用根癌农杆菌介导EPSPS基因遗传转化拟南芥的研究
根癌农杆菌介导烟曲霉遗传转化的研究
２１ ００年 ９ 月
第 ｌ ４卷
第 ９期
－－－——Biblioteka １０ ５ ７ ‘— ・ ＿ —
文 章 编 号 ：０７ ２７ ２ １）９ ５７— ２ １０ —４ ８（００ ０ —１０ ０
根 癌农 杆 菌 介 导 烟 曲霉 遗 传 转 化 的研 究
张艳 华 一贺 ，， 丹 王 ， 丽¨
（． １吉林 大学 白求恩 医学 院 ， 吉林 长春 １０２ ； ． ３０ １２ 吉林大学植物 科学学院 ， 吉林 长春 １０６ ） ３０２
可 ；２ 转化效率高 ： （） 对大多数丝状真 菌而言 ， Ｔ Ｔ法 比其他 ＡＭ
转化 方 法 的效 率 高 得 多 。利 用 Ａ Ｍ Ｔ Ｔ转 化 泡盛 曲 霉 （ Ａ． ａ ａ ｏｉ的效率 比 Ｐ Ｇ法 高 ６０倍 ， 毛壳 菌 （ ｈｅ ｍ ｕ ｗｍ ｒ ） Ｅ ０ 球 Ｃ ａｔ ｉ ｏ ｍ
受 到伤 害时 ，ｉ Ｔ 质粒在 Ｖｒ 因和其它蛋 白质 的协助下 ， Ｔ ｉ基 将 ＿ Ｄ Ａ插入到植物染 色体 中。为使 质粒 适 于生物技 术 的需 Ｎ 要 ， 已对 Ｔ 质粒进 行了改造 ， 展了双元载体系统 ， 由两 现 ｉ 发 即
个分别含有 Ｔ Ｄ Ａ和 Ｖｒ 的相容性 质粒组 成 ＿ 。 目前 ， －Ｎ ｉ区 ５ Ｊ 根 癌农杆菌 已成功 用于植物细胞的遗传转化 。
组相 比较 ， 发现约 ５０个 烟 曲霉独 特基 因。另外 发现 ， 曲 ０ 烟
化法 ， 需制备原生质 体 ， 同真菌 原生 质体 制备 方法差 异很 不 大 。而 Ａ Ｍ Ｔ Ｔ转化的受 体 材料类 型多 ， 可用 原生 质体 、 既 也
可用萌发 的孢子 、 分生孢子 、 菌丝体 ， 甚至 是真菌 的子实体 均
发根农杆菌介导的药用植物遗传转化研究_杨慧洁
生物技术通报BIOTECHNOLOGY BULLETIN·综述与专论·2009年第1期收稿日期：2008-06-30作者简介：杨慧洁（1963-），女，工程师，研究方向：生物技术通讯作者：杨世海，博士，教授，博士生导师，E -mail ：jlyangs@通过发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes ）感染植物，将其所含的Ri 质粒上的一段DNA （T -DNA ）转移并整合到植物基因组中，诱导产生毛状根，并建立毛状根培养系统。
实验证明，毛状根具有生长迅速，合成能力强和遗传性稳定等优点，这是传统细胞培养所不具备的。
利用毛状根培养技术生产次生代谢产物具有极大工业生产潜力，已引起人们的广泛关注并得到了飞跃的发展，是药用植物资源可持续发展的有效途径之一[1]。
主要从发根农杆菌、植物外植体及理化因子等方面论述影响发根农杆菌介导的药用植物遗传转化的因素。
1发根农杆菌1.1菌株类型不同菌株对转化频率有一定的影响。
刘峻等[2]采用1601、LBA91-8、R 1000、A 4和R158345种发根农杆菌菌株感染人参，然而只有菌株15834可转化人参毛状根，其它菌株对人参转化没有成功。
说明不同发根农杆菌对人参的敏感性不同，可能l5834对人参的较为敏感。
王跃华等[3]用R 1600，ATCC15834，R 1000，A 4等4种发根农杆菌感染川黄柏的外植体，4种发根农杆菌浸染川黄柏的下胚轴和带芽下胚轴外植体都能不同程度地诱导出毛状根，但不同菌株的诱导率不同，ATCC15834菌株的毛状根诱导率最高为31.40％，R 1000诱导率最低仅7.62％。
刘树楠等[4]在银杏转化过程中以15834，A 4，R 10003种发根农杆菌对银杏外植体转化，发现15834，R 1000菌株的发根能力较A 4强得多，而A 4菌株在相同的转化条件下未能得到银杏发根。
陆倍倍等[5]用发根农杆菌LBA9402转化莨菪，100%长出了发根，而用A 4菌株诱导发根，只有不到80%的外植体长出了发根。
根癌农杆菌介导的植物遗传转化研究现状和前景
根癌农杆菌介导的植物遗传转化研究现状和前景
肖国樱
【期刊名称】《作物研究》
【年(卷),期】1998(12)1
【摘要】介绍了根癌农杆菌介导的植物遗传转化研究的现状，并对其发展前景和方向作了简要的评价。
【总页数】5页(P44-48)
【作者】肖国樱
【作者单位】国家杂交水稻工程技术研究中心
【正文语种】中文
【中图分类】Q785
【相关文献】
1.根癌农杆菌介导的植物遗传转化研究 [J], 刘立全;杨剑超;张衡;杨菲
2.根癌农杆菌介导植物遗传转化的分子机制 [J], 郭晓丽
3.根癌农杆菌介导的反义VeFAD2基因对少根根霉的遗传转化及其影响因子 [J], 刘明靖;李纪元;范正琪;田敏;范妙华
4.根癌农杆菌介导单子叶植物遗传转化研究进展 [J], 杨静
5.根癌农杆菌介导法在禾本科植物遗传转化中的应用 [J], 谭伟;杨俊杰;彭金环;于元杰
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拟南芥PHOT2基因超表达载体的构建及转化
拟南芥PHOT2基因超表达载体的构建及转化作者：乔新荣赵丽平孙伟徐长水来源：《江苏农业科学》2014年第01期摘要：采用PCR技术扩增拟南芥PHOT2基因编码序列，并将其转入pSUPER1300超表达载体中，构建了 pSUPER1300-PHOT2 超表达载体，利用农杆菌介导花序转化法，转入拟南芥野生型gl1、phot1突变体中。
PCR扩增及 RT-PCR 分析表明，该基因超表达，筛选到了潜在的转基因株系。
关键词：蓝光受体；向光素；超表达中图分类号： Q943.2文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）01-0030-02收稿日期：2013-06-08作者简介：乔新荣（1972—），女，河南新密人，博士，讲师，主要从事植物生理及分子生物学研究。
E-mail：xinrong806@。
光向素（phototropin，PHOT）是植物特有的蓝光受体，PHOT1、PHOT2属于同一家族，其N端含有2个高度保守的光感受区LOV1（light，oxygen，voltage1）区、LOV2区，每个LOV区都结合一分子的黄素单核苷酸（FMN）作为发色团。
C端是Ser/Thr蛋白激酶区，蓝光激活多个丝氨酸残基发生自磷酸化作用[1]。
研究发现，PHOT1的第851位丝氨酸残基（Ser851）的磷酸化作用是PHOT1发挥其生理作用所必需的[2]。
PHOT都定位于质膜，但蓝光会诱导部分PHOT1向胞质迁移，部分PHOT2移至高尔基体及叶绿体外膜[3-5]。
PHOT1、PHOT2调节植物的许多生理反应，包括植物的向光反应、气孔开放、叶绿体迁移及提高弱光下植物的光合作用、降低强光对植物伤害等[1，6]。
目前，学者们对PHOT1、PHOT2的结构及其生理作用有了较为深入的研究[7-8]，PHOT1、PHOT2以光强依赖方式共同介导植物的许多生理反应，如共同介导弱光下叶绿体的聚集运动及强光下下胚轴的向光弯曲[7]。
田旋花EPSPS基因启动子的克隆、序列分析及转化
田旋花EPSPS基因启动子的克隆、序列分析及转化作者：黄兆峰等来源：《杂草科学》2014年第03期摘要：根据已克隆的田旋花（Convolvulus arvensis L.）EPSPS基因mRNA序列设计引物，通过染色体步移技术获得了1 142 bp的EPSPS-P启动子片段（GenBank 登录号：KC107822）。
对启动子序列分析显示，该片段富含A/T碱基、TATA-box、CAAT-box及其他作用元件如GATA-motif、TC-rich repeats、sp1等。
将该启动子与GUS报告基因连接以构建植物表达载体，利用农杆菌介导法获得转基因拟南芥；PCR和GUS组织化学染色分析证明，EPSPS-P已转化到拟南芥中。
关键词：田旋花；草甘膦；启动子；染色体步移技术草甘膦是一种广谱灭生性、内吸传导型除草剂，是国内外防除一年生及多年生杂草的主要药剂[1-6]。
草甘膦的作用机制是抑制植物体内5-烯醇式丙酮酸-3-磷酸合成酶（5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase，EPSPS）的活性，导致莽草酸大量积累，并抑制芳香族氨基酸的生物合成，进而扰乱正常的氮代谢[7]。
以往研究表明：植物体内EPSPS基因的过量表达可以有效提高其对草甘膦的耐药性[8-11]。
田旋花（Convolvulus arvensis L.）属旋花科，是一种多年生恶性杂草，其繁殖和再生能力极强，是华北地区小麦、玉米、大豆等旱作物田的重要杂草[12]。
已被世界粮农组织列为世界上18种危害最严重的杂草之一[13]。
DeGennaro等研究发现，无草甘膦用药史的田旋花对草甘膦具有天然的耐药性[14]；刘延等发现，北京房山麦田田旋花对草甘膦具有较高的耐药性，并首次克隆了田旋花EPSPS基因（GenBank登录号：EU698030）[12]；张猛比较了不同田旋花种群的耐药性水平，提出草甘膦处理后的EPSPS基因在表达时间和表达量上的差异是其对草甘膦产生耐药性差异的一个重要因素[13]。
农杆菌介导的植物遗传转化研究进展
Ditt 等［12］研 究 了 藿 香 蓟 悬 浮 细 胞 培 养 对 非 致瘤的超毒农杆菌株系侵染的响应。使用 cDNA 扩增片段长度多态性（ AFLP） 来扩增 16 000 个片 段，发现 48 h 后 有 251 段 基 因 差 异 调 节 侵 染 过 程。逆转录 PCR 分析其中部分基因证实了cDNAAFLP 分析的结果。对其中大部分基因 （ 例如编 码一种 RNA 酶、一种假定受体激酶、一种过氧化 物酶和一种病程相关蛋白的基因） 的研究表明， 随着大肠杆菌进入植物细胞，经过一段潜伏期后 均出现了差异调节，有 4 种基因（ 包括一个编码根 瘤素样蛋白的基因） 对特定的农杆菌侵染做出了 响应。从而推测可以根据这个根瘤素基因对细菌 信号的响应来区分常规植物细胞和变异物种。
1 农杆菌介导的遗传转化体系
农杆菌转化是将 T-DNA 随机地整合到植物 受体 细 胞 基 因 组 中［3］。 将 农 杆 菌 中 原 始 的 TDNA 替换成目的基因是如今将外源基因引入植 物体内的最有效方法。因此，与农杆菌有关的生 物学和生物技术在过去的几十年里是转基因研究 的一个热点［4］。
T-DNA 转化进入受体细胞所涉及的蛋白质 由细菌染色体和 Ti 质粒毒性区基因编码。此外， 有多种植物蛋白质也参与了农杆菌介导的基因转 化过程，主要作用于 T-DNA 胞内运输、进入细胞 核以及整合阶段。因为农杆菌主要利用在植物细 胞内的过程（ 例如 DNA 和蛋白质运输、靶蛋白水 解和 DNA 修复） 来转化其受体［5，6］，理解这些常 规的植物细胞生物学机制有助于扩展农杆菌的受 体范围，同样也可促进转化过程和转基因植物的 产物控制。改善植物受体以提高较难转化的植物 物种的转化效率是目前研究的主要方向之一。
根癌农杆菌介导的真菌遗传转化研究进展
根癌农杆菌介导的真菌遗传转化研究进展周芳芳;李志芳;冯自力;师勇强;赵丽红;李彩红;朱荷琴【期刊名称】《棉花学报》【年(卷),期】2012(024)005【摘要】农杆菌介导遗传转化成为真菌实现菌种改良、新基因标记及目的基因的筛选、分离和克隆的重要方法之一.该方法操作简单、受体范围广、转化效率高、单拷贝率高及突变体遗传稳定,解决了传统转化方法的瓶颈.利用该方法成功实现了多种真菌大容量高质量突变体库的构建,且在各类真菌突变体库构建的基础上,相关基因的筛选和功能基因的验证工作成为下一步的研究热点,进而为各类病原菌致病机理的深入研究提供依据,为抗病育种等亟待解决的问题奠定基础.%Agrobacterium tume/aciens-mediated transformation(ATMT) has become an important tool for strain improvement, new genes' tagging and target gene's screening, isolating and cloning. The advantages of this method are simple operation, a wide host range, highly efficient transformation, and a high frequency of single inserted T-DNA. Mutant libraries of many fungi with high capacity and quality have been constructed by ATMT. The screening and identification of related functional genes will be the following research focus on the basis of these mutant libraries. This research will provide a basis for further studies on pathogenic mechanisms and will aid disease-resistance breeding.【总页数】7页(P461-467)【作者】周芳芳;李志芳;冯自力;师勇强;赵丽红;李彩红;朱荷琴【作者单位】棉花生物学国家重点实验室/中国农业科学院棉花研究所,河南安阳455000;棉花生物学国家重点实验室/中国农业科学院棉花研究所,河南安阳455000;棉花生物学国家重点实验室/中国农业科学院棉花研究所,河南安阳455000;棉花生物学国家重点实验室/中国农业科学院棉花研究所,河南安阳455000;棉花生物学国家重点实验室/中国农业科学院棉花研究所,河南安阳455000;棉花生物学国家重点实验室/中国农业科学院棉花研究所,河南安阳455000;棉花生物学国家重点实验室/中国农业科学院棉花研究所,河南安阳455000【正文语种】中文【中图分类】S562.035【相关文献】1.根癌农杆菌介导丝状真菌遗传转化的影响因子研究进展 [J], 钱科;胡昌华2.根癌农杆菌介导丝状真菌遗传转化的研究进展 [J], 黄亚丽;潘玮;蒋细良;郭平;田云龙;李记鹏;朱昌雄3.根癌农杆菌介导丝状真菌遗传转化因素的研究进展 [J], 张震;杜新法;柴荣耀;孙国昌4.根癌农杆菌介导的真菌遗传转化研究进展 [J], 李俊香; 古勤生5.根癌农杆菌介导真菌遗传转化的研究进展 [J], 方卫国;张永军;杨星勇;裴炎因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
实验三(1)通过根瘤农杆菌转化拟南芥
4．将沉淀用200ml浸染液重悬，形成均匀的农杆菌悬浮液 （OD600=0.8左右），并将农杆菌悬浮液转移到一个敞口 的器皿中（500ml烧杯）。 5．选取初果期的健壮植株，带盆钵一起倒扣于盛有农杆菌悬 浮液的容器上方，将整个花序浸入上述农杆菌悬浮液中约 20-30秒，注意叶片尽量不与浸染液接触。同一个烧杯中 的农杆菌悬浮液可以转化10株或者更多株拟南芥。在此过 程中，尽量避免将蛭石倒入农杆菌悬浮液中。 6．将盆钵取下，横放于暗箱中约24小时。注意保持一定的 湿度。 7．24小时后将处理过的拟南芥植株放于22～25℃的光照条 件下使其正常生长。 8．大约三周后收取成熟种子。
人工改造后的Ti质粒
1.保留T-DNA的转移功能，去掉T-DNA的致瘤性， 有利于转化体再生植株； 2.在T-DNA左右边界序列之间构建一段DNA序列， 其上含有一系列单个的限制性内切酶的识别位点、 即单克隆位点，以利于插入外源DNA和其后的操 作； 3.具有目的基因表达所需的启动子、终止子以及提 供重组细胞筛选的标记基因等； 4.具有使质粒能够在大肠杆菌中进行复制的DNA复 制起始位点，某些载体还同时带有可在农杆菌中 进行复制的起始位点。
思 考 题
1．目前拟南芥稳定表达有几种基本的方法？ 试分析不同转化方法的优缺点。 2．植物转基因技术有哪些应用? 3．拟南芥作为研究植物发育的重要模式植株 之一，请问有哪些特性？
培养基配制
准备—下周筛转基因种子和萌发实验。每两个人一 组，准备下述平板： （1）1个含有卡那霉素（50 mg/L）的 1/2 MS固体 平板； （2）1个1/2 MS固体平板（不含任何抗生素或者是 激素）； （3）一个加200 mM NaCl 1/2 MS固体平板（不含 抗生素）； （4）一个加1µM ABA 2 MS固体。 灭菌后将平板倒好并再4 ℃保存备用。
根癌农杆菌介导的基因转移
三、根癌农杆菌介导的基因转移一、实验目的：1、理解根癌农杆菌介导的基因转移的基本原理；2、掌握根癌农杆菌介导的遗传转化技术流程。
二、实验原理：根癌农杆菌是土壤菌属的一种革兰氏阴性细菌，能浸染大多数的双子叶植物和少数的单子叶植物。
根癌农杆菌介导的基因转移是利用根癌农杆菌的Ti质粒将外源基因转入到植物细胞核基因组中，并进行整合表达的转化，这是一种天然的生物转化系统。
根癌农杆菌含有Ti质粒，它是根癌农杆菌所特有的位于染色体外独立的基因组，为双链闭合环状的DNA分子，Ti质粒上含有一段特殊的DNA----T-DNA。
当植物受到伤害后，植物的细胞就会分泌如乙酰酊香酮等类的酚类化合物，这些酚类化合物能诱导根癌农杆菌染色体毒性基因的表达，促使农杆菌附着到受伤植物细胞表面。
根癌农杆菌侵染植物后，其Ti质粒上的T-DNA部分转化并整合进入植物宿主细胞内，可以诱导植物细胞形成冠瘿瘤。
经一系列复杂的变化过程，T-DNA 以单拷贝或低拷贝的形式随机整合到植物染色体上。
因此，只要将外源基因插入到T-DNA ，Ti 质粒就可以作为天然载体，将外源基因导入到植物细胞中。
三、实验材料：（一）根癌农杆菌（含有外源基因）烟草叶片（二）溶液与缓冲液1、MS基本培养基（PH=5.8）2、烟草愈伤组织诱导或分化培养基（MSH）：MS +NAA 0.1 mg/L +6-BA 2.0mg/L3、烟草脱菌培养基：MSH+300 mg/L Cef4、烟草筛选培养基：MS+300 mg/L Cef+20 mg/L Hpt5、烟草生根培养基：1/2 MS6、LB液体培养基：酵母提取物5 g/L、蛋白胨10g/L、NaCl 5g/L（PH=7.0）7、无菌蒸馏水、10% NaClO、75%乙醇、Kan、Cef、Hpt母液四、仪器设备及耗材：无菌培养皿、封口膜、剪刀、镊子、手术刀、三角瓶、无菌滤纸、恒温摇床、微量移液器、吸头、超净工作台等等五、实验方法与步骤：（一）、实验准备工作：1、培养基的制备：MS基本培养基（PH=5.8）、烟草愈伤组织诱导或分化培养基（MSH）、烟草脱菌培养基、烟草筛选培养基、烟草生根培养基、LB液体培养基（PH=7.0）高压灭菌锅中121℃，灭菌20min。
根癌农杆菌介导单子叶植物遗传转化研究进展
将农杆菌作为载体成功获得转基因烟草的试验发生在1983年，其后的30多年，农杆菌介导的遗传转化技术在双子叶植物的研究中得到了长足发展。
之后，关于单子叶植物在这方面的研究却比较少，因为农杆菌寄主范围局限于双子叶植物和一些裸子植物。
单子叶植物被认为不能作为农杆菌的宿主，所以难以被转化。
因此最初人们关于单子叶植物通过根癌农杆菌介导遗传转化的研究很少，而多是采用PEG法、基因枪法及电激法等。
1根癌农杆菌转化单子叶植物的研究进展1.1水稻水稻作为单子叶植物研究的模式植物，关于根癌农杆菌介导水稻遗传转化的研究开始得比较早。
水稻的遗传转化研究从完全否定其可行性，到可以进行转化，从低频率转化到高频率，经过几十年的研究发展，已经具备了相当的理论基础和研究成果，实现了许多优质的外源基因对水稻的遗传转化[1]。
李宝健证明了水稻是可以通过农杆菌进行遗传转化的，并获得了转基因的水稻，虽然其转化频率很低，却是农杆菌介导转化单子叶植物的一大突破。
这之后，Hiei证明了水稻是可以被有效侵染的，他不仅利用胚性愈伤组织作外植体，还将粳稻的转化频率提高到28.3%，并建立了水稻的遗传转化体系。
王春萍等[2]将ThIPK2基因通过农杆菌介导法插入到籼稻科恢675中，经验证后，通过该试验结果完善了优良的遗传转化体系。
张燕红等[3]利用农杆菌介导法，将SiPEBP基因转入到秋田小町、新稻21号以及08GY30-5-4这3个新疆品种水稻中，试验结果表明，3个品种的抗性愈伤率皆达到了40%以上。
1.2玉米玉米作为三大粮食作物之一，是作为单子叶植物研究的重要对象。
1996年，Ishida等[4]选用玉米自交系A188幼胚作为受体的转基因试验，获得了世界上第一株用该方法转化的转基因玉米，从而证实玉米是能够被转化的，为玉米的遗传转化研究提供了一定的理论基础。
邢小龙等[5]将GUS作为目的基因，以玉米杂交种“郑单958”为材料，以Bar作筛选标记，试验结果表明，在侵染浓度0.6、侵染时间2h、真空处理时间10min的条件下，“郑单958”作为受体能有效提高转化效率。
根癌农杆菌介导油菜CBF1基因转化拟南芥
维普资讯
安徽农 业科 学 ． ｕｎｌ ｆ ｎｕ Ａ ｒ Ｓｉ２ Ａ ｈ ｉ ｇｉ ｃ．０ ８３ （４ ：７５ ５７ ｏ ．
责 任编 辑 王 森 责任校 对 况玲玲
根癌 农 杆 菌 介 导油 菜 Ｃ Ｆ１ 因转化 拟 南 芥 Ｂ 基
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根癌农杆菌介导的遗传转化
根癌农杆菌介导丝状真菌遗传转化的研究进展摘要：根癌农杆菌介导的遗传转化系统因具有操作简便,转化效率高，容易得到单拷贝随机插入的转化子，并且转化子稳定等特点而成为近年来丝状真菌遗传转化的主要研究手段之一，也使该系统有可能成为丝状真菌基因组研究的有力工具。
本文就根癌农杆菌转化丝状真菌原理、过程、种类、影响转化效率的因素及其应用等方面进行了综述.［关键词] 根癌农杆菌；丝状真菌；遗传转化丝状真菌（filamentous fungi）是真菌中一个很大类群，通常指那些菌丝体比较发达而又不产生大型子实体的真菌。
其在自然条件下常引起食物、工农业产品的霉变和植物的真菌病害,在工业、农业、医药及基础生物学研究中具有重要作用。
丝状真菌中很多种具有重要的经济价值，还有一些是昆虫、植物、动物和人类的重要致病菌,如绿僵菌（Metarhizium anisopliae)、稻瘟菌（Magnaporthe grisea）和烟曲霉(Aspergillus fumigatus)等。
而构巢曲霉（Aspergillus nidulans）和粗糙脉孢霉(Neurospora crassa)由于结构简单,通常被作为真核微生物的“模式”种用于基础研究[1］。
由于丝状真菌在经济上和科学中的重要性，多年来一直被广泛地研究。
近年来发展了很多转化的方法，但并非所有方法都适用于丝状真菌。
以往丝状真菌的常规转化方法有PEG介导的原生质体转化，限制酶介导的插入突变（Restriction enzyme-mediated insertional, REMI)等，但是这些转化技术或需要制备原生质体、或转化效率低．阻碍了它们在研究丝状真菌功能基因中的应用。
根癌农杆菌介导的转化体系(Agrobacterium tumefaciens mediated transformation，ATMT）克服了这些缺点．为丝状真菌的遗传转化和功能基因研究提供了有力的工具,现已被广泛地运用于丝状真菌的遗传操作目前已经实现了对泡盛曲霉（Aspergilus awamori)、粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）、尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）和瓜类炭疽（Colletotrichum lagenarium）等60多种真菌的遗传转化［2］。
根癌农杆菌介导的DREB1C基因转化苜蓿的研究的开题报告
根癌农杆菌介导的DREB1C基因转化苜蓿的研究的开题报告一、研究背景和意义苜蓿（Medicago sativa L.）是重要的四季饲料作物之一，在家畜养殖业中具有广泛的应用前景。
然而，苜蓿在干旱、高温等逆境条件下生长发育困难，导致其产量和品质受到影响，这也限制了苜蓿的种植和利用。
因此，提高苜蓿的抗逆性是苜蓿品种选育和利用的重要问题。
DREB1C基因是拟南芥（Arabidopsis thaliana）中一个关键的抗逆基因，可以显著提高拟南芥在干旱和低温逆境下的耐受性。
近年来，已经有多个研究证实，DREB1C 基因在多种植物中也具有相似的抗逆效果。
因此，利用分子生物学手段将DREB1C基因导入苜蓿中，将有望提高苜蓿的抗逆性和品质。
农杆菌介导的基因转化技术是目前广泛应用的植物基因编辑技术，其短时间、高效率和无需特殊设备的优势被越来越多地应用于各种农作物中。
此外，基因导入后可以通过筛选和检测，选择出具有特定表达水平和性状的转基因植物。
因此，本研究旨在通过农杆菌介导的DREB1C基因转化技术，将DREB1C基因转化到苜蓿中，寻找抗逆性和提高品质的苜蓿转基因材料。
二、研究方法和流程1. 提取DREB1C基因：从拟南芥中提取DREB1C基因，并进行PCR扩增。
2. 构建转化载体：将DREB1C基因克隆到载体pCAMBIA1390中，形成转化载体pCAMBIA1390-DREB1C。
3. 构建植物转化体系：采用农杆菌介导的遗传转化技术，将构建好的转化载体pCAMBIA1390-DREB1C导入到苜蓿中，以获得转基因苜蓿植株。
4. 田间验证：选取具有DREB1C基因的转基因苜蓿植株，在田间验证其表现和品质等性状。
5. 结果分析：通过一系列检测和观察，对转基因苜蓿植株的生长、发育、抗逆性和品质进行评价，分析DREB1C基因在苜蓿中的作用效果。
三、研究预期结果1. 成功实现苜蓿的转基因：通过农杆菌介导的基因转化技术，成功将DREB1C 基因转化到苜蓿中，获得具有DREB1C基因的转基因苜蓿。
根癌农杆菌介导的植物基因转化技术
实验7 根癌农杆菌介导的植物基因转化技术根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）是一种能诱发植物产生肿瘤的细菌，根癌农杆菌中诱导植物产生肿瘤的质粒（Tumor inducing plasmid），简称为Ti质粒。
野生型农杆菌的Ti质粒，含有两个与致瘤有关的区域：一个是T－DNA区（transferred DNA region），含致瘤基因；另一个是毒性区（Virulence region），在T－DNA的切割、转移与整合过程中起作用。
用于植物基因转化的农杆菌Ti质粒载体系统的构建，是将野生Ti质粒中的致瘤基因删除，并在T－DNA区域内插入适当的选择标记和多克隆位点。
图1是植物表达载体pBI121的DNA图谱，以CaMV35S启动子驱动的新霉素磷酸转移酶基因NPTII为卡那霉素抗性选择标记基因，以β－葡萄糖苷酶（β－glucuronidase,Gus）为报告基因，经pBI121转化的获得的转基因细胞、组织或植株，具有抗卡那霉素的特性，经组织化学染色呈蓝色。
图2－1 Ti质粒载体pBI121图谱实验要求：掌握根癌农杆菌侵染植物获取转基因材料的方法；理解农杆菌介导途径进行基因转化的机理；了解转基因植物筛选的方法。
一、试材与用具1．植物材料：烟草无菌苗2．农杆菌与载体：农杆菌LBA4404、质粒PBI1213．主要仪器：超净工作台、高压灭菌锅、小型离心机、光照培养箱或培养室、恒温摇床等。
二、方法步骤1．试剂的配制（1）YEB培养基：牛肉膏（5g/L），酵母抽提物（1g/L），蛋白胨（5g/L），蔗糖（5g/L），MgSO4（2mmol/L） pH7.2。
固体培养基含琼脂15g/L。
（2）烟草分化培养基：MS + 2mg/L 6-BA + 0.5mg/L IAA（3）烟草生根培养基：MS + 0.5mg/L IAA（4）卡那霉素（Kan）母液：100mg/ml，过滤除菌，分装，－20℃保存。
根癌农杆菌介导的植物遗传转化研究
根癌农杆菌介导的植物遗传转化研究摘要介绍了农杆菌介导的植物原位转基因方法发展状况、技术环节以及在转化机制上的研究结果,并对存在的问题以及应用前景进行了讨论。
关键词根癌农杆菌;植物;遗传转化1根癌农杆菌介导的基因转化原理野生型根癌农杆菌是一种土壤病原细菌,它通过根部伤口侵入植物体,刺激寄主在侵染部位形成冠瘿瘤,引发根癌病。
该病在世界范围内普遍发生,患病植株株体衰弱,严重时整株死亡,在生产上危害极大。
冠瘿瘤的形成是根癌农杆菌染色体外的遗传物质Ti质粒上的一段DNA(T-D NA)转移到植物细胞,整合到染色体组并进行表达的结果。
这种具有天然转基因功能的质粒,改造后,在基因工程中可以用作基因转移的载体。
根癌农杆菌中诱导植物产生肿瘤的质粒,简称Ti质粒。
野生型根癌农杆菌的Ti质粒含有2个与致瘤有关的区域:一个是T-DNA区,含有致瘤基因;另一个是毒性区,在T-DNA的切割、转移、整合过程起作用,用于植物基因转化的农杆菌Ti质粒中致瘤基因删除,并在T-DNA区域插入适当的选择标记和多克隆位点。
2根癌农杆菌介导的基因转化的特点2.1导入基因拷贝数低,表达效果好农杆菌介导的转化向植物细胞导入的外源基因拷贝数大多只有1~3个,而其他方法往往会有几十个,大量拷贝会导致转基因的沉默。
2.2转化频率高T-DNA链在转移过程中受到蛋白质的保护及定向作用,可免受核酸酶的降解,从而完整、准确地进入细胞核,转化效率较高。
2.3导入植物细胞的片段确切,且能导入大片段的DNATi质粒上位于2个边界序列之间的外源基因片段均会转移到植物细胞,可避免其他理化方法将非目的基因片段导入植物细胞而造成潜在遗传物质扩散的危险。
3影响农杆菌转化效率的因素3.1受体的来源及发育状态应该选择活跃分裂的功能细胞,如愈伤组织胚性细胞、幼胚等,这些细胞处于良好的脱分化状态,DNA合成能力强,有利于T-DNA的整合。
3.2农杆菌菌株的选择与质粒的构建超毒力的农杆菌菌株和超毒双元载体,能够增强农杆菌的侵染能力和T-DNA 的整合能力,较好地克服农杆菌对单子叶植物敏感性差的问题。
根癌农杆菌介导的植物基因遗传转化技术PPT课件
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三亲交配法（triparental mating ）
无论是共整合载体系统还是双元载体系统，把 中间载体质粒由大肠杆菌转移到土壤农杆菌中都 需要三种细菌参与，通常把这一过程称为三亲交 配法
1.受体农杆菌 2.协助菌（带有协助质粒的大肠杆菌） 3.供体菌（带有重组植物表达载体的大肠杆菌） 原理：三种菌混合时，协助质粒游动进入供体 菌中，将供体菌中的表达载体转移到受体菌中， 最后经过适当的抗生素筛选即可获得土壤农杆菌 转化结合体
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整株感染法
• 人为地在植株上造成创伤，然后把含有重组质粒 的根癌农杆菌接种在创伤面上，或把含有重组质 粒的根癌农杆菌注射到植物体内，使菌体在植物 体内进行浸染实现转化。
• 为获得较高的转化频率，多采用无菌种子的实生 苗或试管苗。
• 在筛选转化体时，可将感染部位的薄壁组织切 下放入选择培养基上及诱发愈伤组织的培养基 上进行筛选和愈伤组织诱导。最后将转化的愈 伤组织转移至含合适植物激素的培养基上诱导 再生植株
• 任何适合于克隆在pBR322质粒中的外源DNA片 段都可以通过与pBR322质粒DNA的同源重组而 被共整合到Onc-Ti质粒载体上。
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改造后的Ti质粒的基本结构
a. DNA复制 起始位点
b. 选择标记 基因
c. T-DNA的 边界序列
d. 多克隆位 点
左边界序列
右边界序列
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叶盘转化法
• 打孔器从消毒叶片上打孔，获得 圆形叶片，即叶盘 • 将叶盘放入根癌农杆菌液浸泡几秒钟，使根癌农杆菌
浸染叶盘 • 滤纸吸干叶盘上多余的菌液，将处理过的叶盘置于培
农杆菌介导DR1172基因转化拟南芥
农杆菌介导DR1172基因转化拟南芥张新;崔广艳;陈翠娜;张思维;代其林;王劲【期刊名称】《基因组学与应用生物学》【年(卷),期】2012(31)6【摘要】耐辐射奇球菌(D.radiodurans,DR)能在极端胁迫条件下生存,并且拥有一个独特的极端环境抗性基因组而被广泛用于研究。
其中DR1172是在耐辐射球菌中分离出的一段基因,与LEA76家族同源,参与植物的抗旱机制。
本研究利用基因工程手段以载体pBI121为基础构建植物DR1172-GV3103表达载体,然后利用花序浸染法将目的基因DR1172转入模式植物拟南芥中,T2代得到50株植物,阳性为15棵,转化率为30%。
该研究为探讨DR1172基因的功能以及植物抗逆机制提供了丰富的拟南芥材料,而且对利用基因工程技术手段改良植物性状,培育出抗逆性强的植物优良品种有重要的指导价值。
【总页数】5页(P582-586)【关键词】拟南芥;DR1172;载体构建;遗传转化;抗旱【作者】张新;崔广艳;陈翠娜;张思维;代其林;王劲【作者单位】西南科技大学极端环境生物资源利用实验室;中国农业科学院生物技术研究所【正文语种】中文【中图分类】Q943【相关文献】1.根癌农杆菌介导油菜CBF1基因转化拟南芥 [J], 段红英;丁笑生;周延清;周春娥2.农杆菌介导DR1172基因转化甘蓝型油菜的研究 [J], 张新;崔广艳;陈翠娜;张思维;代其林;王劲3.农杆菌介导DR1372基因转化拟南芥的研究 [J], 张思维;周文波;张新;陈翠娜;代其林4.农杆菌介导的TaLEA1 基因对拟南芥的遗传转化 [J], 包宇;赵咏梅;俞嘉宁;杨建雄5.用根癌农杆菌介导EPSPS基因遗传转化拟南芥的研究 [J], 龚元亚; 代其林; 杨娟; 鲜先毅; 孙英坤; 谢琳; 王劲因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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剂 草甘 膦 就 是 根据 这 个 原 理消 灭 植 物 的 。其 中Ｇ 一 ｒＡ 因是 来 ２ａｏ基
自草甘 膦 生产 厂 周 围污染 土 壤 中 的荧 光假 单胞 菌 ， 该基 因编 码 的 Ｅ Ｓ 合酶 作 为植 物体 内源 Ｅ Ｓ 合 酶 的 同功 酶 ，其 构 象差 异造 成 对 ＰＰ ＰＰ Ｆ： ５ 一 Ｃ Ｔ Ｃ Ｔ Ｃ Ａ Ｇ ３ Ｇ－ ＣＴ Ｇ ＣＴ Ｃ ＡＧ Ｔ Ａ－ 草甘 膦 亲 和 性 下 降 ，从 而使 植 株 获 得抗 药 性 。 为 了研 究 基 Ｒ： ５ ～ Ｔ ＧＣ Ｇ ＴＣ Ａ ｃＧ Ｔ ３ Ａ Ａ Ｇ Ｔ Ｃ Ｇ Ｔ Ｔ一 因在 拟 南芥 中 的表达 ，我 们采 用 花序 浸 染 的遗传 转 化 方法 ，对 拟 扩 增 产 物 为 ３ ５ ｐ Ｃ 条 件为 ９ ℃ 下３ ｉ ７ ｂ ，Ｐ Ｒ ４ ｍ ｎ，９ ４℃３ ｓ Ｃ ０ｅ ， 南 芥进 行 遗 传转 化 ，得 到转 化 后 的种 子 。对 转化 种 子进 行 抗性 筛 ３ ０ｅ ，７ ： ｓ ｃ Ｃ３ ３ ２ Ｃ延 ｍｎ 选 ，得 到抗 性筛 选植 株 ，并进 行Ｐ Ｒ Ｃ 检测 ，进 一 步筛选 阳性 的转 基 ５ ℃３ ｓ ｃ ２ ０ ｅ 复性 并 延伸 ，３ 个循 环 ，７ ￣ 伸５ ｉ ， 将 扩增得 到 的ＰＲ 物用 ０８琼 脂糖 凝胶 电泳检 测 。 Ｃ产 ．％ 因植株 。 １２５ 转 基 因植株 纯 系的 获得 进行 ＰＲ ．． Ｃ 检测 后 ，确认 为转基 因植 １ 料 和 方 法 材 株 。将 转 基 因植株 在适 宜 条件 下 栽种 ， 开花 结籽 ，收获 第二 代种 １ １材料 ． 子 。重复 此步骤 ，直 到获得 几代 转基 因纯系 。 １ １ １ 实验 材 料 转 ．． ’ 因 的大肠 杆 菌 基 — Ｈ 和 农 杆菌 Ｄ５ ａ （ ｇ ｏ ａ ｔ ｒ ｕ ｔ ｍ ｆ ｃ ｅ ｓ Ｐ Ｐ － Ｂ １ ５ Ａ ｒ ｂ ｃ ｅ ｉ ｍ ｕ ｅ ａ ｉ ｎ ）Ｅ Ｓ Ｓ Ｅ Ａ ０ 由实验 室保 存 。拟 ２实 验 结 果 南芥 生态 型Ｃ ｌ Ｃ ｌｍ ｉ ） ｏ （ｏ ｕ ｂ ａ 。 １ １ ２ 主要 试 剂 植物 凝胶 （ ａ ｏ ．． Ｗ Ｋ ），Ｍ 粉 （ ｉ ｍ ），卡那 霉素 Ｓ Ｓ ｇａ （ ｉ Ａ Ｉ Ｎ ） ，Ｃ Ａ ，各种 引物 （ Ｂｏ Ｂ ＳＣ ＩＣ ＴＢ 由英 俊生 物技 术有 限公司 合 成 ），Ｔ ｑ Ｎ 聚 合酶 （ ｉ ｎ ｅ ｉ ｔ ｃ ａ ＤＡ Ｔ ａ ｇ ｎ Ｂ ｏ ｅ ｈ）。 １２方 法 ． １ ２ １ 拟 南芥植 株 的培 养 将 拟 南芥 种子 在４Ｃ 藏箱 中春 化３ 左 ．． ＂冷 ｄ 右 。将 腐殖 士和 蛭石 以２ ｌ 匀 ，经高 压灭 菌后装 入 到直 径为８ ｍ ： 混 ｃ 的塑料 盆 中 ，用 水将 盆 中 的土壤 浇 透 。把 春 化好 的拟 南 芥种 子用
杯 。将浸 染后 的植 株套袋 以保 湿 ，暗室 培养２ ｈ ４ 。并隔天 浇水 ，保 持湿润 状态 。待种子 长大 ，植 株 自然 开裂 时收获种子 。 １ ２３ 转 基 因种 子的抗 性 筛选 将 收获 的拟 南 芥种 子在 超净 工 作 ．． 台 中用 ７％ ５ 乙醇及 ２ ５次 氯酸 钠 消毒 ，消毒 完 毕后铺 在 含５ｍ ・ ．％ ０ｇＬ Ｋｎ ｓ ａ 的Ｍ 培养 基 中 ，放在 ４ ＂ Ｃ冰箱 中春化 ２后 ，置于 ２ ℃温室 中光 ｄ ２ 照 培养 ７ ９ ，观 察 植株 生长 现 象 。根据 生长 状 况判 断是 否 为转基 —ｄ 因植株 。 １２ ４ 再 生植株 的Ｐ Ｒ 定 采 用Ｃ Ａ 法抽 提 拟 南芥 再生 植株Ｄ Ａ ．． Ｃ鉴 ＴＢ Ｎ 用 于Ｐ Ｒ Ｃ 反应 。用 质 粒 抽提 试 剂 盒 提取 大 肠 杆 菌 （ ｓ ｈ ｒ ｃ ｉ Ｅ ｃ ｅ ｉｈ ａ ｃ ｌ） Ｐ Ｐ －Ｈ ｏ ｉ Ｅ ＳＳ Ｄ ５ ａ中的质粒Ｄ Ａ Ｎ 作为扩 增 的阳性对照 ， 以未转 染拟 南芥植 株 的Ｄ Ａ 为阴性对 照 。引物 序列 根据 Ｎ做 基 因序 列设计 ：
２ １ 年 第 Ｏ 期 ０ １ ４ （ 总第２ ４ ） ５期
吉 林 农 业
Ｊ ＬＩ Ａ ＧＲＩ Ｉ Ｎ ＣＵＬ ＴＵＲＡＬ
Ｎ Ｏ ． ４． ２ １ ０ ０１
（ ｕ ｌｔ ｅｙ Ｏ．５ ） Ｃ ｍｕａｉ ｔ Ｎ ２ ４ ｖ
用根癌农杆菌介导
嗍
因遗传转化拟南芥的研究
琳 ，王 劲
生物 合成 过 程 中一个 关 键 性 的酶 ，参 与 生成 生物 碱 、 维生 素 、香 豆 素 、吲 哚 类衍 生物 、酚 类 、类 黄酮 和木 质 素 物质 等 次生 代谢 物 的合成 。 当给植 物喷 施草 甘膦 时 ，草甘 膦与劂 结 合 ，阻止 了此 酶 的活 性 ， 导致 氨基 酸 合成 受 阻 ，随 后植 株死 亡 。农业 上用 除 草
龚 元 亚 ，代 其林 ，杨 娟 ’ 鲜先 毅 ， ，孙 英 坤 ，谢
（ ．西 南科 技 大 学生命科 学 与工程 学院 ，四川 绵 阳 ６ １ １ ：２ 中 国农业科 学院生 物技 术研 究所 ，北京 １０ ８ ） １ ２０ ０ ． ０ ０ １
摘要 ：研 究通 过 花序 浸染 法 ，．Ｅ Ｓ Ｓ 因导入拟 南芥 （ｒ ｂ ｄ ｐ ｉ ｔ ａ ｉ ｎ ） Ｃ ｌ Ｃ ｌ ｍ ｉ ） 态 型植株 中 ，通 过 卡那 霉素 ￣ ＰＰ Ａ ａ ｉｏ ｓ Ｓ ｈ ｌ ａ ａ ｏ （ｏ ｕｂ ａ 生 对 种 子 的抗 性 筛选 及 常规 Ｐ Ｒ 再生 植株 进 行 阳性 鉴 定。初 步证 明 ，Ｅ Ｓ Ｓ 因 已经成 功 转化 拟 南芥 ，经过 反 复 筛选 ， 获得 转基 因纯 ｃ对 ＰＰ 基
系植株 。 关键 词 ：拟 南芥 ；Ｐ Ｒ 测；Ｅ Ｓ Ｓ Ｃ检 ＰＰ
中图 分类号 ：Ｑ ４ ９６
文 献标识 码 ：Ａ
文 章编号 ： １ ７ ～ ４ ２ （ ０ １ ０ － ０ ０ ２ ６ ４ ０ ３ ２ １ ）一 ４ ０ ６ —
拟 南 芥是 典型 的 十字 花科 植物 ，因其 独 有 的生物 学特 性 而成 ，被 誉 为植 物 界 的 “ 果蝇 ”。５ 一 烯醇 丙酮 莽 草 酸－－ 酸 合成 酶 （Ｐ Ｐ ３磷 Ｅ ＳＳ），是 真 菌 、细菌 、藻类 和高 等植 物 体 内芳 香族 氨 基酸 （ 括色 氨 酸 、酪 氨 酸 、苯丙 氨 酸） 包