原位杂交技术
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时间
一般探针浓度下，杂交反应在4-6小时内完成。 孵育6小时后----杂交信号不在增强。 反应超过24小时后----已形成的杂交体可能发生
解链，杂交信号反而减弱。
严格度概念
在某些条件下，探针可以与含不相配碱基的核酸序列相结合 而形成不稳定的杂交体。
严格度
决定探针是否与含不相配碱基的核酸序列结合的 条件称为严格度。
上述两种方法敏感度不高，应用不够普遍。
发展简史
1987年 Pezzella用磺基化DNA探针，以单克 隆抗体识别磺基化探针，通过免疫组化显示结 合的单克隆抗体，对杂交结合探针定位。 优点：探针标记简便，不需作切片平移标记， 敏感度较高。
发展简史
1991年 Couton建立将非放射性标记技术更新 为亲和复合物标记技术
原位杂交技术
原位杂交技术的概念 原位杂交技术的发展简史 原位杂交技术的原理、条件及方法 原位杂交技术的应用
概念
原位杂交技术是用标记的核酸探针，经放射自 显影或非放射体系，在组织、细胞、间期核计 染色体上对核酸进行定位和相对定量研究的一 种手段。
可分为两类：RNA原位杂交和染色体原位杂交 两大类。
高严格度条件下 碱基完全互补的双链可形成杂交体 低严格度条件下 碱基对不完全互补的双链也可以形成杂交体
原位杂交的方法
1.探针 2.组织样品制备 3.原位杂交 4.基本实验过程
探针
（一）探针的选择 cDNA和RNA:适宜于检测mRNA分子
（二）探针标记物的选择
原位杂交标记物的检测灵敏度排序
温度
杂交时温度一般低于相对杂交体Tm值25℃
（Tm值：是核酸的融解温度，是一半双链分子解链时的温度。）
当杂交液含50％甲酰胺、盐浓度0.75mol/ml左 右时杂交温度： 对DNA探针是42℃ 对RNA探针是50-55℃ 对寡核苷酸探针是37℃
PH
ph在5-9范围内，杂交体形成不受影响。
常用缓冲液浓度ph为6.5-7.5
RNA原位杂交：用放射性或非放射性（如地高 辛、生物素）标记的特异性探针与被固定的 组织切片反应，若细胞中存在与探针互补的 mRNA分子，两者杂交产生双链DNA，就可通过 检测放射性标记或经酶促免疫变色，对该基 因的表达产物在细胞水平上做定性定量分析。
主要用来检测细胞和组织内RNA表达的一种原 位杂交技术。
原理：碱基互补配对原则
No Image
原位分子杂交
杂交体
杂交条件
严格度概念
DNA-DNA
杂交体
DNA-RNA RNA-RNA
稳定性：
DNA-DNA﹥DNA-RNA ﹥RNA-RNA
稳定性受以下因素影响：甲酰胺浓度 盐浓度等 温度等
原位杂交技术的条件
杂交液 探针浓度 温度 PH 时间
杂交液
1970年，Orth应用3H标记的兔乳头状瘤病毒 cRNA探针与兔乳头状瘤组织的冰冻切片进行杂 交，首次用原位杂交技术检出了病毒DNA在细 胞中的定位。
发展简史
1971年， Jacob 创立电镜原位杂交技术检测 爪蟾卵母细胞DNA
80年代，原位杂交技术飞速发展，现已能检测 只有数百碱基对的较小分子DNA和含量很低的 mRNA
对溶液和耐高温塑料器具作高温蒸汽消毒 化学方法：
焦磷酸二乙酯（DEPC） 作用机制：通过与组氨酸结合使蛋白质变性
（二）取材
组织要求新鲜，迅速投入到固定液中 标本置于低温环境下可抑制RNA酶作用
（三）固定
4％多聚甲醛培养2-6小时（培养细胞30分钟）
（四）包埋和切片
常规方法
（五）电镜杂交技术
当时的工作多采用冰冻组织切片或培养细胞， 探针均采用同位素标记。
发展简史
1981，Bauman等首先应用荧光素标记cRNA探针 做原位杂交，然后用荧光显微镜观察获得成 功——荧光杂交技术。
1982，Shroyer报道用2，4二硝基苯甲醛（DNP） 标记DNA探针，使该DNA探针具有抗原性，然后 用兔抗DNP的抗体来识别杂交后的探针，最后 经免疫过氧化物酶的方法来定位杂交探针
32P﹥35S﹥3H﹥地高辛/生物素
生物素：在动物细胞中是羧化酶的辅酶，在肝、肾、心、
肺等组织中丰富，主要集中在线粒体中。 地高辛：从洋地黄植物的花和叶中提取。
（动物细胞中不存在）
组织样品制备
（一）.去除或抑制RNA酶
方法有两类：
物理方法： 对耐高温的器具如玻璃器皿，不锈钢器具进行高
温烘烤（180-200℃干烤4-6小时）。
发展趋势：实验室常规技术和临床日常应用的 诊断技术。
Back
原位杂交技术的原理
使含有特殊序列、经过标记的核苷酸单链探针， 既带有标记的（放射性同位素，如3H、35S、 32P，荧光素生物素、地高辛等非放射性物质） DNA或RNA片段，与组织切片或细胞内待测核酸 （RNA或DNA）片段既靶细胞进行杂交，然后可 用放射自显影等方法予以显示，在光镜或电镜 下观察目的 mRNA或DNA 的存在并定位。
（六）冷冻切片
冷冻切片保存靶细胞较多，较易获得杂交 信号
原位杂交
（一）杂交前处理
1.灭活内源性酶 在用酶作为报告分子时
（过氧化物酶 碱性磷酸酶）
2.RNA酶处理 3.盐酸和乙酸酐处理 提高杂交效率并降低背景 4.通透处理 消化去除细胞表面和内部特别是靶细胞
周围的蛋白质，增加探针等反应分子对 靶核酸分子的接触机会
荧光原位杂交：首先对寡核苷酸做特殊的 修饰和标记，然后用原位杂交法与靶染色 体或DNA 上特定的序列结合，通过与荧光 素分子相耦联的单克隆抗体来确定该DNA序 列在染色体的位置。
常用于已知基因或序列的染色体定位和未 克隆基因或遗传标记及染色体畸变的研究。
Back
发展简史
1969年美国耶鲁大学Gall和Pardueຫໍສະໝຸດ Baidu先创立的， 他们用爪蟾核糖体基因探针与其卵母细胞杂交， 确认该基因位于卵母细胞的核仁中。
➢ 钠盐（杂交效率提高 ↑ 非特异性反应↓ ） ➢ 甲酰胺 （使杂交所需温度降低） ➢ 硫酸葡聚糖 （提高探针浓度） ➢ 牛血清白蛋白和载体DNA等 （阻断探针与组织非特异性结合）
探针浓度
探针浓度影响杂交反应浓度
放射性标记探针0.5ug/ml 非放射性为2ug/ml 最适宜的探针浓度要经过具体实验摸索得到确 定。
一般探针浓度下，杂交反应在4-6小时内完成。 孵育6小时后----杂交信号不在增强。 反应超过24小时后----已形成的杂交体可能发生
解链，杂交信号反而减弱。
严格度概念
在某些条件下，探针可以与含不相配碱基的核酸序列相结合 而形成不稳定的杂交体。
严格度
决定探针是否与含不相配碱基的核酸序列结合的 条件称为严格度。
上述两种方法敏感度不高，应用不够普遍。
发展简史
1987年 Pezzella用磺基化DNA探针，以单克 隆抗体识别磺基化探针，通过免疫组化显示结 合的单克隆抗体，对杂交结合探针定位。 优点：探针标记简便，不需作切片平移标记， 敏感度较高。
发展简史
1991年 Couton建立将非放射性标记技术更新 为亲和复合物标记技术
原位杂交技术
原位杂交技术的概念 原位杂交技术的发展简史 原位杂交技术的原理、条件及方法 原位杂交技术的应用
概念
原位杂交技术是用标记的核酸探针，经放射自 显影或非放射体系，在组织、细胞、间期核计 染色体上对核酸进行定位和相对定量研究的一 种手段。
可分为两类：RNA原位杂交和染色体原位杂交 两大类。
高严格度条件下 碱基完全互补的双链可形成杂交体 低严格度条件下 碱基对不完全互补的双链也可以形成杂交体
原位杂交的方法
1.探针 2.组织样品制备 3.原位杂交 4.基本实验过程
探针
（一）探针的选择 cDNA和RNA:适宜于检测mRNA分子
（二）探针标记物的选择
原位杂交标记物的检测灵敏度排序
温度
杂交时温度一般低于相对杂交体Tm值25℃
（Tm值：是核酸的融解温度，是一半双链分子解链时的温度。）
当杂交液含50％甲酰胺、盐浓度0.75mol/ml左 右时杂交温度： 对DNA探针是42℃ 对RNA探针是50-55℃ 对寡核苷酸探针是37℃
PH
ph在5-9范围内，杂交体形成不受影响。
常用缓冲液浓度ph为6.5-7.5
RNA原位杂交：用放射性或非放射性（如地高 辛、生物素）标记的特异性探针与被固定的 组织切片反应，若细胞中存在与探针互补的 mRNA分子，两者杂交产生双链DNA，就可通过 检测放射性标记或经酶促免疫变色，对该基 因的表达产物在细胞水平上做定性定量分析。
主要用来检测细胞和组织内RNA表达的一种原 位杂交技术。
原理：碱基互补配对原则
No Image
原位分子杂交
杂交体
杂交条件
严格度概念
DNA-DNA
杂交体
DNA-RNA RNA-RNA
稳定性：
DNA-DNA﹥DNA-RNA ﹥RNA-RNA
稳定性受以下因素影响：甲酰胺浓度 盐浓度等 温度等
原位杂交技术的条件
杂交液 探针浓度 温度 PH 时间
杂交液
1970年，Orth应用3H标记的兔乳头状瘤病毒 cRNA探针与兔乳头状瘤组织的冰冻切片进行杂 交，首次用原位杂交技术检出了病毒DNA在细 胞中的定位。
发展简史
1971年， Jacob 创立电镜原位杂交技术检测 爪蟾卵母细胞DNA
80年代，原位杂交技术飞速发展，现已能检测 只有数百碱基对的较小分子DNA和含量很低的 mRNA
对溶液和耐高温塑料器具作高温蒸汽消毒 化学方法：
焦磷酸二乙酯（DEPC） 作用机制：通过与组氨酸结合使蛋白质变性
（二）取材
组织要求新鲜，迅速投入到固定液中 标本置于低温环境下可抑制RNA酶作用
（三）固定
4％多聚甲醛培养2-6小时（培养细胞30分钟）
（四）包埋和切片
常规方法
（五）电镜杂交技术
当时的工作多采用冰冻组织切片或培养细胞， 探针均采用同位素标记。
发展简史
1981，Bauman等首先应用荧光素标记cRNA探针 做原位杂交，然后用荧光显微镜观察获得成 功——荧光杂交技术。
1982，Shroyer报道用2，4二硝基苯甲醛（DNP） 标记DNA探针，使该DNA探针具有抗原性，然后 用兔抗DNP的抗体来识别杂交后的探针，最后 经免疫过氧化物酶的方法来定位杂交探针
32P﹥35S﹥3H﹥地高辛/生物素
生物素：在动物细胞中是羧化酶的辅酶，在肝、肾、心、
肺等组织中丰富，主要集中在线粒体中。 地高辛：从洋地黄植物的花和叶中提取。
（动物细胞中不存在）
组织样品制备
（一）.去除或抑制RNA酶
方法有两类：
物理方法： 对耐高温的器具如玻璃器皿，不锈钢器具进行高
温烘烤（180-200℃干烤4-6小时）。
发展趋势：实验室常规技术和临床日常应用的 诊断技术。
Back
原位杂交技术的原理
使含有特殊序列、经过标记的核苷酸单链探针， 既带有标记的（放射性同位素，如3H、35S、 32P，荧光素生物素、地高辛等非放射性物质） DNA或RNA片段，与组织切片或细胞内待测核酸 （RNA或DNA）片段既靶细胞进行杂交，然后可 用放射自显影等方法予以显示，在光镜或电镜 下观察目的 mRNA或DNA 的存在并定位。
（六）冷冻切片
冷冻切片保存靶细胞较多，较易获得杂交 信号
原位杂交
（一）杂交前处理
1.灭活内源性酶 在用酶作为报告分子时
（过氧化物酶 碱性磷酸酶）
2.RNA酶处理 3.盐酸和乙酸酐处理 提高杂交效率并降低背景 4.通透处理 消化去除细胞表面和内部特别是靶细胞
周围的蛋白质，增加探针等反应分子对 靶核酸分子的接触机会
荧光原位杂交：首先对寡核苷酸做特殊的 修饰和标记，然后用原位杂交法与靶染色 体或DNA 上特定的序列结合，通过与荧光 素分子相耦联的单克隆抗体来确定该DNA序 列在染色体的位置。
常用于已知基因或序列的染色体定位和未 克隆基因或遗传标记及染色体畸变的研究。
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发展简史
1969年美国耶鲁大学Gall和Pardueຫໍສະໝຸດ Baidu先创立的， 他们用爪蟾核糖体基因探针与其卵母细胞杂交， 确认该基因位于卵母细胞的核仁中。
➢ 钠盐（杂交效率提高 ↑ 非特异性反应↓ ） ➢ 甲酰胺 （使杂交所需温度降低） ➢ 硫酸葡聚糖 （提高探针浓度） ➢ 牛血清白蛋白和载体DNA等 （阻断探针与组织非特异性结合）
探针浓度
探针浓度影响杂交反应浓度
放射性标记探针0.5ug/ml 非放射性为2ug/ml 最适宜的探针浓度要经过具体实验摸索得到确 定。