Red重组技术研究进展

图 1 Red重组表达质粒 pKD 20与 pKD 46 F ig. 1 Pla sm ids of pKD 20 and pKD 46 applied in Red recom b ina tion
2. 2 Court重组系统的结构 Red系统可以整合到染色体 , Yu 等 [11 ]利用一个缺 陷型 λ原噬菌体实现了外源线性 DNA 在 E. coli细胞中 与体细胞 DNA 重组 ,称做 Court重组 。这个缺陷型 λ
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和重组启动 。 gam 基因的表达产物 Gam 蛋白与宿主的 RecBCD 复合体结合并抑制宿主外切核酸酶活性 ,阻止 外源线性 DNA 片段被降解 。 [8 ] 1. 1 W anner重组系统的结构 Datsenko等 [10 ]构建的辅助质粒如 pKD20与 pKD46 含有包括 gam 基因在内的整套 Red系统 ,见图 1。利用 pKD20 与 pKD46 质粒完成的重组又称 W anner重组 。 pKD20有优化的核糖体结合位点 ,在阿拉伯糖启动子
DNA 的双链末端启动 Red介导的重组 。然后 λ外切核 酸酶 ( Exo)结合到外源线性 DNA 片断的双链末端 ,连 续降 解 5′末 端 链 , 留 下 3′单 链 尾 巴 。接 着 RecA 和 RecB 蛋白引导 3′单链尾巴与细胞染色体的靶基因同 源序列配对 , 置换靶基因 。当宿主细胞缺失 RecBCD 时 ,λRed重组只需起双链修复和 重 组作 用 的 Exo 和 Redβ蛋白参与即可 。重组的其它步骤由宿主蛋白来 完成 。 Poteete 等 [20 ] 提出了一个不依赖解旋酶 RuvC 和 RecG的 Red重组机理 ,见图 4。该重组过程的前几个 步骤与图 3同 ,但是由于宿主缺失 RecG,所以在随后的
因的末端同源 。利用 PCR 扩增获得侧翼与靶基因有 30～50bp 同源序列的线性 DNA 片段 ; 第二步 ,诱导宿 主细胞表达 Exo、Bata 和 Gam 蛋白并制备成感受态细 胞 ,然后与 PCR 扩增获得的线性 DNA 片段混和电转 化 ;第三步 ,线性 PCR 产物与宿主靶基因的同源序列发 生替换 ,完成重组 。 312 W anner重组策略 W anner重组方案与 Court方案相似 ,如图 5。第一 步 ,合成与靶基因 (基因 B )有 36bp 同源 ( H1 和 H2)的 引物 , PCR 扩增获得抗生素抗性 (如 kanr )基因作为替 换序列片断 ; 第二步 ,把含有 pKD20 或 pKD46 的细胞 制备成感受态细胞 ,电转化抗生素抗性基因片段 ;第三 步 ,抗性基因与靶基因同源重组 。抗生素抗性会对环 境造成不确定性影响 ,因此可以选择在第四步利用一 个表达 FLP重组酶的帮助质粒 ,如 pCP20 去除抗生素 抗性基因 。因为 Red和 FLP帮助质粒都是温度敏感型 复制子 ,所以当细胞在 37℃生长时就能轻易被去除 。
图 3 Red介导的线性 D NA与细菌染色体基因重组机理 F ig. 3 Possible m echan ism of Red2m ed ia ted recom b ina tion involv ing strand inva sion
图 4 Red介导不依赖 RuvC和 RecG的线性 D NA与细菌染色体基因重组机理 F ig. 4 Possible m echan ism of recom b inan t forma tion v ia the Red pa thway independen t of RuvC and RecG
2 Red 重组的作用机理
E. coli与染色体同源重组有关的蛋白约有 15 ～20 种 [15 ] ,但是仅 RecA 是重组必需的酶 。RecA 蛋白在细 菌重组中起到联会与 DNA 链置换两个功能 [16 ] 。解旋 酶 RecBCD 则参与重组时发生的结合或普通性转导 。 RecBCD 是一种复杂的核酸酶 , 当缺乏 RecBCD 蛋白
原噬菌体的 Red表达系统是温度依赖型的 ,在 42℃培 养 7～20m in即可启动重组 。而且它不需宿主 RecA ,仅 依赖于自身表达的 Exo、Beta 和 Gam 酶功能 , 见图 2。 图 2中原噬菌体含有的 λ基因从 cl到 in t。
图 2 E. co li染色体上的缺陷性原噬菌体 1) E. coli染色体基因 ; 2)λ原噬菌体基因 ; 3)已删除的原噬菌体右边基因 cro - attR - bioA;
日益成熟的微生物分子克隆技术为目的基因的研 究提供了有效手段 。例如目的基因的失活是目前研究 基因的热点领域 ,最常用的方法是等位替换 。在细菌 中这种等位替换方法通常需要闭合环状的克隆载体介 导 才 能 实 现 [ 1～3 ] 。而 在 酿 酒 酵 母 ( S accha rom yces cerevisiae)和白色念珠菌 ( Cand ida a lbicans)中外源线性 DNA 片段 可 直 接 与 染 色 体 中 的 靶 基 因 进 行 同 源 重 组 [4～6 ] 。大多数细菌因为核酸内切酶的存在而不能如 S. cerevisiae等一样转化线性 DNA[7 ] 。敲除细菌基因的 传统方法是利用 RecA 重组系统 。RecA 重组系统是大 肠杆菌内源性的同源重组体系 ,它由 RecA 和 RecBCD 组成 。RecA 蛋白促进各类 DNA 分子间的同源联会和 配对 。RecBCD 分子量较大 ,是由 RecB、RecC 和 RecD 组成的复合体 ,具有 ATP依赖的外切酶 Ⅴ和解旋酶活 性 ,它能与双链切口结合解开 DNA 链 ,并在 Chi位点形 成单链 ,然后由 RecA 蛋白促进同源重组 。这种方法需 要较长的靶基因同源序列 ,还需构建具有靶位点的质 粒 。噬菌体 Red重组系统可以催化同源侧翼序列短的 线性 DNA 片断与细菌染色体的靶基因进行同源重组 。 这种利用噬菌体 Red 系统介导来实现外源线性 DNA 片断与细 菌 染 色 体 靶 基 因 进 行 同 源 重 组 的 方 法 即 为
Hale Waihona Puke Baidu
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过程中 DNA 链的支点发生了移位 ,导致在标记 B 位置 形成了异源双链 。然后宿主中存在的自发性错配修复 系统把异源双链修复为同源双链 。整个过程绕开了 Holliday连接体的内切酶溶解过程 。接着内切核酸酶 从被置换链的右侧某位点断裂并修剪了被置换链 。但 是如果异源序列插入到了置换链末端和标记 B 的位 置 ,则通向如图 4a所示的重组路径将受到阻碍 ,因此更 依赖于 RuvC和 RucG,见图 4b。
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时 ,诱导 sbcB 和 sbcC 或 sbcD 基因表达其它核酸酶 ,也 能发 生 有 效 重 组 , 这 种 重 组 依 赖 于 RecG、RecQ 和 RuvAB 等解旋酶 [15 ] 。解旋酶 PriA 也在许多野生型细 菌的重组中起重要作用 [17 ] 。重组蛋白 RuvC 是结合专 一性内切核酸酶 ,有 Hollida连接体溶解酶的属性 [18 ] 。 被 λ噬菌体感染的 E. coli会表达一种 Red重组系 统 ,该系统能够启动高效的双链断裂修复和瞬间重组 。 如果没有感染 λ噬菌体的 E. coli细胞表达 λ重组蛋 白 ,这种 Red 诱导的“高效重组 ”能力会持续存在 [19 ] 。 图 3是 Red介导的重组机理 [20 ] 。重组过程中 ,λ噬菌 体的 Gam 蛋白使 RecBCD 编码的酶失活 ,从外源线性
3 Red重组策略
本文主要介绍两个 2000 年开发并应用的 Court重 组和 W anner重组方案 。它们都利用一个具有非常短 同源序列 ( 30 ～50bp ) 的 PCR 产物启动染色体靶基因 失活 。这一类方案中发生的 DNA 交换通常叫做“Red - 交换 ”。 311 C our t重组策略 Court重组方案利用整合在 E. coli染色体上的缺陷 性原噬菌体在 c I857 ( Ts)抑制子控制下从 λPL 表达 bet、 gam 和 exo基因 ,见图 2。利用 Court重组 ,重组率可以 达到 0. 1%以上 。Court重组策略分为三步 :第一步 ,合 成 2个寡核苷酸片段作为 PCR 引物 。寡核苷酸的 5′端 有 30～50bp 与靶基因末端同源 , 3′端有 20bp 与替换基
1 Red重组系统的结构
λ噬菌体基因 Red区段编码了一个能够启动细菌 染色体与外源 DNA 发生同源重组的系统 。Red重组技 术就是利用整合到细菌染色体或质粒中的 Red系统编 码的 Red重组酶来实现外源 PCR 片段与基因组中靶基 因的同源重组 。λRed 区段包括 3 个基因 : bet ( akaβ) 、 exo和 gam ( akar) [ 8, 。 10～13 ] Exo是 5′→3′外切酶 ,能降解 线性 DNA 的 5′末端 。晶体学研究发现 , Exo 核酸外切 酶三个亚基组成环形聚合体 ,具有一个漏斗型的中心 通 道 。 bet 基 因 编 码 的 β 蛋 白 是 一 个 单 链 DNA ( ssDNA )结合蛋白 ,它可以结合到由 Exo 产生的单链 DNA 的 3′端 ,从而启动互补 DNA 链的退火 ,引发 DNA 链的交换反应 [8, 11～13 ] 。β蛋白在溶液中的游离状态为 环状物 ,当结合到 dsDNA 时形成螺旋状纤维 [14 ] 。β蛋 白还可与 Exo外切核酸酶形成复合体 ,调节核酸溶解
收稿日期 : 2005204226 修回日期 : 2005209229 3 中国石油股份有限公司资助项目 (104003) 33 电子信箱 : zhangquan@ fripp. com. cn
Red重组技术 ,外源线性 DNA 通常是 PCR 产物 、寡核 苷酸片断等 ,在它们的两翼各含有与染色体靶基因两 翼同源的序列 40～60bp。这种 Red重组技术省去了体 外 DNA 酶切 、连接等步骤 ,使细菌染色体靶基因的敲 除与替换操作相对简单 ,逐渐成为基因功能探索以及 新菌株构建的有力手段 [8, 9 ] 。下文将论述 Red 重组系 统的结构 、作用机理及其在细菌染色体基因敲除中的 应用 。
ParaB 控制下高效表达 γ、β和 Exo 酶 。pKD20 还是一 个温度敏感性复制子 ,易从宿主中消除 [10 ] 。pKD46 与 pKD20相似 ,是在阿拉伯启动子 PBAD控制下表达 Red 系统 γ、β和 Exo酶的温度敏感型低拷贝质粒 。两种质 粒都有 λ噬菌体基因 1 894bp ( 31 348 ∃ 33 241 ) 和 2 154 bp ( 31 088 ∃ 33 241) 的碱基序列 ( GenBank编 号 : J02459) 。
PL 与 PR :左边和右边的启动子 ; attL 与 a ttR:λ基因与 E. coli染色体基因连接位点 F ig. 2 The defective prophage in E. coli chroma som e
113 其他重组系统的结构 M urphy等 [8 ]报道了在具有 recBCD 突变背景以及 λ噬菌重组功能 ( Exo和 Beta)的 E. coli中高效重组含 有与靶基因有较长同源序列的线性 DNA 的方法 。此 λ 重组体系与酵母中的线性 DNA 重组功能相似 ,也是利 用了细胞 DNA 双链断裂后的自我修复功能 。
中国生物工程杂志 China B iotechnology, 2006, 26 (1) : 81～86
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张 全 33 高会杰 佟明友
(中国石油化工股份有限公司抚顺石油化工研究院 抚顺 113001)
摘要 主要从 Red系统组成元件、作用机理、重组策略以及先进性和发展前景四个方面综述了利用 Red重 组系统敲除或替换细菌染色体目的基因的方法。首先简要介绍了传统的细菌染色体重组技术 ,指出了其 中的缺陷。然后提出了 Red重组技术的定义 :利用噬菌体 Red系统介导来实现外源线性 DNA片断与细菌 染色体的靶基因进行同源重组的方法 ,外源线性 DNA通常是 PCR产物、寡核苷酸片断等 ,在它们的两翼各 含有与染色体靶基因两翼同源的序列 40～60bp。这种 Red重组技术省去了体外 DNA酶切和连接等步骤 , 使细菌染色体靶基因的敲除与替换操作相对简单 ,逐渐成为基因功能探索以及新菌株构建的有力手段。 关键词 Red重组系统 细菌 靶基因 基因敲除 中图分类号 Q813. 4