抗氧化酶活性等测定方法

叶绿体的提取
一、试剂配置
1、PBS提取液：每L水依次加入MES(195.2×0.05=9.76g)、山梨糖醇(0.33×182.2=60.126g)、NaCl （0.010×58.5=0.585g）、MgCl（0.002×95=0.19g）、EDTA（292.25×0.002=0.5845g）、KH2PO4（200×0.0005=0.1g）；使用时加入ASA-Na（198.1×0.002=0.3962g）;
2、悬浮液：将PBS提取液中的MES换为238.3×0.05=11.915g的HEPES（238.3×0.05=11.915g）；
3、80%Percol：80ml原液+20ml水；40%Percol：40ml原液+60ml水；
实际配制：
PBS提取液2000ml(3个处理*2个品种*3个重复*20ml*3次=1080ml),
悬浮液100ml（3个处理*2个品种*3个重复*1ml*3次=54ml）;
80%Percol 200ml; 40%Percol 200ml.（3个处理*2个品种*3个重复*3ml*3次=162ml）
二、提取步骤
1、10g鲜样加20ml提取PBS（50mM MES PH6.1，含0.33M山梨糖醇，10mM NaCl，2mM MgCl2，2mM EDTA，0.5 mMKH2PO4，2mM ASA-Na，ASA-Na使用前现配现加）
2、快速研磨，使叶片碎成绿豆粒大小，4层纱布过滤，去除残渣（注意过滤时不可用力挤压，以免叶绿体膜破碎）
3、滤液2000g 3min，小心倒出上清液，将离心管放入离心机后，使离心机的加速很快上升到预定值(水平转头，加速度调到9)，约经30s后很快使其下降停止，整个离心持续大约2-3min左右完成；
4、沉淀用1ml提取液漂洗表面悬浮物；
5、用1ml悬浮液（50mM HEPES pH 7.6，含0.33 mM山梨糖醇，10mM NaCl，2mM MgCl2，2mM EDTA，0.5 mMKH2PO4，2mM ASA-Na，ASA-Na使用前现配现加）将沉淀悬浮，在分散叶绿体时宜用毛笔轻轻刷，或者用手握住离心管在冰块之间搅动，使叶绿体由于震动分散开来，不要用棉球吸滤，以防被膜压破。

叶绿体悬浮时要浓点，含叶绿素2mg.ml-1以上，这样有利于保持活性。

6、2000g 1min;
7、沉淀再用悬浮液悬浮;(悬浮液同5，可以不做)
8、用Percol试剂进行梯度离心（将3ml含有80%Percol（原液按100%算）铺在10ml离心管下层，再把3ml 40%Percol铺在离心管中层，然后将1ml叶绿体悬浮液轻轻铺在离心管上层）1500g 2-3min（用水平离心头的离心机，离心机加速要缓慢上升，加速度调到1），下降也要缓慢下降，否则会破碎Percol的浓度梯度层的形成，取出会看到3层绿色带，最上层为破碎的叶绿体，沉在地层的为粗颗粒，40-80%的Percol
之间的界面有一层绿色层为完整的叶绿体;
9、小心吸出，转移到悬浮介质中，使叶绿体浓度达到1mg.ml-1；（计算：取叶绿体悬浮液0.1ml，加4.9 ml 80%的丙酮，摇匀后于1000g离心2min，上清液置于1cm的比色杯，在625nm上比色，按照公式计算：OD625nm×50/34.5=叶绿素mg/ml）
10、测定叶绿体的完整性，完整率达到85-95%；
参考：Takeda K, Otaubo T,Konda N. Participation of hydrogen peroxide in the inactivation of Calvin-cycle SH enzyme in so2-furmugated spinach leaves. Plant and cell Physiology,1982,23:1009-1018.
取上述制备的完整叶绿体进行如下测定：
1、用50mM PBS（保护酶或其他测定项目的缓冲液）稀释2-5倍，用于测定SOD、POD、CAT、APX；
2、用冷丙酮稀释2倍，取0.5ML提取液用于测定H2O2；（本试验中用0.2 mol/L HClO4稀释）
3、用5%的TCA稀释2-5倍，取1.5ml用于测定MDA；
4、用乙醇：丙酮：水=4.5：4.5：1稀释，用于测定叶绿素；
抗氧化酶（SOD、POD、CAT、APX）活性测定方法
一、超氧化物歧化酶（SOD）活性测定（氮蓝四唑光化还原法）
1、试剂的配制
（1）0.05mol/L磷酸缓冲液(PBS，pH7.8)：
A母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO4·12H2O（分子量358.14）71.7g；
B母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4·2H2O（分子量156.01）31.2g。

分别用蒸馏水定容到1000ml。

0.05mol/L PBS（pH7.8）的配制：分别取A母液(Na2HPO4) 228.75ml，B母液(NaH2PO4) 21.25ml，用蒸馏水定容至1000ml。

参考文献：李合生主编：植物生理生化实验原理和技术.高等教育出版社，2000：267～268。

（2）14.5mM甲硫氨酸溶液：取2.1637g Met用磷酸缓冲液（pH7.8）定容至1000ml。

（3）30μM EDTA-Na2溶液：取0.001gEDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至100ml。

（4）60μM核黄素溶液：取0.0023g核黄素用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存。

（5）2.25mM 氮蓝四唑(NBT)溶液：取0.1840g NBT用PBS定容至100ml，避光保存。

（上述试剂先配好，放到4度冰箱，用之前临时按下面的方法配，然后放在4度冰箱中，不要在最上层，避免见光，第一组样品加好后拿出来加，加完后放回冰箱，第二组的样品加好后再拿出来加）
酶液制备：取0.2g（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，加入1.6ml 50mmol/L预冷的磷酸缓冲液（pH7.8）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4℃、12000g下离心20min，上清液即为酶液。

2、酶活性测定
（1）反应混合液配制(以60个样为准)：分别取Met溶液162ml，EDTA-Na2溶液0.6ml（加的量和前面的浓度要核对），磷酸缓冲液5.4ml，NBT溶液6ml，核黄素溶液6ml,混合后摇匀；
SOD反应混合液：3个处理*2个品种*3次重复*3ml*3次测定=162ml(实际配置200ml)
（2）分别取3ml反应混合液和30μl（可视情况调整，最好先做一个浓度梯度，看加多少合适，如果量太少，最好稀释后再加，这样精确）酶液于试管中（尽可能加到试管的底部，要靠着试管壁打下去先加酶液，后加反应液，加好后摇一摇，看看试管上是不是有雾气，最好拿纱布把试管下边擦一下，免得雾气挡住光线照过去）；
（3）将试管置于光照培养箱中在4000 lux光照下反应20min；（照光很重要，试管要选择相同规格的，
因为不同的试管透光率是不一样的，试管架不要选择遮光的，这个最好分组做，同时几组做相互之间会遮光，每一组一个重复，就是每一组中都要有所有的处理，且都要有一个最大管，处理多的话，把根和叶分开做，最大管放在中间）
同时做两支对照管，其中1支试管取3ml反应混合液加入30μl PBS（不加酶液）照光后测定作为最大光还原管，另1支只加缓冲液置于暗中测定时用于调零。

（4）以不照光的对照管（只有缓冲液并置于暗处）调零后，避光测OD560(出现颜色即可测定)。

（5）酶活性计算：SOD活性单位以抑制NBT光化还原50％所需酶量（测的样品值要在最大管的一半左右才合适，否则要调整酶量）为1个酶活单位（u）。

SOD总活性＝[( A ck-A E )×V]/（1/2A ck×W×Vt）
SOD比活力＝SOD总活性/蛋白质含量
SOD总活性以鲜重酶单位每克表示（u/g FW）；比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示；A ck为照光对照管的吸光度；A E为样品管的吸光度；V为样品液总体积（ml,1.6ml，加入PBS的体积)；Vt为测定时的酶液用量（ml，30ul）；W为样品鲜重（g，测定时应换算为叶绿体的质量mg）；蛋白质含量单位为mg/g。

二、POD、CAT酶活性的测定
粗酶液制备同SOD。

1、过氧化物酶（POD）活性测定（愈创木酚法）
（1）试剂配制：
0.2mol/L磷酸缓冲液(pH6.0)：分别取A母液(Na2HPO4 ) 123ml和B母液(NaH2PO4 ) 877ml混匀即为1000ml PBS(0.2M，pH6.0)；
（2）反应混合液配制（以60个样为准）：
取200ml PBS(0.2M，pH6.0)，加入0.076ml液体（原液）愈创木酚（2-甲氧基酚）加热搅拌溶解，冷却后加入0.112ml 30％的H2O2，混匀后保存于冰箱中备用。

POD反应混合液：3个处理*2个品种*3次重复*3ml*3次测定=162ml(实际配置200ml, 0.076ml, 0.112ml)
（3）样品测定：
取3ml反应液并加入30μl酶液，以PBS为对照调零，而后测定OD470值（测定40秒）。

（边加样边测定，测定前等待5秒，动作要快，如果慢的话，要保证每个样品从加好样到开始记时的时间相差不大）
（4）酶活性计算：以每min OD值变化（升高）0.01为1个酶活性单位（u）。

POD=（ΔA470×Vt）/（W×Vs×0.01×t）(u/g min)
ΔA470：为反应时间内吸光度的变化；W为样品鲜重(g)；t为反应时间(min)；Vt为提取酶液总体积（ml，(1.6ml）；Vs为测定时取用酶液体积（ml，30ul）。

2、过氧化氢酶（CAT）活性测定
（1）试剂配制：
0.15mol/L磷酸缓冲液（pH7.0）：取A母液(Na2HPO4) 457.5 ml 和B母液(NaH2PO4) 292.5 ml混合后用蒸馏水定容至1000ml。

（2）反应液配制：取200ml PBS（0.15M，pH7.0），加入0.3092ml 30%的H2O2（原液）摇匀即可。

CA T反应液：3个处理*2个品种*3次重复*3ml*3次测定=162ml(实际配置200 ml, 0.3092ml)
（3）样品测定：取3ml反应液加入0.1ml（可视情况调整）酶液，以PBS为对照调零，测定OD240（紫外）（测定40s）。

（4）酶活性计算：以每min OD值减少0.01为1个酶活性单位（u）。

CA T=[ΔA240×Vt ]/（W×Vs×0.01×t）(u/g min)
ΔA240：为反应时间内吸光度的变化；W为样品鲜重(g)；t为反应时间(min)；Vt为提取酶液总体积（ml，1.6ml）；Vs为测定时取用酶液体积（ml, 0.1ml）。

三、抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性的测定（缓冲液为K）
1、试剂配制（按50个样计算）：
（1）0.05 mol/L K2HPO4-KH2PO4缓冲液（pH7.0）的配制：
（A）K2HPO4·3H2O：228.22×0.05×0.61=6.9607g
（B）KH2PO4：136.09×0.05×0.39=2.6538g，以上两者混合起来用去离子水定容到1L。

（2）0.1 mM EDTA-Na2：取0.01861g EDTA-Na2用PBS溶液定容到500 ml（372.24 g/M×0.1mM×500ml=0.01861 g）；
（3）5 mM AsA：取0.044g抗坏血酸用PBS溶液定容到50ml（现用现配，176.13g/M5mM×50ml=0.044 g）；
（4）20mMH2O2：取0.2ml,30%H2O2用去离子水稀释到100ml（30% H2O2为550g×30%/(34.01g/M×0.5L)=9.703M）。

实际配置
0.1 mM EDTA-Na2：3个处理*2个品种*3次重复*1.7ml*3次测定=91.8ml;（实际配置250 ml,0.009305g）
5 mM的AsA: 3个处理*2个品种*3次重复*0.1ml*3次测定=5.4ml;（实际配置50 ml,0.044g）
20mM H2O2: 3个处理*2个品种*3次重复*0.1ml*3次测定=5.4ml;（实际配置50 ml,0.1ml）
2、酶活性的测定（以2 ml体系测定）
（1）取0.10 ml 酶液（可视情况调整），加入1.70 ml 含0.1 mM EDTA-Na2的PBS（0.05 mol/L，pH7.0），再加入0.10 ml 5 mM的AsA，最后加入0.10 ml 20mM H2O2，立即在20℃下测定D290（紫外）值在40s 内（测定时间内变化大可测定的时间短点，否则长点）的变化，计算单位时间内AsA减少量和酶活性（室温下测定，缓冲液调零）。

计算公式：
△OD/△t×Vr×VT
A×d×Vt×W
△OD为反应时间内吸光度的变化（40秒吸光度－0秒吸光度）；△t为反应时间（40秒）；Vr为反应液体积（2mL）；VT提取液体积（1.6mL）；A为消光系数（2.8mM-1.cm-1）；d为比色杯厚度（1cm）；Vt 测定液体积（0.1mL）；W为样品鲜重（0.2g）。

四、超氧阴离子自由基（O2.-）产生速率的测定（羟胺氧化法）
1、试剂的配制
（1）1mM盐酸羟胺溶液：称取0.02085g盐酸羟胺用蒸馏水定容至300ml；
（2）17mM对氨基苯磺酸溶液：称取1.1776g对氨基苯磺酸用少量冰醋酸水溶液（冰醋酸：水=1：3配制）加热溶解后定容至400ml；
（3）7mMα-萘胺溶液：称取0.4008gα-萘胺用冰醋酸水溶液（冰醋酸：水=3：1配制）定容至400ml。

实际配置
PBS（0.05M，pH7.8）: 3个处理*2个品种*3次重复*0.5ml*3次测定=27ml;（实际配置100 ml）
1mM盐酸羟胺溶液: 3个处理*2个品种*3次重复*1ml*3次测定=54ml;（实际配置100 ml,0.00695g）17mM对氨基苯磺酸: 3个处理*2个品种*3次重复*1ml*3次测定=54ml;（实际配置100 ml,0.2944g）7mMα-萘胺溶液：3个处理*2个品种*3次重复*1ml*3次测定=54ml;（实际配置100 ml,0.1004g）
2、O2.-含量的测定
（1）样品液提取方法同SOD测定；
（2）取0.5ml提取液（酶液）（可视情况调整用量）中加入0.5ml PBS（0.05M，pH7.8），1ml 1mM盐酸羟胺溶液后摇匀。

（3）在25℃下保温1小时；
（4）依次先加入1ml 17mM对氨基苯磺酸，再加入1ml 7mM α-萘胺，混合后快速摇匀；
（5）在25℃下保温20min后在3000×g下离心3min后马上进行测定（或置于冰箱待测）；
（6）以对照管调零（用水调零），取粉红色水相液测定OD530值（测定）；
（7）O2.-含量的计算：由测得的OD530，查NO2-标准曲线得到[NO2-]；根据羟胺与O2.-的反应式：NH2OH ＋2O2.-＋H+NO2-＋H2O2＋H2O 计算[O2.-]，即[NO2-]×2=[O2.-]；再根据样品与羟胺反应的时间和样品中的蛋白质含量，求得O2.-产生速率（以nmol min-1mg-1蛋白表示，也可以nmol min-1g-1鲜重表示）。

O2.-产生速率=（C×V）/（t×W）（nmol min-1g-1鲜重）
C为标准曲线上查得的浓度(umol/L)；V为测定时所取提取液用量(叶绿体稀释后的体积)；t为反应时间(60min)；W为样品鲜重(叶绿体实际质量g)
参考文献：王爱国，罗广华．植物生理学通讯，1990，（6）：55～57
五、可溶性蛋白含量的测定（考马斯亮蓝染色法）
1、试剂的配制
（1）考马斯亮蓝溶液配制：称取100 mg考马斯亮蓝，溶于50 ml 90％乙醇中，加入100 ml 85％（W/V）的磷酸，再用蒸馏水定容到1Ｌ。

在过夜后过滤并贮于棕色瓶中，常温下可在暗中保存一个月。

（2）100μg/ml牛血清蛋白（BSA）标准溶液：称取25mg BSA加水溶解后定容至100 ml，再从中吸取40ml用蒸馏水定容至100 ml（也可取10mg BSA定容至100ml即为100μg/ml标准BSA溶液）。

实际配置
0.05M，pH7.8磷酸缓冲液：3个处理*2个品种*3次重复*0.08ml*3次测定=0.3456ml;（实际配置100 ml,）
考马斯亮蓝溶液: 3个处理*2个品种*3次重复*2.9ml*3次测定=156.6ml; （实际配置200 ml，20mg）
2、样品可溶性蛋白含量的测定
（1）样品可溶性蛋白含量测定：取20μl提取液（酶液）加入80μl，0.05M，pH7.8磷酸缓冲液（即稀释成0.1ml提取液），再加入2.9ml考马斯亮蓝溶液，反应2min后测OD595（以100μl缓冲液加2.9ml考马斯亮蓝为对照调零）。

（2）蛋白质含量计算：
可溶性蛋白质含量（mg/g）=(C×V T)/(W×V S×1000)
C为标准曲线查得的蛋白质含量（μg）；V T为提取液总体积（稀释后的体积ml）；V S为测定时所用提取液体积（ml，20μl）；W为样品鲜重（g）。

过氧化氢（H2O2）含量的测定
一、试剂配制：
1、0.2 mol/L HClO4：取10.05g HClO4溶解于0.5L的水中；
2、4 mol/L KOH：取112 g KOH溶解于0.5L的水中；
3、0.1 mol/L，pH 6.5的磷酸缓冲液：Na2HPO4·12H2O5.6407g+NaH2PO4·2H2O5.3433g用去离子水定容到500ml；
4、显色液：100mL、0.1 mol/L、pH 6.5的磷酸缓冲液+25 μL N,N-二甲基苯胺+10 mg 4-氨基氨替吡啉；
5、过氧化物酶溶液（250 U/mL）
二、测定步骤：
称取植株根和叶片组织各0.5g，分别置于研钵中，加入1.6 mL预冷至4℃的0.2 mol/L HClO4，冰浴匀浆，于10 000×g离心5 min（4℃），取上清液，加4 mol/L KOH调pH值为7.5后，再于10 000×g离心5 min （4℃），取上清液1 mL，加0.4 mL显色液和0.1mL过氧化物酶溶液（250 U/mL），用岛津UV-1601分光光度计测定波长550 nm（可见）处光密度值的变化，H2O2含量以μmo l/gFW表示。

（用什么调零？）
三、计算方法：（要做标线？）
参考：过氧化氢（H2O2）含量的测定参照Uchida等(2002)方法并加以改进。

还原型谷胱苷肽GSH
2．试剂配制
（1）1mM GSH标准液10mL（现用现配）：称3.0733mgGSH,加蒸馏水至10mL。

(不要)
（2）5％磺基水杨酸500mL：25g溶于500mL水中。

（3）6mM DTNB：称取0.118905g DTNB溶于50mL PBS（0.1M，pH7.5）中。

（4）2mM NADPH：18.1mg NADPH溶于10mL PBS中。

（5）1mMGSSG标准液10mL：6.126mg GSSG加PBS至10mL。

(不要)
实际配置
0.1M PBS(pH 7.5): 3个处理*2个品种*3次重复*0.5ml*3次测定=27ml; （实际配置50 ml）
6mM DTNB: 3个处理*2个品种*3次重复*0.2ml*3次测定=10.8ml; （实际配置50 ml，实际用量0.1189g）2mM NADPH: 3个处理*2个品种*3次重复*0.1ml*3次测定=5.4ml;（实际配置50 ml, 实际用量18.1mg）(1U)GRⅢ: 3个处理*2个品种*3次重复*0.1ml*3次测定=5.4ml; （实际配置50 ml, 实际用量10ml）5％磺基水杨酸：3个处理*2个品种*3次重复*0.01ml*3次测定=0.54ml;（实际配置10ml）(实际用量0.5g/10ml)
0.5mM PBS: 3个处理*2个品种*3次重复*1.5ml*3次测定=81ml; （实际配置100 ml）
乙醚（二乙醚）: 3个处理*2个品种*3次重复*10ml*3次测定=540ml; （实际配置1000 ml）
PBS Buffer 0.5mM: 3个处理*2个品种*3次重复*1.5ml*3次测定=81ml; （实际配置150 ml）
2-乙烯吡啶: 3个处理*2个品种*3次重复*0.2ml*3次测定=10.8ml; （实际用量20 ml）
乙醚: 3个处理*2个品种*3次重复*10ml*3次测定=540ml; （实际用量1000 ml）
1．标线制作：
配制浓度为0，0.02mM,0.04mM,0.06mM,0.08mM,0.1mM,0.12mM的标准GSH溶液（吸取上述标准液各0.1mL）加入0.5mL 0.1M磷酸钠Buffer（pH7.5）(含5mM EDTA)，0.2mL 6mM DTNB,0.1mL 2mM NADPH,0.1mL(1U)GRⅢ（谷胱甘肽还原酶）(sigma),从0.1mL GSH启动反应，测定650s的A412（OD412），绘制标准曲线。

以PBS代替DTNB作空白。

3．GSH（还原型谷胱甘肽）及GSSH（氧化型谷胱甘肽）
（1）取1g新鲜叶片，加入10µL（可以取0.2g鲜样，加1.6ml提取液）5％磺基水杨酸，研磨后在14000g 离心10分钟，取1mL上清液，加入1.5mL,0.5mM PBS （pH7.5）中，再用5mL乙醚（二乙醚）抽取二次（杂质会融到乙醚层中，而乙醚处于整个反应体系得上层，你直接用枪吸取上层乙醚丢弃即可，反复进行两次即为抽取两次），此提取液用于分析总谷胱苷肽含量。

各取1mL上清液，加入1.5mL PBS Buffer 0.5mM (pH7.5),0.2mL 2-乙烯吡啶（原装试剂浓度）混合至乳胶状，在25℃反应1小时，再用5mL乙醚（原装试剂浓度）抽提2次，此提取液用于分析GSSG『GSSG －氧化型谷胱甘肽，GSH－还原型谷胱甘肽不能够直接测出，需测出氧化型和还原型谷胱甘肽含量，即总的谷胱甘肽含量，然后减去氧化型谷胱甘肽(GSSG）含量得到还原型谷胱甘肽含量（GSH））
（2）取反应混合液（0.5mL 0.1M PBS(pH 7.5)(内含5mM EDTA)，0.2mL 6mM DTNB，0.1mL 2mM NADPH,0.1mL(1U)GRⅢ（sigma），由加入0.1ml提取液开始反应，测OD412，在25℃下，反应650s（大约十分钟），分别计算总谷胱苷肽及GSH含量。

以不加DTNB，加相应剂量的PBS作空白。

GR（谷胱苷肽还原酶）测定
一、试剂配置
50mM PBS（K）（pH 7.0，含0.2mmol EDTA,与APX的相同）：K2HPO4·3H2O 6.9607g+KH2PO4 2.6538g混合后定容到1L；然后加入292.25×0.2=58.45gEDTA;
10mM GSSG（用水配）：612.63×10×0.001=6.126g溶于1L水中;
2.4mM NADPH（用PBS配）：83
3.4×2.4×0.001=2.0g溶于1L水中.
实际配置
50mM PBS（K）: 3个处理*2个品种*3次重复*1.7ml*3次测定=91.8ml; （实际配置150 ml,实际用量58.45g*0.15=8.7675g）
10mM GSSG:3个处理*2个品种*3次重复*0.1ml*3次测定=5.4ml; （实际配置50 ml,实际用量6.126g*0.05=0.3063g）
2.4mM NADPH:3个处理*2个品种*3次重复*0.1ml*3次测定=5.4ml; （实际配置50 ml,实际用量2.0g*0.05=0.1g）
二、测定步骤
用3mL比色杯，依次加入1700µL 50mM PBS（K）（pH 7.8，含0.2mmol EDTA），100µL 10mmol GSSG，
100µL 2.4mmol NADPH，100µL 酶液（叶绿体悬浮液，与APX相同）启动反应，25℃，以NADPH启动发应（指最后加NADPH），测定OD340，1min变化值，吸光系数2.8mM-1cm-1，不加NADPH为对照（调零）。

四、计算方法：
△OD/△t×Vr×VT
A×d×Vt×W
△OD为反应时间内吸光度的变化（60秒吸光度－0秒吸光度）；△t为反应时间（60秒）；Vr为反应液体积（2mL）；VT提取液体积（叶绿体稀释后的体积）；A为消光系数（2.8mM-1.cm-1）；d为比色杯厚度（1cm）；Vt测定液体积（0.1mL）；W为样品鲜重（叶绿体质量）。