多糖的提取分离方法

1、多糖的提取方法

生物活性多糖主要有真菌多糖、植物多糖、动物多糖3 大类。多糖的提取首先要根据多糖的存在形式及提取部位,决定在提取之前就是否做预处理。动物多糖与微生物多糖多有脂质包围,一般需要先加入丙酮、乙醚、乙醇或乙醇乙醚的混合液进行回流脱脂,释放多糖。植物多糖提取时需注意一些含脂较高的根、茎、叶、花、果及种子类,在提取前,应先用低极性的有机溶剂对原料进行脱脂预处理,目前多糖的提取方法主要有溶剂提取法、生物提取法、强化提取法等。

1.1溶剂法

1.1.1水提醇沉法

水提醇沉法就是提取多糖最常用的一种方法。多糖就是极性大分子化合物,提取时应选择

水、醇等极性强的溶剂。用水作溶剂来提取多糖时,可以用热水浸煮提取,也可以用冷水浸提渗滤,然后将提取液浓缩后,在浓缩液中加乙醇,使其最终体积分数达到70 %左右,利用多糖不溶于乙醇的性质,使多糖从提取液中沉淀出来,室温静置 5 h,多糖的质量分数与得率均较高。影响多糖提取率的因素有:水的用量、提取温度、浸提固液比、提取时间以及提取次数等。

水提醇沉法提取多糖不需特殊设备,生产工艺成本低,安全,适合工业化大生产,就是一种可取的提取方法。但由于水的极性大,容易把蛋白质、苷类等水溶性的成分浸提出来,从而使提取液存放时腐败变质,为后续的分离带来困难,且该法提取比较耗时,提取率也不高。

1.1.2酸提法

为了提高多糖的提取率,在水提醇沉法的基础上发展了酸提取法。如某些含葡萄糖醛酸等酸性基团的多糖在较低pH 值下难以溶解,可用乙酸或盐酸使提取液成酸性,再加乙醇使多糖沉淀析出,也可加入铜盐等生成不溶性络合物或盐类沉淀而析出。

由于H＋的存在抑制了酸性杂质的溶出,稀酸提取法提取得到的多糖产品纯度相对较高,但在酸性条件下可能引起多糖中糖苷键的断裂,且酸会对容器造成腐蚀,除弱酸外,一般不宜采用。因此酸提法也存在一定的不足之处。

1.1.3碱提法

多糖在碱性溶液中稳定, 碱有利于酸性多糖的浸出,可提高多糖的收率,缩短提取时间,但提取液中含有其它杂质,使粘度过大,过滤困难,且浸提液有较浓的碱味,溶液颜色呈黄色,这样会影响成品的风味与色泽。

1.1.4超临界流体萃取法

超临界流体萃取技术就是近年来发展起来的一种新的提取分离技术。超临界流

体就是指物质处于临界温度与临界压力以上时的状态,这种流体兼有液体与气体的特点,密度大,粘稠度小,有极高的溶解,渗透到提取材料的基质中,发挥非常有效的萃取功能。而且这种溶解能力随着压力的升高而增大,提取结束后,再通过减压将其释放出来,具有保持有效成分的活性与无溶剂残留等优点。由于CO2的超临界条件(TC＝304.6 ℃,Tp＝7.38 MPa)容易达到,常用于超临界萃取的溶剂,在压力为8～40 MPa 时的超临界CO2足以溶解任何非极性、中极性化合物,在加入改性剂后则可溶解极性化物。

该法的缺点就是设备复杂,运行成本高,提取范围有限。

1.2酶解法

1.2.1单一酶解法

单一酶解法指的就是使用一种酶来提取多糖,从而提高提取率的生物技术。其中经常使用的酶有蛋白酶、纤维素酶等。蛋白酶对植物细胞中游离的蛋白质具有分解作用,使其结构变得松散;蛋白酶还会使糖蛋白与蛋白聚糖中游离的蛋白质水解,降低它们对原料的结合力,

有利于多糖的浸出。

1.2.2复合酶解法

复合酶解法采用一定比例的果胶酶、纤维素酶及中性蛋白酶,主要利用纤维素酶与果胶酶水解纤维素与果胶,使植物组织细胞的细胞壁破裂,释放细胞壁内的活性多糖,多糖释放的多少与复合酶的加入量、酶解温度、酶解时间、酶解pH 值有直接的关系。

酶解法提取的实质就是通过酶解反应强化传质过程。此法具有条件温与、杂质易除与得率高等优点。

1.3物理强化法

1.3.1微波辅助提取法

微波萃取就是高频电磁波穿透萃取媒质,到达被萃取物料的内部,能迅速转化为热能使细胞内部温度快速上升,细胞内部压力超过细胞壁承受力,细胞破裂,细胞内有效成分流出,在较低的温度下溶解于萃取媒质,通过进一步过滤与分离,获得萃取物料。

微波辅助提取多糖与其她的萃取方法比较,微波萃取效率高,操作简单,且不会引入杂质,多糖纯度高,能耗小,操作费用低,符合环境保护要求,就是很好的多糖提取方法。

1.3.2超声波辅助提取法

超声波提取就是利用超声波的机械效应、空化效应及热效应。机械效应可增大介质的运动速度及穿透力,能有效的破碎生物细胞与组织,从而使提取的有效成分溶解于溶剂之中;空化效应使整个生物体破裂,整个破裂过程在瞬间完成,有利于有效成分的溶出;热效应增大了有效成分的溶解速度,这种热效应就是瞬间的,可使被提取成分的生物活性尽量保持不变;此外,许多次级效应也能促进提取材料中有效成分的溶解,提高了提取率。

超声波提取与水煮法醇沉法相比,萃取充分,提取时间短;与浸泡法相比,提取率高。

1.3.3高压脉冲法

高压脉冲法就是对两电极间的流态物料反复施加高电压的短脉冲(典型为20～80 kV/cm)

进行处理,作用机理有多种假说,如细胞膜穿孔效应、电磁机制模型、粘弹极性形成模型、电解产物效应、臭氧效应等,研究最多的就是细胞膜穿孔效应。动物、植物、微生物的细胞,在外加电场作用下,产生横跨膜电位,绝缘的生物膜由于电场形成了微孔,通透性发生变化,当整个膜电位达到极限值(约为 1 V)时,膜破裂,膜结构变成无序状态,形成细孔,渗透能力增强。电位差达到临界点,细胞破裂。

2、多糖的分离纯化

2.1 除蛋白

2.1.1Sevage 法

根据蛋白质在氯仿等有机溶剂中变性的特点,用V(氯仿)∶V(戊醇或正丁醇)为5∶1 或4∶1,混合物剧烈振摇20～30 min,蛋白质变性生成凝胶,离心分离,分去水层与溶剂层交界处的变性蛋白质。此种只能除去少量蛋白质,效率不高,须反复多次,多糖有损失。但此方法比较温与,在避免多糖降解上效果较好,如配合加入一些蛋白质水解酶,用Sevage 法效果更佳。此法不能除去脂蛋白,因为脂蛋白溶于氯仿。

2.1.2三氟三氯乙烷法

将多糖溶液与三氟三氯乙烷等体积混合,低温搅拌10 min 左右,离心分离得上层

水层,水层继续用上述方法反复处理几次,得无蛋白质的多糖溶液,此法效率较Seavg 法高,但溶剂沸点低,易挥发,不宜大量应用。

2.1.3三氯乙酸法

三氯乙酸就是一种有机酸,使多糖提取液中的蛋白质与有机酸作用而变性沉淀。该法就