过氧化氢酶米氏常数的测定

过氧化氢酶米氏常数的测定

一、实验目的

1. 了解米氏常数的测定方法

2. 学习提取生物组织中的酶

二、实验原理

1.米氏反应动力学

米氏方程 (Michaelis-Menten Equation):

2.米氏常数的意义：

①反映酶的种类：Km是一种酶的特征常数，只与酶的种类有关，与酶浓度、底物浓度无

关。

②米氏常数是酶促反应达到最大反应速度Vmax一半时的底物浓度。其数值大小反映了

酶与底物之间的亲和力：Km值越大，亲和力越弱，反之Km值越小，亲和能力越强。

③Km可用来判断酶（多功能酶）的最适底物：Km值最小的酶促反应对应底物就是该酶

的最适底物。

3.米氏常数的求法：

该方法的缺点是难以确

定最大反应速度Vmax。

该作图法应用最广。但在低浓度是v值误差较大，在[S]等差值实验时作图点较集中于纵轴。因此在设计底物浓度时，最好将1/[S]配成等差数列，这样可使点距较为平均，再配以最小二乘回归法，就可以得到较为准确的结果。

此法优点是横轴上点分布均匀，缺点是1/v会放大误差，同时对底物浓度的选择有要求。[S]<>Km时直线将在原点附近与轴相交。

4.氧化酶：生物体内重要的三种氧化酶类，其作用均是消除体内自由基：

①POD：过氧化物酶

②SOD:超氧化物歧化酶

③CAT：；过氧化氢酶

5.过氧化氢酶的作用：

植物体内活性氧代谢加强而使过氧化氢发生积累。过氧化氢可进行一步生成氢氧自由基。氢氧自由基是化学性质最活泼的活性氧，可以直接或间接地氧化细胞内核酸、蛋白质等生物大分子，并且有非常高的速度常数，破坏性极强，可使细胞膜遭受损害，加速细胞的衰老和解体。过氧化氢酶（catalase，CAT）可以清除过氧化氢、分解氢氧自由基，保护机体细胞稳定的内环境及细胞的正常生活，因此CAT是植物体内重要的酶促防御系统之一，其活性高低与植物的抗逆性密切相关。

6.过氧化氢酶活力的测定方法：

①紫外吸收法：

过氧化氢在240nm波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度（A240nm）随反应时间而降低。根据测量吸光度的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。（以一分钟内A240nm下降为一个单位）

②滴定法（高锰酸钾法、碘量法）

在反应系统中加入一定量（反应过量）的过氧化氢溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴定多余的过氧化氢。根据单位时间内消耗的过氧化氢的量即可测出过氧化氢酶活力大小。

7.实验中的反应：

H2O2被过氧化氢酶分解出 H2O 和 O2 , 未分解的 H2O2 用 KMnO4 在酸性环境中滴定, 根据反应前后的浓度差可以算出反应速度:

酶

2H2O2 ?→ 2H2O + O2

2KMnO4+5H2O2+3H2SO4 ?→ 2MnO4+K2SO4+8H2O+5O2

（本实验以马铃薯提供过氧化氢酶）

三、实验试剂

1. 0.02mol/L 磷酸缓冲溶液 (pH=: 实验室提供.

2. 酶液: 称取马铃薯 5g, 加缓冲液 10mL, 匀浆过滤.

3. 0.01mol/L 高锰酸钾.

4. L H2O2.

5. 25%H2SO4.

四、实验操作

取 6 只锥形瓶, 按下表的顺序加入试剂.

先加好过氧化氢和蒸馏水, 加酶液后立即混合, 依次记录各瓶的起始反应时间. 反映到达 5min 立即加入2ml 25%硫酸终止反应, 充分混匀.。用 L 的 KMnO4溶液滴定瓶中剩余的过氧化氢至微红色, 记录消耗的高锰酸钾体积.。

五、注意事项：

1.反应时间必须准确。

2.酶浓度须均一，若酶活力过大，应适当稀释。

3.滴定终点的判定。

六、实验结果：

过氧化氢浓度：L

称取马铃薯的质量：

七、实验结果分析：

1.曲线上少一个点的原因：

用移液管移取序号为2的过氧化氢溶液（应为）错误的移取了，故在制图时将其舍去。

2.曲线线性较好（R2=）的原因：

本实验采取了两人分工的方法完成实验，控制反应结束及滴定分别由一人完成，所以标准都相同，从而在一定程度上提高了实验的准确性。

3.Km计算结果呈负值的原因：

Km呈负值（即整条直线都向下移动），亦即所有测定的v值都偏大。

由v=(c1**c2*V2)/5，故推断最可能的原因是V2整体测量偏小，可能的操作失误是编号为0的空白对照组中高锰酸钾的滴加量偏高，从而使除去该点的整体的高锰酸钾量都偏小。