取方法很多，其基本原理都为通过物理、化学方法破坏甘草的细胞壁，再通过甘草黄酮的极性及溶解性以达到其分离提取的目的。

水提法和溶剂提取法是目前较成熟的工艺技术，新发展起来的有超声波提取、微波提取、超滤提取、加压热水提取和超临界萃取等方法[10]。

1.3.2 甘草黄酮分离纯化方法的研究进展经上述方法提取后的甘草黄酮还不能达到使用标准，需要经过分离、纯化、检验合格后才能投入使用。

对于甘草黄酮分离纯化相关的研究报道很多，归纳起来主要有如下几种典型的方法：经典醋酸乙酯萃取法、重结晶法，树脂法，超滤法和双水相体系法等[11-13]。

萃取法[14]需使用大量的有机溶剂，在实际生产中受到一定限制。

树脂法[12]即柱色谱分离技术，是目前发展较快的一种分离方法，一般使用硅胶、氧化铝、活性炭、聚酰胺、离子交换吸附树脂以及大孔树脂等固态物质作为吸附剂，用适当的溶剂洗脱分离混合物，该技术的应用已经广泛深入到分离纯化、合成化学、生物医学工程等各个领域。

近年来国内外发展的黄酮分离纯化的处理新技术采用树脂吸附，这一方法在医药领域和天然产物纯化中广为运用，在提取精制有效成分方面尤为有效。

离子交换树脂根据被洗脱物的酸碱性进行洗脱，但离子交换树脂法处理量小，提取率低。

由于甘草中总黄酮含有大量的脂溶性成分，其提取物的水分散液中有大量难以分散的沉淀，也限制了大孔吸附树脂在甘草黄酮纯化上的应用[15]。

聚酰胺吸附树脂是新发展起来的一类有机分子聚合物吸附剂。

聚酰胺树脂是由酰胺聚合而成的一类高分子物质，它对黄酮类化合物有较强的吸附性能，主要通过氢键和范德华力吸附[16]。

聚酰胺树脂具有物理化学稳定性高、吸附选择性独特、不受无机物存在的影响、再生简单、解析条件温和，使用周期长、节省费用等优点，现已广泛用于黄酮类物质的提取。

聚酰胺树脂法是近几年发展起来的一种分离纯化黄酮类物质较好的树脂分离方法。

聚酰胺吸附树脂精制黄酮粗提物不仅具有方法简单、成本低、效率高、稳定性高和容易再生等特点，而且得到的产品安全，不存在重金属、有机溶剂毒性残留等问题[17]。

据报道及文献记载，聚酰胺树脂已用于分离纯化多种植物黄酮，杨武英,上官新晨等[18]通过不同条件下聚酰胺树脂对青钱柳黄酮的静态和动态吸附与解吸特性的研究,确定聚酰胺树脂对青钱柳黄酮的最佳精制工艺；采用优选出的最佳精制工艺对青钱柳黄酮粗提物进行多次精制,得到高纯度青钱柳黄酮。

王成章等[19]在利用超滤纯化银杏叶黄酮甙的研究中发现聚酰胺树脂对黄酮的选择性好，其吸附量为18～20meJg树脂，经过超滤膜去杂纯化后，聚酰胺树脂吸附，得到纯度为45．3％黄酮。

张伟，葛志强等[20]研究聚酰胺树脂分离纯化复方山楂提取物的工艺及参数的结果是聚酰胺树脂对总黄酮为优惠吸附，采用50%和70%乙醇溶液梯度洗脱效果最佳。

纯化后总黄酮保留率高达93.0%，纯化物质量仅为纯化前的8.12%。

说明采用聚酰胺树脂分离纯化黄酮类化合物效果是很好的。

1.4本研究的主要内容和意义国内外对甘草酸的研究已经很深入，现已形成规模化生产，而对甘草黄酮的研究主要集中在化学成分和药理作用上，对其分离纯化研究较少。

而甘草黄酮类化合物具有多种生物活性，可广泛用于医药、保健、食品添加剂及化妆品等领域[21]。

因此，对甘草黄酮分离纯化方面的研究是一项值得重视的课题。

目前，利用聚酰胺树脂分离纯化甘草黄酮的研究只有张睿，林强等[22]利用大孔吸附树脂提取甘草中黄酮类化合物，得到甘草黄酮的含量为53.5%，再通过聚酰胺柱色谱分离后，黄酮的含量可以达到90.26%；郑颖，蓝闽波等[23]利用聚酰胺树脂分离甘草总黄酮并且研究其抗氧化活性，得出的结论是甘草粗黄酮经过聚酰胺树脂精制后，纯度提高，抗氧化活性明显增加。

由于聚酰胺树脂对黄酮有较好的吸附性，而使用该树脂分离纯化甘草黄酮的相关研究很少，且没有具体的工艺参数，因此，本课题选取聚酰胺树脂为分离纯化甘草黄酮的吸附树脂，研究利用该树脂分离纯化甘草黄酮的实验参数，包括pH值、料液浓度、洗脱液组成、洗脱流速、柱径高比等，以确定该树脂分离纯化甘草黄酮的最佳条件。

研究结果对提高甘草有效成分利用率，聚酰胺树脂柱层析在分离纯化黄酮类化合物上的应用具有重要意义。

第二章实验材料与方法2.1 实验材料、试剂与仪器2.1.1 材料甘草，产于宁夏。

2.1.2 试剂本研究所用试剂见表2.1。

表 2.1 实验所用试剂一览表试剂名称纯度生产厂家亚硝酸钠AR 北京化学试剂公司硝酸铝AR 北京化学试剂公司氢氧化钠AR 北京化学试剂公司芦丁标准品Sigma公司95%乙醇AR 北京化工厂盐酸AR 北京化工厂聚酰胺吸附树脂上海摩速科学器材有限公司2.1.3 仪器本研究所用仪器见表2.2。

表 2.2 实验所用仪器一览表仪器名称型号生产厂家电子分析天平HR-200 A＆D 公司高速万能粉碎机FW-100 天津市泰斯特仪器有限公司旋转蒸发器RE-52AA 上海亚荣生化仪器厂紫外可见分光光度计UV754N 上海精密科学仪器有限公司数控自动部分收集器SBS-100 上海青浦沪西仪器厂恒流泵HL-1 上海青浦沪西仪器厂核酸蛋白检测仪DU800 Beckman公司2.2 实验方法2.2.1 甘草的预处理将11月份挖取的甘草，洗净，切薄后室温干燥备用。

实验前，取干燥的甘草磨碎成干粉状使用。

2.2.2 聚酰胺树脂的预处理聚酰胺树脂用95％乙醇浸泡24 h，用蒸馏水洗至无酒精味，再用2％NaOH 浸泡24 h，滤掉上层碱液，以蒸馏水洗至中性后用2％柠檬酸酸浸泡24 h，再用蒸馏水洗至中性并浸泡备用[14]。