重组蛋白在大肠杆菌分泌表达的研究进展

天津药学ＴｉａｎｊｉｎＰｈａｒｍａｃｙ２００９年第２１卷第４期

综述

重组蛋白在大肠杆菌分泌表达的研究进展’

郑海洲，刘晓志，宋欣

（华北制药集团新药研究开发有限责任公司，石家庄０５００１５）

摘要长期以来，大肠杆菌是表达外源蛋白的首选表达系统，重组蛋白分泌表达与胞内表达相比有很大优越性，在细胞周质腔不仅能促进重组蛋白二硫键的形成及正确折叠，还能促进分泌蛋白的Ｎ一端加工。本文综述了近年来在大肠杆菌中表达可溶性外源蛋白的进展，目的是为了提高外源蛋白的生物活性。

关键词大肠杆菌，分泌表达，重组蛋白

中图分类号：Ｑ５９１．２文献标识码：Ａ文章编号：１００６－５６８７（２００９）０４－００４０－０３

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大肠杆菌具有遗传背景清楚、繁殖快、成本低、表达量高、表达产物容易纯化等优点，是基因表达技术中发展最早和目前应用最广泛的是经典表达系统…。蛋白分泌表达是指重组异源蛋白通过运输或分泌方式定位于细胞周质，甚至穿过外膜进入培养基中。重组蛋白分泌表达的优势在于胞周质或胞外分泌表达过程中，信号肽在细胞内剪切，更有可能产生目的蛋白的天然Ｎ一末端，如果含甲硫氨酸可能会降低产物的可溶性和稳定性旧１；大肠杆菌的胞周质中含有一系列的酶，并提供了一个氧化环境，有利于二硫键的正确形成，并增强巯基蛋白的正确折叠，使活性蛋白质的产量得到

谢负担，使宿主菌适应性增加；周质空间和胞外培养基中宿主菌蛋白含量很低，有利于目的蛋白的纯化。本文将近年来一些提高重组蛋白在大肠杆菌胞周质和胞外分泌表达的策略简述如下。

１利用Ｅｃｏｌｉ自身存在的分泌途径

根据识别特异的底物及透过细胞外膜机制的不同，革兰阴性菌共分为５种天然分泌系统，即Ｉ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ｖ型。革兰阴性菌ＥｃｏｌｉＫ一１２和Ｂ菌株主

・收稿日期：２００９－０６—１２分泌机制的研究还不透彻。Ｉ型分泌系统通过仅一溶血素途径直接介导胞外分泌，组成元件简单，外源重组蛋白与ＨｌｙＡ

信号序列，需要在体外进行剪切；此外该系统中的一些共表达部件对目的蛋白的转运有竞争作用，重组蛋白

过ＭＴＢ（ｍａｉｎｔｅｒｍｉｎａｌ

后利用以下三种途径透过胞质膜：依赖于ＳｅｃＢ的通路、信号识别颗粒（ＳＲＰ）通路或双精氨酸转移（ＴＡＴ）Ｊ。由于Ｅｃｏｌｉ跨越内膜的转运装置不完善，蛋白输出能力不够，蛋白酶降解等原因导致分泌效率低，胞外分泌量往往达不到实验或工业生产的要求，目前大肠杆菌的分泌主要是指重组蛋白通过Ｉ或Ⅱ型系统透过胞质膜分泌至周质腔。

２信号肽对重组蛋白分泌表达的影响

大肠杆菌的分泌型蛋白定位于内膜、外膜、周质空间和胞外环境，其在Ｎ端或Ｃ端带有一定的结构，其中Ｎ端带有信号肽分子的蛋白，而Ｃ端带有分泌信号的系统。信号肽位于分泌蛋白的Ｎ端，能有效地引导

万方数据

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新生肽穿越原核生物的质膜。对外源蛋白的分泌起主导作用，一般采用来自大肠杆菌的外膜蛋白或周质蛋白的信号肽。在实际研究中，由于目的基因和表达载体系统不同，为了提高外源蛋白的表达量，应试用不同的信号肽。

目前许多原核和真核细胞来源的信号肽已成功地用于大肠杆菌中重组蛋白从内膜到外周质的转运。Ｃｈｏｉ等＂１使用木聚糖酶信号肽将两种不同杆菌的碱性磷酸酯酶被分泌到大肠杆菌的周质空间。Ｊｅｏｎｇ等旧１将人类Ｂ一内啡肽基因和一种外膜蛋白ｏｍｐＦ融合后能促使其分泌到培养基中。郝春芳等。刊利用集胞藻６８０３膜蛋白的分泌信号肽作为革兰阴性菌分泌表达的信号肽，实现了ｈＥＧＦ多肽在大肠杆菌中分泌表达。肖洁等旧１根据研究报道，适当改造信号肽结构可提高外源蛋白的分泌效率。Ｙａｍａｂｈａｉ等一。利用芽孢杆菌自身的信号肽及大肠杆菌外膜蛋白信号肽（ＯｍｐＡ）成功在大肠杆菌分泌表达了芽孢杆菌胞外水解酶ａ一淀粉酶、甘露聚糖酶和壳多糖酶。

３选择适当的宿主菌株

不同的大肠杆菌菌株在培养条件和外源基因表达能力上存在着很大差别，因此，不同宿主菌的选择对表达产物的积累以及下游分离纯化有至关重要的作

件的基因突变体）既能够产生可溶性的、具有正确空间结构和二硫键的活性蛋白，又能够避免细胞壁在外源蛋白跨膜转运中的阻碍作用，有利于重组蛋白分泌到培养基中。最成功的例子就是Ｌ２型细菌（缺乏细胞壁和胞周质）已用于青霉素酰基转移酶、链激酶、微小抗体的分泌表达中。但因为这些菌株有生长受损性，不能耐受高密度发酵的过程，Ｌ２型细菌不适合工业化生产。另外，通过改变渗透压或者溶菌酶处理突变的大肠杆菌，能够重组蛋白的分泌表达¨¨。生长受抑制、代谢活动处于静止期的细胞（Ｑ细胞）已被成功用于抗体片段的胞外分泌中。

４共表达跨膜转运蛋白

大肠杆菌分泌蛋白的跨内膜转运是由一系列结构相关的Ｓｅｃ蛋白顺序作用完成的，参与跨膜转运的有７个Ｓｅｃ蛋白：ＳｅｃＡ、ＳｅｃＢ、ＳｅｃＤ、ＳｅｃＥ、ＳｅｃＦ、ＳｅｃＧ和ＳｅｃＹ。此外，一些分子伴侣，如ＧｒｏＥＳ／ＧｒｏＥＬ、ＤｎａＫ／ＤｎａＪ和Ｆｆｈ／Ｆｆｓ，也参与跨内膜的转运。研究表明通过共表达参与或影响转运的蛋白，改善转运通路，可能

两种二硫键异构酶ＤｓｂＣ和ＤｓｂＤ能促进二硫键的重新形成，Ｄｓｂ蛋白的过量表达能提高周间腔蛋白的分泌效率，改善折叠效果和促进蛋白的可溶表达。Ｔａｒｉｄ—ＯＷ采用一种分子伴侣ＣａｔｌＭ能使ＩＬ２１１和Ｆ１抗原融合蛋白分泌到周间腔【ｌ２１。孙永红等［１纠利用融合标签技术，分别将大肠杆菌酸性蛋白ＭｓｙＢ，一个假定的大肠杆菌阅读框蛋白ｙｊｇＤ，大肠杆菌ＲＮＡ聚合酶ｔｒＴ０的Ｎ一末端结构域及大肠杆菌硫氧还蛋白Ｔｒｘ与ＡＢｌ一４２淀粉样蛋白进行融合表达，实现了该蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达。

５优化培养条件

培养基成分、培养方式、培养条件及培养过程中抑制性代谢产物的积累等都会影响重组蛋白在工程菌中的表达产量和分泌的量。其中培养基营养成分、ｐＨ和温度等参数是影响工程菌生长和表达外源蛋白的重要因素，能够影响蛋白酶的活性、分泌和表达水平¨４‘。向培养基中添加甘氨酸可以在不导致菌体自溶的情况下促进蛋白从周质空间向胞外的分泌，且不引起明显的细菌裂解。在培养基中添加糖胶和ＴｒｉｔｏｎＸ一１００能阻止周间腔中包涵体的形成，并提高胞外表达的效率。改变培养基的渗透压、短时间的热冲击诱导及降低诱导时的温度，会明显提高重组蛋白在大肠杆菌的可溶性表达¨５ｌ。胡晓梅等【１刮对分泌型重组铜绿假单胞菌外毒素Ａ基因工程菌的发酵条件进行了优化研究，发现在３０℃和３７℃两种温度条件下培养表达，所得菌湿重分别为６．９６２ｇ／Ｌ和４．２５３ｇ／Ｌ，目标蛋白表达率分别为２６．６％和１９．５％，因此确定３０℃为最佳发酵温度。Ｚｈａｎｇ等¨¨探讨了当改变诱导剂乳糖浓度、诱导时的菌浓、诱导温度及培养基成分等培养条件时，葡聚糖蔗糖酶在大肠杆菌中分泌表达的变化情况。

６结语

大肠杆菌是基础研究和商业生产重组蛋白的强大工具，由于来自真核生物的异源蛋白往往不能在大肠杆菌得到有效表达，特别是大肠杆菌本身的蛋白质分泌系统不够完善，分泌能力比真核生物要低，因此要获得重组蛋白的高效分泌表达面临许多问题。重组蛋白分泌表达与胞内表达相比有很大优越性，在周质腔能促进重组蛋白二硫键的形成及正确折叠，还能促进分泌蛋白的Ｎ一端加工。随着各项研究的深入，重组蛋白在大肠杆菌的高效分泌表达技术将会越来越完善。

参考文献

１任增亮。堵国成。陈坚，等．大肠杆菌高效表达重组蛋白策略．中国生物工程杂志，２００７，２７（９）：１０３

２ＬｉａｏＹ

Ｄ，ＪｅｎｇＪＣ，ＷａｎｇＣＦ，ｅｔａ１．ＲｅｍｏｖａｌｏｆＮ—ｔｅｒｍｉｎａｌｍｅｔｈｉｏ－ｎｉｎｅｆｒｏｍｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｔｅｉｎｓｂｙｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄＥ．ｃｏｌｉｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅａｍｉｎ・ｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ．ＰｒｏｔｅｉｎＳｃｉｅｎｃｅ．２００４，１３（７）：１８０２

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