微生物常规鉴定技术

（三） V-P试验
1、原理：某些细菌能分解葡萄糖产生丙酮酸， 丙酮酸经缩合、脱羧生成乙酰甲基甲醇，后 者在强碱环境下，被空气中的氧氧化为双乙 酰，在α-萘酚和肌酸的催化作用下，双乙酰 与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称V－P （+）反应。
2、试验方法
（1）奥梅拉（O’Meara）法 （2）贝立脱（Barritt）氏法 （3）快速法
3、结果观察与记录
培养基底部呈黑色，为阳性，记+ 培养基底部无黑色，为阴性，记-
（三） 尿素酶试验
1、原理： 某些细菌能产生尿素酶，将尿素分
解产生氨，氨使培养基变为碱性，使培 养基中的酚红指示剂呈粉红色，培养基 由黄色变为红色，为阳性。以此鉴别细 菌。
2、试验方法：
挑取大量培养18~24h的待试菌，浓密涂布 接种于尿素琼脂斜面上，不要到达底部，留底 部作变色对照。培养2、4和24h分别观察一次 结果，培养基变为粉红色为阳性，颜色不变者 为阴性。如阴性应继续培养至4天，作最终判 定。
3. 根据酶作用的反应特性，测定酶的存在。 4. 根据细菌对理化条件和药品的敏感性，
观察细菌的生长情况。
（四）生化试验的注意事项
1、待检菌应是新鲜培养物。培养18~24h。 2、待检菌应是纯种培养物。 3、遵守观察反应的时间。观察结果的时间，
多为24或48小时。 4、应做必要的对照试验。 5、提高阳性检出率，至少挑取2~3待检的疑
2、试验方法：
所用试剂: （1）柯凡克(Kovacs)试剂; 或 （2）欧—波试剂
将待检菌小量接种于培养基中，于 36±1 ℃培养24~48h时后，加入柯凡克 试剂数滴，轻摇试管，呈红色者为阳性。
或沿试管壁缓慢加入欧-波试剂约 0.5ml覆盖液面，两液接触处呈现玫瑰红 色者，为阳性反应，无红色者为阴性反 应。
3、结果观察和记录
记录： 产酸不产气，阳性，以“+”表示 产酸产气，阳性，以“⊕”表示 不产酸产气，阴性，以“-”表示
导
气气 泡泡
气 泡
管
阳性
阳性
阴性
（二）葡萄糖氧化发酵（O/F）试验
1、原理： 细菌对葡萄糖的分解，分为氧化型和发酵 型。氧化型细菌在有氧的条件下才能分解 葡萄糖，无氧的条件下不能分解葡萄糖； 发酵型细菌在有氧无氧条件下均可分解葡 萄糖；不分解葡萄糖的细菌称为产碱型。 根据糖管的色泽变化可鉴别细菌。
3、结果观察与记录
明胶液化，为阳性，+。 明胶凝固，为阴性，-。
复习题
1、简述靛基质试验的原理，写出其试验方法、结果 的记录和注意事项
2、简述硫化氢试验的原理，写出其试验结果的记录 和注意事项
3、简述尿素酶试验的原理，写出其试验方法、结果 的记录
4、简述氨基酸脱羧酶试验的原理，写出结果的记录、 阳性反应试验管颜色变化过程和原理
奥梅拉法：
将试验菌接种于磷酸盐葡萄糖蛋白胨 水培养基，于36±1 ℃培养48h， 每1ml 培养液加奥梅拉O’Meara试剂0.1ml，摇 动试管1~2min，静置于37℃恒温箱4h ， 或在48~50 ℃水浴放置2h后判定结果。
3、结果观察与记录
（1）发酵管出现红色者，为阳性， 记 VP+
（2）发酵管为黄色或铜绿色者，为阴性， 记 V-P -
苯丙氨酸脱去氨基，形成苯丙酮酸，苯 丙酮酸与氯化铁作用生成绿色化合物， 以此鉴别细菌。
2、试验方法
从待检菌琼脂斜面上挑取大量培养物， 接种于苯丙氨酸培养基上，在36±1 ℃ 培养18~24h后，加入氯化铁溶液4~5 滴，转动试管，使试剂与菌苔表面充 分接触，立即观察结果。
3、结果观察与记录
试验管立即 出现绿色， 为阳性，记 +
2、试验方法
取待检菌新鲜纯培养物，接种于丙 二酸钠培养基上，于36±1 ℃培养48h， 观察结果。
3、结果观察与记录
培养基由草绿色变成蓝色,为阳性,记+; 培养基无颜色变化,为阴性,记-
五、 呼吸酶类试验
过氧化氢酶试验 硝酸盐还原试验 氰化钾试验
（一） 过氧化氢酶试验
1.原理： 某些细菌可分泌过氧化氢酶，加
（二）硝酸盐还原试验
1、原理：某些细菌具有还原硝酸盐的能力，可 将硝酸盐还原为亚硝酸盐，在酸性条件下，亚 硝酸盐可生成亚硝酸，亚硝酸与对氨基苯磺酸 作用，生成重氮苯磺酸，重氮苯磺酸再与α-萘 胺作用，生成红色的化合物，呈红色反应，为 阳性反应。
试剂
A、对氨基苯磺酸试剂 B、α-萘胺试剂
2、试验方法
（四）甲基红试验（MR）
1、原理 细菌分解葡萄糖产生丙酮酸后， 由于代谢的途径不同，有的细菌可使丙酮 酸转化生成乳酸、琥珀酸、醋酸和甲酸等 大量酸性产物，使培养基PH值下降至 pH4.5以下，使甲基红指示剂变红色，为 甲基红试验阳性 ；有的细菌使丙酮酸脱羧 后形成酮、醇类中性产物，培养液pH＞ 5.4，甲基红指示剂呈桔黄色，为甲基红试 验阴性。
2、试验方法
取培养20～24h的营养肉汤培养液 或菌落1环，接种至对照培养基及氰化 钾培养基内，立即以橡胶塞塞紧， 36±1 ℃培养24～ 48h，观察结果。
3、结果观察与记录
对照管有菌生 长，试验管有 菌生长为阳性， 记+。
对照管有菌生 长，试验管无 菌生长为阴性。 记-。
MR +；
（2）呈橘黄色或黄色
为阴性，记MR -，
迄至发现阴性并培
养至第5天仍为阴性，
即可判定结果
MR +
MR -
复习题
1、什么是生化试验? 2、做生化试验要注意哪些事项？ 3、简述糖醇类发酵试验的原理，写出其试验方
法和结果的记录 5、简述甲基红试验（MR）的原理，写出其试验
方法和结果的记录
三、氨基酸和蛋白质代谢试验
取待检菌新鲜纯培养物，在硝酸盐培养基 上接种，在36±1 ℃培养1~4天，每天取 2mL培养液,加入A、B试剂的等量混合物 各二滴混匀，立即观察结果。
3、结果观察与记录
呈现红色，为阳性， 记+
若无红色出现，为 阴性，记-
（四） 氰化钾试验
1.原理：
氰化钾是细菌呼吸酶系统的抑制剂,可与 呼吸酶作用使酶失去活性,抑制细菌的生长, 但有的细菌在一定浓度的氰化钾存在时仍能 生长,以此鉴别细菌.
无色为阴性， 记 -。
加氯化 铁试剂
出现绿色+
（六） 明胶液化试验
1、原理 有些细菌具有明胶酶（亦称类蛋白
水解酶），能将明胶先水解为多肽，又 进一步将多肽水解为氨基酸，明胶失去 凝胶性质，使培养基由固态变为液态。
2、试验方法
挑取培养18~24h的待试菌，以较大量穿刺 接种于明胶高层约2/3深度。于20~22℃培养 7~14天。明胶高层亦可培养于36±1℃。另取 一支未接种的培养基一同培养作对照，每天取 出两支试管，放入冰箱放置20~30min后，再观 察结果。
似菌落分别进行试验。
二、糖醇类代谢试验
（一）糖醇类发酵试验 （二）葡萄糖氧化发酵（O/F）试验 （三）V-P试验 （四）甲基红（Methyl Red）试验 MR
（一） 糖醇类发酵试验
1.原理：不同的细菌对各种糖醇的分解能力及所 产生的代谢产物各不同，有的能分解多种糖醇， 有的只能分解1~2种糖醇 ，有的分解糖醇能产 酸产气，有的分解糖醇只产酸不产气，根据这 些特点，可鉴别细菌。
常用的糖醇
单糖：葡萄糖、甘露糖醇、木糖、半乳糖鼠李糖 双糖：乳糖、蔗糖、麦芽糖、蕈糖 三糖：棉子糖 多糖：菊糖、肝糖、淀粉 醇类：甘露醇、山梨醇、肌醇、卫茅醇
2、试验方法：
用接种针或环移取纯培养物少许，接种 于糖发酵管中，若为半固体培养基，则用 接种针作穿刺接种。置36±1.0℃ 培养 1~3天，每天观察结果。
第二章 微生物常规鉴定技术
食品微生物检验常用的仪器 培养基和实验室基本操作技术 生物安全实验室 生化实验和血清学实验
生化实验和血清学实验
• 常见的生化反应原理及现象 • 血清学试验原理
一、概述
（一）、什么是生化试验? 指通过利用生物化学的方法来测定
微生物的代谢产物、代谢方式和条件等 来鉴别细菌的类别、属种的试验。
2、方法
取待检菌，以穿刺法接种于两管葡萄 糖半固体培养基上，在其中一管加入 一层（约1Cm）灭菌的液体石蜡以隔 绝空气，在37℃培养2~4h天，每天 观察结果。
3、结果观察与记录
封油管 发酵型 产酸（黄色）
未封油管 产酸（黄色）
氧化型 不产酸（绿色） 产酸（黄色）
产碱型 不产酸（绿色） 不产酸（绿色）
入过氧化氢后Leabharlann Baidu可将过氧化氢分解生 成水和氧气，产生气泡，即为阳性反 应。
2、试验方法
挑取固体培养基上的新鲜菌落一环，置于洁 净玻片上（或试管），滴加3%过氧化氢液 数滴，或在琼脂斜面培养物上直接滴加过氧 化氢液，立即观察结果。
3、结果观察与记录
产生气泡者，为阳性，记+ 不产生气泡者，为阴性，记-
3、结果观察与记录
斜面有菌苔生长， 培养基斜面变为 蓝色或深蓝色， 为阳性，记+；
无菌苔生长，培 养基斜面仍为绿 色者，为阴性， 记-
阳性+
（二） 丙二酸盐利用试验
1.原理: 某些细菌可以利用培养基中的丙二
酸盐作为唯一碳源,丙二酸盐被分解成碳 酸钠,使培养基变为碱性,培养基由草绿色 变成蓝色，为阳性，以此鉴别细菌。
四、 有机酸盐和铵盐的利用试验
枸橼酸盐利用试验
丙二酸盐利用试验
（一） 枸橼酸盐利用试验
1、原理： 某些细菌能利用柠檬酸盐作为唯一碳
源，分解枸橼(柠檬)酸盐生成碳酸盐；同 时分解培养基的铵盐生成氨，使培养基变 为碱性，使指示剂溴麝香草酚蓝由淡绿转 为深蓝色，为阳性。
2、试验方法
挑取待检菌，在西蒙枸橼酸盐培养基斜面 上密集划线接种，在36±1 ℃培养1~4天， 每天观察结果。
2、试验方法：
挑取新鲜的待试培养物少许，接种 于磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基，于 36±1 ℃或30 ℃（以30 ℃较好）培养 3~5天，从第48h起，每日取培养液1ml， 加入甲基红指示剂1~2滴，立即观察结 果。
MR-VP试验原理及照片
V-P
3、结果观察与记录
（1）呈鲜红色或橘红 色为阳性，呈淡红 色为弱阳性，记
（二） 检验细菌的生化试验范围
1、糖（醇）类代谢试验 2、氨基酸和蛋白质代谢试验 3、有机酸盐和铵盐的利用试验 4、呼吸酶类试验 5、毒性酶类试验
（三）生化试验的方法
1. 在培养物中加入某种底物与指示剂,经接 种、培养后,观察培养基的PH值变化。
2. 在培养物中加入试剂，观察它们同细菌 代谢产物所生成的颜色反应。
（一）靛基质（吲哚）试验 （二）H2S试验 （三）尿素酶试验 （四）氨基酸脱羧酶试验 （五）苯丙氨酸脱氨酶试验
(六) 明胶（Gelatin）液化试验
（一） 靛基质试验
1、原理：某些细菌含有色氨酸酶，能分解蛋
白胨中的色氨酸，生成靛基质（吲哚）。吲 哚与对二甲氨基苯甲醛结合，可形成红色化 合物，即玫瑰吲哚，以此鉴别细菌。
取待检菌，分别接种于含有氨基酸 的培养基内和不含氨基酸的对照培养基 内，在36±1 ℃培养1~4天（指示剂为 溴甲酚紫），每天观察结果。
3、结果观察与记录
试验管呈紫色，对照管呈黄色，为阳性， 记+
试验管、对照管都呈黄色，为阴性， 记 -。
对
试 验 管
试
照
对验
管
照管
变
管变
黄
黄
阳性+
阴性-
阳性反应试验管颜色变化过程
3、结果观察与记录
呈现玫瑰红色， 为阳性反应， 记+ 无红色者，为 阴性反应，记-
靛基质+
（二） 硫化氢（H2S）试验
1、原理： 某些细菌可分解培养基中的含硫氨基
酸或含硫化合物，产生硫化氢，硫化氢 遇铅盐或铁盐可生成黑色沉淀物PbS或 FeS，以此鉴别细菌。
2、试验方法：
挑取待检菌，用穿刺接种法接种于三糖铁培 养上，于36±1℃培养24~48h，观察结果。
紫色→黄色→紫色 原理：
对照管呈黄色，说明有细菌生长。在培养的早 期（10~12h），细菌发酵葡萄糖产酸使培养液 PH下降，指示剂溴甲酚紫由紫色变为黄色，以 后由于氨基酸脱羧生成胺，PH又回升至碱性， 指示剂显紫色。
阳性反应试验管颜色变化过程： 紫色→黄色→紫色
（五） 苯丙氨酸脱氨酶试验
1、原理： 某些细菌可产生苯丙氨酸脱氨酶，使
3、结果观察与记录
培养基变呈粉 红色，为阳性， 记+
培养基颜色不 变，为阴性， 记-
阳性
（四） 氨基酸脱羧酶试验
1、原理： 某些细菌能产生氨基酸脱羧酶, 可使
赖氨酸、鸟氨酸生产脱羧作用, 生成胺 类物质和CO2。胺类物质使培养基呈碱 性变紫色，为阳性, 如呈黄色为阴性， 以此鉴别细菌。
2、试验方法