海藻糖

海藻糖水解酶蛋白的重组表达

09生物2 车纯

北京电子科技职业学院

前言：我们利用酶转化淀粉法，利用低聚麦芽糖基海藻糖生成酶把麦芽低聚糖合成为麦芽低聚糖海藻糖，在利用低聚麦芽糖基海藻糖水解酶把麦芽低聚糖海藻糖水解成海藻糖和麦芽低聚糖。我们先设计扩增海藻糖水解酶基因的引物，通过培养玫瑰微球菌从中提取基因组，再用琼脂糖凝胶电泳检测基因组，选出我用琼脂糖凝胶电泳检测我们所扩增好的们所要用的基因片段，放入编好程序的PCR仪中，进行PCR 扩增，最后再目的基因。

关键词：海藻糖、酶转化淀粉法、琼脂糖凝胶电泳、PCR技术

绪论：海藻糖，英文名Trehalose ，是一种安全、

可靠的天然糖类，分子式C 12H 22O 11，英文化学名称（α-D-glucosido-α-D-glucosidemycose ）。海藻糖是一种安全的天然糖类,日常生活中食用的蘑菇类、海藻类、豆类、 虾类、啤酒及酵母中都有含量较高的海藻糖。 由于海藻糖对生物体具有神奇的保护作用，是因为海藻糖在高温、高寒、高渗透压及干燥失水等恶劣环境条件下在细胞表面能形成独特的保护膜，有效地保护蛋白质分子不变性失活，抗逆保鲜等独特的生物

学特性，从而维持生命体的生命过程和生物特征。另外，在加热过程中不易与氨基酸和蛋白质发生美拉德反应。在 pH 值为 3.5～10.0 范围的溶液中，保持 1000℃、24h ，分解率仅为 1％。海藻糖几乎不能被一般的酶所分解，只能被特异性的海藻糖酶分解。

这独特的功能特性，使得海藻糖除了可以作为蛋白质药物、酶稳定剂、疫苗、器官移植的保护液和其他生物制品的优良活性保护剂以外，还作为食品添加剂，甜味剂，本品的甜度相当于蔗糖45%；将本品添加到含水蛋白食品中，在冰点以上冷冻干燥，可使食品不变质；因本品为非还原性糖，与氨基酸及蛋白质共同加热时，不会发生褐变反应；本品耐酸、耐热性好，加到食品中不变色、不分解、易消化、易吸收，与蔗糖相比，产生龋齿性小；可防止淀粉老化，化妆品方面，用于护肤品，保持皮肤的高水分；用于唇膏基料；也可用于化妆水、面乳、香精等]1[。正越来越多地被人们应用到生产活动、日常生活的诸多方面。

PCR 技术

PCR 反应成功扩增的一个关键条件在于寡核苷酸引物的正确设计，所选的引物序列将决定PCR 产物的大小、位置、以及扩增区与T m 值。这和扩增物产量有关的重要物理参数。好的引物设计可以避免背景和非特异产物的产生，甚至在RNA-PCR 中也能识别cDNA 或基因组模板。]2[

PCR 扩增的条件：

1）引物的长度 2）引物的末端核苷酸 3）GC 的合理含量和Tm 值

4）PCR 产物长度和在靶序列内的位置 引物设计原则[3]

① 引物长度 图1

一般引物长度为18~30碱基。总的说来，决定引物退火温度（Tm 值）最重要的因素就是引物的长度。有以下公式可以用于粗略计算引物的退火温度。 在引物长度小于20bp 时：[4(G+C)+2(A+T)]-5℃

在引物长度大于20bp 时：62.3℃+0.41℃(%G-C)-500/length-5℃

总的说来，每增加一个核苷酸引物特异性提高4倍，这样，大多数应用的最短引物长度为18个核苷酸。 ② GC 含量

一般引物序列中G+C 含量一般为40%~60%，一对引物的GC 含量和Tm 值应该协调。 ③ 退火温度

退火温度需要比解链温度低5℃，如果引物碱基数较少，可以适当提高退火温度，

这样可以使PCR的特异性增加；如果碱基数较多，那么可以适当减低退火温度，是DNA双链结合。理想情况下一对引物的退火温度是一样的，可以在55℃～75℃间变化。

④避免扩增模板的二级结构区域。

选择扩增片段时最好避开模板的二级结构区域。

⑤引物末端

引物3’端是延伸开始的地方，因此要防止错配就从这里开始。3’端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。3′端也不能有形成任何二级结构可能，除在特殊的PCR（AS-PCR）反应中，引物3′端不能发生错配。如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。

⑥引物的二级结构

引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构，这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。一般情况下，一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性。

5、设计软件和使用方法

1)设计软件：Primer Premier 5.0

2)使用方法:按照下载的中文版的使用说明书进行操作。

琼脂糖凝胶电泳：

琼脂糖凝胶电泳是PCR扩增产物的分离、纯化和鉴定最常用的方法。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后，用溴化乙锭（EB）染色。在紫外灯下便可以直接确定DNA片断在凝胶上的位置。其分辨率高，可以测出lngDNA。[4]DNA片断在凝胶上移动的距离在一定范围内是相对分子质量的函数。相对分子质量愈大，分子移动愈缓慢。因此，利用琼脂糖凝胶电泳相对标准DNA的移动度，可以测定DNA片断的相对分子质量。[5]

将适量琼脂糖加入TAE缓冲液中，加热溶解。实验过程中要注意以下几点:

1）该实验区为污染区，操作时请戴手套，并注意不要带手套触摸非实验区内物品。

2）制作凝胶时，每100ml凝胶加入EB量不超过5µl，每50ml凝胶不超过2µl，制作25ml凝胶时加入1µl足够。EB请勿在室温放置，使用完必须放回专门区域。

3）制作完凝胶后，请及时清理模具内残胶。模具及梳子请放回盘内，勿随意散放在实验区内

4）电泳时，使用TAE的工作浓度为1X。电泳前请先检查电泳槽内缓冲液，液面过低请补加相应缓冲液；缓冲液浑浊请及时更换。

5）6 X loading Buffer含有两条指示带，10X loading Buffer含一条指示带，请酌情选择。

6）2mm 孔凝胶每次使用marker量为4µl，随孔大小酌情增减。

7）电泳后请合上电泳槽上盖，防止异物进入及缓冲液蒸发。

8）实验结束后模具、梳子、镊子、手术刀集中放在指定区域，收好。