产脂肪酶菌株的筛选及产酶条件优化
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[6] 张邦建,王海峰,侯成林. 发酵法生产番茄红素工艺的研究[J].食 品工程，2008,12(4):14 -16
产量为 44.919 3 mg/L。
收稿日期：2010-10-07
120
李鑫玲，等：产脂肪酶菌株的筛选及产酶条件优化
生物工程
油污丰富的土壤中筛选得到一株有较高产脂肪酶活 性，有呼吸代谢，初步鉴定为假单胞菌属。
脂肪酶是能够催化长链脂肪酸甘油酯水解和合 成的羧酸酯酶[1]，是当代酶工业最受瞩目的酶种之一[2]。
作者简介：李鑫玲（1982—），女（汉），助理实验师，硕士，研究方向：畜 产品加工及食品质量与安全。
脂肪酶广泛存在于许多动植物及微生物中，已有多种 微生物脂肪酶实现商业化生产，主要应用于油脂分解、 食品风味和香味的改进，医疗和皮革脱脂，低等油脂的 改性，洗涤剂和化妆品的添加剂等[3- 4]。本文介绍了从
（1. Food and Bioengineering Department, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471003, Henan, China; 2. Tsingtao Brewery Co., Ltd., Taiyuan 030032, Shanxi, China）
（下转第 145 页）
贮藏保鲜
徐丽，等：鲶鱼食用肉粉的贮藏实验研究
145
了明显的变化，如色泽变黄，冲调性下降，从而使其商 参考文献：
品利用价值降低。 2）在 3 种 温 度 的 贮 藏 期 间 ，其 酸 价 、挥 发 性 盐 基
氮、TBARS值、pH以及菌落总数和大肠菌群均呈上升 趋势，且这些理化指标和微生物指标的变化速度与贮 藏温度呈正比关系。在（37±1）℃温度条件下贮藏，产 品的保质期只能达到2周，（20±1）℃贮藏，产品保质 期可以延长到3周，而0 ℃~4 ℃贮藏，保质期可以达到 4周，实验整体说明加工的鲶鱼食用肉粉保质期较短， 需要采用进一步的措施延长其保质期。
酶活/（U/mL）
胨 1.0，橄榄油 1.0，琼脂 1.5，pH 7.0，用食品搅拌器高 速搅拌均匀，高压灭菌倒板前再用磁力搅拌器混匀；种
子培养基（%）：葡萄糖 2.0，（NH4）2SO4 0.5，K2HPO4 0.1， 橄榄油 1.0，MgSO4·7H2O 0.05，蛋白胨 2.5，pH 7.0；发酵 培养基（%）：蛋白胨 2.0，蔗糖 0.5，橄榄油 1.0，（NH4）2SO4 0.1，MgSO·4 7H2O 0.05，K2HPO4 0.1，pH 自然。 1.3 产脂肪酶菌株的筛选
[5] 肉和肉制品pH值的国际测定标准方法[J].许益民，译.中国动物 保健，2000(5):27
[6] Sinnhuber R O, Yu T C. The 2 -thiobarbituric acid reaction, an objective measure of the oxidative deterioration occurring in fats and oils [J]. Journal of Japan Oil Chemists' Society, 1977, 25: 259-267
酶的最佳起始 pH 在 7.0 左右，酶活为 12.0 U/mL，pH 为 9 或较低时，菌体几乎不生长，产酶下降，见图 3。 2.3.4 不同温度对产酶的影响
在不同温度下发酵培养，结果表明，在 30 ℃下产 酶最多，因此选择 30 ℃作为该菌株的发酵温度，对应 酶活为 9.9 U/mL，见图 4。
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 茄红素的生成量在发酵进行 120 h 时达到最大。在随 参考文献：
后的 120 h~168 h 中，番茄红素的产量逐渐减少，而三 孢布拉氏霉菌发酵生产番茄红素所得到的菌体干重 在发酵时间为 108 h 时达到最大。综合以上试验指标， 选择 120 h 作为最佳发酵周期。
Abstract: This thesis reports that a lipase- produing bacterial strain was isolated from the oilysoil samples and was identified as pseudomonas. The lipase fermentation condition for the strain was optimized by studying on effect of nitrogen sources, carbon sources and other influence factors. The optimum carbon and nitrogen source was dextrin and ammonium sulfate. The optimum pH was 7.0, and the optimum temperature for fermentation was 30 ℃. Key words: lipase; pseudomonas; optimal lipase- producing condition
摘 要：从土壤样本中分离出一株具有较高活力的产脂肪酶菌株，初步确定为假单胞菌属。对该脂肪酶产酶条件进 行优化，最佳碳源为糊精、氮源为硫酸铵，最适发酵温度为 30 ℃，最适起始 pH 为 7.0。 关键词：脂肪酶；假单胞菌属；产酶条件
Screening of Lipase Producing Strains and Optimization of the Lipase Production LI Xin- ling1, SUN Xiao- fei1, MENG Nan1, BU Mei- ling1，LIU Jin2
氮源
图 2 不同氮源对产酶的影响 Fig.2 Effect of nitrogen source on lipases production
2 结果与分析 2.1 产脂肪酶菌株的筛选
经富集和筛选，得到 7 株产脂肪酶菌株，经摇瓶 复筛，发现 4 号菌株产酶能力较强。因此，选定 4 号菌 株为本次筛选的结果，进行后续实验。 2.2 菌株的鉴定结果
生物工程
食品研究与开发
Food Research And Development
2011 年 6 月
第 32 卷第 6 期 119
产脂肪酶菌株的筛选及产酶条件优化
李鑫玲 1，孙晓菲 1，孟楠 1，卜美玲 1，刘进 2 （1. 河南科技大学 食品与生物工程学院，河南 洛阳 471003；2. 青岛啤酒（太原）有限公司，山西 太原 030032）
在 LB（Luria- Bertani）培养基上，菌落呈圆形，边缘 整齐，表面光滑，不透明，呈浅黄色。显微镜下观察，菌 体呈短杆状，有鞭毛，为革兰氏阴性菌。常规生理生化 实验表明，4 号菌株接触酶和氧化酶反应阳性，有运动
2.3.3 不同起始 pH 对产酶的影响 结果显示，起始 pH 对产酶的影响很大，该菌株产
一桥下以及周山森林公园周围等油污丰富的土壤淤 泥中，共采集 45 份土样，供分离用。
为碳源效果最佳，对应酶活为 6.0 U/mL，见图 1。 2.3.2 不同氮源对产酶的影响
1.2 培养基
富集培养基 （%）：酵 母 膏 0.02 , Na2HPO4 0.35, KH2PO4 0.15, MgSO·4 7H2O0.05，NaCl 0.05，橄榄油 1.0，pH 7.0；平板分离培养基（%）：酵母膏 0.2，牛肉膏 0.2，蛋白
酶活/（U/mL）
化，然后摇瓶发酵复筛。 1.4 脂肪酶活力的测定[5]
NaOH 滴定法测酶活：在 40 ℃、pH 7.5 条件下,以
每分钟从橄榄油中释放 1 μmol 脂肪酸的酶量定义为 1 U。相对酶活是指在实验中所测得的酶活力值与最高
酶活力值的百分比。
1.5 高产菌株的鉴定 革兰氏染色，电镜观察，接触酶、 氧化酶等反应，参照《伯杰细菌鉴定手册》[6]。
碳源 图 1 不同碳源对产酶的影响 Fig.1 Effect of carbon source on lipases production
添加酵母浸膏、牛肉膏、尿素、2 %的蛋白胨、黄豆 粉、硫酸铵等氮源对菌体发酵有不同的影响。结果表 明，硫酸铵是最佳的氮源，对应酶活为 15 U/mL，见图2。
落周围有无透明圈，选择有透明圈的菌落进行划线纯
力的菌株，并研究了它产酶的ຫໍສະໝຸດ Baidu适条件。
2.3 产酶条件的优化
2.3.1 不同碳源对产酶的影响
1 材料与方法 1.1 土样
以可溶性淀粉、葡萄糖、糊精等不同碳源代替发 酵培养基中的蔗糖，或不加糖类物质，只以橄榄油为惟
从河南洛阳，河南科技大学学校周围、天津路八 一碳源，结果显示，碳源对产酶有一定的影响，以糊精
3）由于鲶鱼本身脂肪含量较高（5.52 %），利用其 加工的鲶鱼食用肉粉中脂肪含量肯定亦高，贮藏中，特 别是较高温度的贮藏，容易造成脂肪的氧化，所以本试 验说明，加工的鲶鱼食用肉粉应该进行真空包装并结 合冷藏，同时加工中注意环境卫生和温度控制，是确保
[1] 陈辉武,屈利文,朱清华.鱼粉贮藏试验研究[J].饲料研究,1992(1): 6-8
[1] Paiva S，Russell R. Beta carotene and other carotenoids as antioxidants [J]. J Am Coll, Nutrition Research, 1999, 18:426-433
[2] Ksenija Markovic', Mirjana Hrusˇkar, Nada Vahcˇic. Lycopen content of tomato products and their contribution to the lycopene intake of Carotenes [J]. Nutrition Research,2006,26: 556-560
[3] Jannat M. Rolda'n -Gutie'rrez and María Dolores Luque de Castro.
4 结语 通过对三孢布拉氏霉菌发酵生产番茄红素过程
中培养条件的研究，考察了在相同发酵培养基培养条 件下，不同菌种接种时间、接种比例、pH、发酵温度及
Lycopene: The need for better methods for characterization and determination[J]. Trends in Analytical Chemistry, 2007, 26(2):163170 [4] 成坚,曾庆孝.番茄红素的性质及生理功能研究进展[J].食品发酵 与工业，2000,26(2)：75-79
[7] 李贺玲,常娟.添加不同水平复合抗氧化剂对鱼粉酸价值的影响 [J].河南畜牧兽医,2008,29(8):5-6
称取湿土样 2 g 混悬于 20 mL 无菌水中，振荡；接 3 mL 混悬液于 30 mL 液体富集培养基中，在 32 ℃、 200 r/min 下培养 4 d 后，无菌操作转接 300 μL 浑浊 的菌液到新鲜的液体富集培养基，连续富集 3 轮。将富 集后菌液适当稀释，涂布分离平板。观察已生长的菌
发酵周期对番茄红素产量的影响，得到最适合生产番 茄红素的培养条件：种子培养正菌接种时间12 h~15 h， 负菌接种时间 20 h~25 h、接种比例 1∶5、pH7、发酵温度 28 ℃、发酵周期 120 h。发酵条件优化后番茄红素平均
[5] 吴疆,童应凯,金红,等.番茄红素的生物特性及应用前景[J].天津 农学院学报，2007,14(4):47- 50
[2] 黄海,辛荣,王秀敏.鱼肉蛋白在低温贮藏时生化特性变化研究进 展[J].食品研究与开发,2009,30(2): 149-153
[3] 兰建丽,孙忠伟,王青云,等.乳粉冲调性检测方法的探讨[J]. 中国 乳品工业, 2005,33(7):60-61
[4] 罗钦,陈人弼,宋永康.发酵鱼粉中酸价测定方法的研究[J].福建 分析测试,2009,18(3):39-41
产量为 44.919 3 mg/L。
收稿日期：2010-10-07
120
李鑫玲，等：产脂肪酶菌株的筛选及产酶条件优化
生物工程
油污丰富的土壤中筛选得到一株有较高产脂肪酶活 性，有呼吸代谢，初步鉴定为假单胞菌属。
脂肪酶是能够催化长链脂肪酸甘油酯水解和合 成的羧酸酯酶[1]，是当代酶工业最受瞩目的酶种之一[2]。
作者简介：李鑫玲（1982—），女（汉），助理实验师，硕士，研究方向：畜 产品加工及食品质量与安全。
脂肪酶广泛存在于许多动植物及微生物中，已有多种 微生物脂肪酶实现商业化生产，主要应用于油脂分解、 食品风味和香味的改进，医疗和皮革脱脂，低等油脂的 改性，洗涤剂和化妆品的添加剂等[3- 4]。本文介绍了从
（1. Food and Bioengineering Department, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471003, Henan, China; 2. Tsingtao Brewery Co., Ltd., Taiyuan 030032, Shanxi, China）
（下转第 145 页）
贮藏保鲜
徐丽，等：鲶鱼食用肉粉的贮藏实验研究
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了明显的变化，如色泽变黄，冲调性下降，从而使其商 参考文献：
品利用价值降低。 2）在 3 种 温 度 的 贮 藏 期 间 ，其 酸 价 、挥 发 性 盐 基
氮、TBARS值、pH以及菌落总数和大肠菌群均呈上升 趋势，且这些理化指标和微生物指标的变化速度与贮 藏温度呈正比关系。在（37±1）℃温度条件下贮藏，产 品的保质期只能达到2周，（20±1）℃贮藏，产品保质 期可以延长到3周，而0 ℃~4 ℃贮藏，保质期可以达到 4周，实验整体说明加工的鲶鱼食用肉粉保质期较短， 需要采用进一步的措施延长其保质期。
酶活/（U/mL）
胨 1.0，橄榄油 1.0，琼脂 1.5，pH 7.0，用食品搅拌器高 速搅拌均匀，高压灭菌倒板前再用磁力搅拌器混匀；种
子培养基（%）：葡萄糖 2.0，（NH4）2SO4 0.5，K2HPO4 0.1， 橄榄油 1.0，MgSO4·7H2O 0.05，蛋白胨 2.5，pH 7.0；发酵 培养基（%）：蛋白胨 2.0，蔗糖 0.5，橄榄油 1.0，（NH4）2SO4 0.1，MgSO·4 7H2O 0.05，K2HPO4 0.1，pH 自然。 1.3 产脂肪酶菌株的筛选
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酶的最佳起始 pH 在 7.0 左右，酶活为 12.0 U/mL，pH 为 9 或较低时，菌体几乎不生长，产酶下降，见图 3。 2.3.4 不同温度对产酶的影响
在不同温度下发酵培养，结果表明，在 30 ℃下产 酶最多，因此选择 30 ℃作为该菌株的发酵温度，对应 酶活为 9.9 U/mL，见图 4。
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 茄红素的生成量在发酵进行 120 h 时达到最大。在随 参考文献：
后的 120 h~168 h 中，番茄红素的产量逐渐减少，而三 孢布拉氏霉菌发酵生产番茄红素所得到的菌体干重 在发酵时间为 108 h 时达到最大。综合以上试验指标， 选择 120 h 作为最佳发酵周期。
Abstract: This thesis reports that a lipase- produing bacterial strain was isolated from the oilysoil samples and was identified as pseudomonas. The lipase fermentation condition for the strain was optimized by studying on effect of nitrogen sources, carbon sources and other influence factors. The optimum carbon and nitrogen source was dextrin and ammonium sulfate. The optimum pH was 7.0, and the optimum temperature for fermentation was 30 ℃. Key words: lipase; pseudomonas; optimal lipase- producing condition
摘 要：从土壤样本中分离出一株具有较高活力的产脂肪酶菌株，初步确定为假单胞菌属。对该脂肪酶产酶条件进 行优化，最佳碳源为糊精、氮源为硫酸铵，最适发酵温度为 30 ℃，最适起始 pH 为 7.0。 关键词：脂肪酶；假单胞菌属；产酶条件
Screening of Lipase Producing Strains and Optimization of the Lipase Production LI Xin- ling1, SUN Xiao- fei1, MENG Nan1, BU Mei- ling1，LIU Jin2
氮源
图 2 不同氮源对产酶的影响 Fig.2 Effect of nitrogen source on lipases production
2 结果与分析 2.1 产脂肪酶菌株的筛选
经富集和筛选，得到 7 株产脂肪酶菌株，经摇瓶 复筛，发现 4 号菌株产酶能力较强。因此，选定 4 号菌 株为本次筛选的结果，进行后续实验。 2.2 菌株的鉴定结果
生物工程
食品研究与开发
Food Research And Development
2011 年 6 月
第 32 卷第 6 期 119
产脂肪酶菌株的筛选及产酶条件优化
李鑫玲 1，孙晓菲 1，孟楠 1，卜美玲 1，刘进 2 （1. 河南科技大学 食品与生物工程学院，河南 洛阳 471003；2. 青岛啤酒（太原）有限公司，山西 太原 030032）
在 LB（Luria- Bertani）培养基上，菌落呈圆形，边缘 整齐，表面光滑，不透明，呈浅黄色。显微镜下观察，菌 体呈短杆状，有鞭毛，为革兰氏阴性菌。常规生理生化 实验表明，4 号菌株接触酶和氧化酶反应阳性，有运动
2.3.3 不同起始 pH 对产酶的影响 结果显示，起始 pH 对产酶的影响很大，该菌株产
一桥下以及周山森林公园周围等油污丰富的土壤淤 泥中，共采集 45 份土样，供分离用。
为碳源效果最佳，对应酶活为 6.0 U/mL，见图 1。 2.3.2 不同氮源对产酶的影响
1.2 培养基
富集培养基 （%）：酵 母 膏 0.02 , Na2HPO4 0.35, KH2PO4 0.15, MgSO·4 7H2O0.05，NaCl 0.05，橄榄油 1.0，pH 7.0；平板分离培养基（%）：酵母膏 0.2，牛肉膏 0.2，蛋白
酶活/（U/mL）
化，然后摇瓶发酵复筛。 1.4 脂肪酶活力的测定[5]
NaOH 滴定法测酶活：在 40 ℃、pH 7.5 条件下,以
每分钟从橄榄油中释放 1 μmol 脂肪酸的酶量定义为 1 U。相对酶活是指在实验中所测得的酶活力值与最高
酶活力值的百分比。
1.5 高产菌株的鉴定 革兰氏染色，电镜观察，接触酶、 氧化酶等反应，参照《伯杰细菌鉴定手册》[6]。
碳源 图 1 不同碳源对产酶的影响 Fig.1 Effect of carbon source on lipases production
添加酵母浸膏、牛肉膏、尿素、2 %的蛋白胨、黄豆 粉、硫酸铵等氮源对菌体发酵有不同的影响。结果表 明，硫酸铵是最佳的氮源，对应酶活为 15 U/mL，见图2。
落周围有无透明圈，选择有透明圈的菌落进行划线纯
力的菌株，并研究了它产酶的ຫໍສະໝຸດ Baidu适条件。
2.3 产酶条件的优化
2.3.1 不同碳源对产酶的影响
1 材料与方法 1.1 土样
以可溶性淀粉、葡萄糖、糊精等不同碳源代替发 酵培养基中的蔗糖，或不加糖类物质，只以橄榄油为惟
从河南洛阳，河南科技大学学校周围、天津路八 一碳源，结果显示，碳源对产酶有一定的影响，以糊精
3）由于鲶鱼本身脂肪含量较高（5.52 %），利用其 加工的鲶鱼食用肉粉中脂肪含量肯定亦高，贮藏中，特 别是较高温度的贮藏，容易造成脂肪的氧化，所以本试 验说明，加工的鲶鱼食用肉粉应该进行真空包装并结 合冷藏，同时加工中注意环境卫生和温度控制，是确保
[1] 陈辉武,屈利文,朱清华.鱼粉贮藏试验研究[J].饲料研究,1992(1): 6-8
[1] Paiva S，Russell R. Beta carotene and other carotenoids as antioxidants [J]. J Am Coll, Nutrition Research, 1999, 18:426-433
[2] Ksenija Markovic', Mirjana Hrusˇkar, Nada Vahcˇic. Lycopen content of tomato products and their contribution to the lycopene intake of Carotenes [J]. Nutrition Research,2006,26: 556-560
[3] Jannat M. Rolda'n -Gutie'rrez and María Dolores Luque de Castro.
4 结语 通过对三孢布拉氏霉菌发酵生产番茄红素过程
中培养条件的研究，考察了在相同发酵培养基培养条 件下，不同菌种接种时间、接种比例、pH、发酵温度及
Lycopene: The need for better methods for characterization and determination[J]. Trends in Analytical Chemistry, 2007, 26(2):163170 [4] 成坚,曾庆孝.番茄红素的性质及生理功能研究进展[J].食品发酵 与工业，2000,26(2)：75-79
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称取湿土样 2 g 混悬于 20 mL 无菌水中，振荡；接 3 mL 混悬液于 30 mL 液体富集培养基中，在 32 ℃、 200 r/min 下培养 4 d 后，无菌操作转接 300 μL 浑浊 的菌液到新鲜的液体富集培养基，连续富集 3 轮。将富 集后菌液适当稀释，涂布分离平板。观察已生长的菌
发酵周期对番茄红素产量的影响，得到最适合生产番 茄红素的培养条件：种子培养正菌接种时间12 h~15 h， 负菌接种时间 20 h~25 h、接种比例 1∶5、pH7、发酵温度 28 ℃、发酵周期 120 h。发酵条件优化后番茄红素平均
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[2] 黄海,辛荣,王秀敏.鱼肉蛋白在低温贮藏时生化特性变化研究进 展[J].食品研究与开发,2009,30(2): 149-153
[3] 兰建丽,孙忠伟,王青云,等.乳粉冲调性检测方法的探讨[J]. 中国 乳品工业, 2005,33(7):60-61
[4] 罗钦,陈人弼,宋永康.发酵鱼粉中酸价测定方法的研究[J].福建 分析测试,2009,18(3):39-41