pcr诱变课件
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DNA聚合酶在进行扩增目的DNA时会以一定的 DNA聚合酶在进行扩增目的DNA时会以一定的 聚合酶在进行扩增目的DNA 频率发生碱基错配， 频率发生碱基错配，这一现象恰好提供了一 种特定基因进行随机诱变的可能方法。 种特定基因进行随机诱变的可能方法。 利用PCR过程中出现的碱基错配进行特定基因 利用PCR过程中出现的碱基错配进行特定基因 PCR 随机诱变的技术就称为易错PCR PCR。 随机诱变的技术就称为易错PCR。 原理：较低的聚合酶（ Taq酶 原理：较低的聚合酶（如Taq酶）在特定措施 下很容易向扩增产物中掺入随机突变
方法：增加Mg 的浓度、改变dNTP的比例、 dNTP的比例 方法：增加Mg2+ 的浓度、改变dNTP的比例、调 节热循环参数、利用Mn 节热循环参数、利用Mn2+替代天然辅助因子 加入dITP 三磷酸脱氧核苷酸类似物） dITP（ Mg2+ 、加入dITP（三磷酸脱氧核苷酸类似物） 此方法可获得改善活性和稳定性的突变产物， 此方法可获得改善活性和稳定性的突变产物， 但易错PCR一般只产生点突变， PCR一般只产生点突变 但易错PCR一般只产生点突变，因此其产生的 突变体在多样性方面尚有一定缺陷。 突变体在多样性方面尚有一定缺陷。
扩增战略： 扩增战略：
PCR随机诱变 三、 PCR随机诱变
当对目的序列了解很少的情况下， 当对目的序列了解很少的情况下，需 要引入大量的随机诱变，构建突变库， 要引入大量的随机诱变，构建突变库，再 逐个筛选和鉴定 策略 1、利用简并引物 (error2、易错 PCR (error-prone PCR )
首先设计两个PCR反应以产生两个含 首先设计两个PCR反应以产生两个含 PCR 突变位点的DNA片段， DNA片段 突变位点的DNA片段，随后将上述两个 PCR产物混合 二者通过末端互补区结合 产物混合， PCR产物混合，二者通过末端互补区结合 并在适宜的温度下互为引物延伸 互为引物延伸得到完 并在适宜的温度下互为引物延伸得到完 整的含突变的基因，对第一次PCR PCR产物进 整的含突变的基因，对第一次PCR产物进 行纯化处理可显著提高突变效率
1、利用简并引物
简并引物的特点 端有十几个碱基是随机组合的。 5’端有十几个碱基是随机组合的。这一方 端有十几个碱基是随机组合的 法除引物特殊外， 法除引物特殊外，其余均与定点突变技术完 全一样。 全一样。利用简并引物可以产生大量随机突 变，并且这些突变都集中在很窄的一段区域 内。
易错PCR errorPCR（ PCR） 2 易错PCR（error-prone PCR）
连续易错PCR 连续易错PCR error（sequential error-prone PCR )
在通常情况下，经过一次易错PCR很难获得满 在通常情况下，经过一次易错PCR很难获得满 PCR 意结果，由此发展出连续易错PCR 意结果，由此发展出连续易错PCR 将一次PCR扩增得到的有用突变基因作为下一 将一次PCR扩增得到的有用突变基因作为下一 PCR PCR扩增的模板 连续反复地进行随机诱变， 扩增的模板， 次PCR扩增的模板，连续反复地进行随机诱变， 使每一次获得的小突变累积而产生重要的有 益突变。 益突变。
大引物PCR 大引物PCR 定点诱变技术路线
（圆点指突变位点） 圆点指突变位点）
3、环状诱变 PCR 法
定义：以整个带有目的基因的质粒为模板，用诱变剂 定义：以整个带有目的基因的质粒为模板， 进行扩增，最后产生环状的带有目的突变的质粒。 进行扩增，最后产生环状的带有目的突变的质粒。
方法：
①两个引物反向、紧邻但没有重叠区，扩增产物是平 两个引物反向、紧邻但没有重叠区， 末端的线性DNA 需用T4连接酶环化处理。 DNA， T4连接酶环化处理 末端的线性DNA，需用T4连接酶环化处理。 Stratagene公司开发的定点突变试剂盒为代表 公司开发的定点突变试剂盒为代表， ②以Stratagene公司开发的定点突变试剂盒为代表， 两个引物也是反向的并且其5 端有l5个碱基以上的 端有l5 两个引物也是反向的并且其5’端有l5个碱基以上的 重叠区，扩增产物为带黏性末端的线性DNA DNA， 重叠区，扩增产物为带黏性末端的线性DNA，可自 行环化。 行环化。
环状诱变 PCR 法
环状诱变 PCR 法
TAMS定点诱变技术 4、 TAMS定点诱变技术
有目的地扩增突变链定点诱变技术: 有目的地扩增突变链定点诱变技术:能够一次引入多个 位点的突变，并且能够有目的扩增突变链， 位点的突变，并且能够有目的扩增突变链，从而使突变链 效率几乎达到100% 效率几乎达到100% 线性单链DNA模板的制备。 线性PCR DNA模板的制备 PCR） 1、线性单链DNA模板的制备。（线性PCR） 突变链的合成: 个锚锭引物(Anchor5 Anchor3’ (Anchor5’和 2、突变链的合成:用2个锚锭引物(Anchor5 和Anchor3 ) 和多个诱变引物(Mut1 Mut2)， (Mut1和 和多个诱变引物(Mut1和Mut2)，首先在多核苷酸激酶的作 用下使每个引物磷酸化 接着在DNA聚合酶的作用下使引 磷酸化， DNA聚合酶 用下使每个引物磷酸化，接着在DNA聚合酶的作用下使引 DNA连接酶的作用下。 物与线性模板退火、延伸，最后在DNA连接酶的作用下 物与线性模板退火、延伸，最后在DNA连接酶的作用下。 合成突变链。 合成突变链。 有目的地扩增突变链：设计扩增引物(PCR5 (PCR5和 )， 3、有目的地扩增突变链：设计扩增引物(PCR5和PCR3 )， 使其3 端碱基分别与锚锭引物引入的突变碱基配对 端碱基分别与锚锭引物引入的突变碱基配对， 使其3’端碱基分别与锚锭引物引入的突变碱基配对，扩增 引物只能退火到突变链而不是亲本链， 引物只能退火到突变链而不是亲本链，所以只有突变链才 能扩增。 能扩增。
PCR诱变 PCR诱变
PCR诱变 PCR诱变
PCR定点诱变 （1）PCR定点诱变 几种碱基变化的PCR PCR引入 （2）几种碱基变化的PCR引入 （3）PCR随机诱变（易错PCR） PCR随机诱变 易错PCR 随机诱变（ PCR）
PCR定点诱变 一、PCR定点诱变
应用PCR原理，可以直接进行定点诱变， 应用PCR原理，可以直接进行定点诱变，并 PCR原理 且不需要采用噬菌体M13. 且不需要采用噬菌体M13. 首先，把需诱变的基因克隆于质粒上， 首先，把需诱变的基因克隆于质粒上，把 带有诱变目标基因的质粒，分成两个反应管， 带有诱变目标基因的质粒，分成两个反应管， 每个反应管加入不同的引物， 每个反应管加入不同的引物，每个反应管的 一对引物中， 一对引物中，有一个引物需按诱变意图改变 碱基，即该碱基是错配的， 碱基，即该碱基是错配的，每对引物的互补 位置不同， 位置不同，同一管中每条几乎处于同一起点 但放向相反。 但放向相反。
重叠延伸PCR (over1、重叠延伸PCR (over-lap extension PCR, OEOE-PCR ) 大引物PCR PCR法 2、大引物PCR法（megaprimer PCR ) 3、环状诱变 PCR 法 4、TAMS 定点诱变技术
重叠延伸PCR OE-PCR） 1、重叠延伸PCR （OE-PCR）
TAMS定点诱变技术 TAMS定点诱变技术
几种碱基变化的PCR PCR引Байду номын сангаас 二 几种碱基变化的PCR引入
首先，在诱变引物合成时， 首先，在诱变引物合成时，按设计使某位置发生 种核苷酸均有出现的可能。例如， 4种核苷酸均有出现的可能。例如，要合成一段含三个 的引物，只要在G原料中加入一定比例的A G的引物，只要在G原料中加入一定比例的A、C、T，那么 可以出现在G位置上含G 的产物。 可以出现在G位置上含G、A、T或C的产物。这段引物是 结合于基因上需要诱变的位置的。 PCR之前 之前， 结合于基因上需要诱变的位置的。在PCR之前，需把目标 目标基因或序列克隆于质粒， 目标基因或序列克隆于质粒，并使目标基因两端的质粒上 均有内切酶切点，以方便把克隆片段切出。 均有内切酶切点，以方便把克隆片段切出。
大引物PCR PCR法 2、大引物PCR法（megaprimer PCR )
先设置一个PCR反应产生一个含突变的DNA 先设置一个PCR反应产生一个含突变的DNA PCR反应产生一个含突变的 片段，然后再以此DNA DNA片段作为引物与原模板 片段，然后再以此DNA片段作为引物与原模板 退火进行PCR扩增得到含突变的完整的基因。 PCR扩增得到含突变的完整的基因 退火进行PCR扩增得到含突变的完整的基因。 因为作为引物使用的DNA DNA片段较通常的引物要 因为作为引物使用的DNA片段较通常的引物要 大许多甚至有上百碱基， 大许多甚至有上百碱基，所以命名为大引物 PCR法 PCR法。
PCR后 经PCR后，每个管产生了含有改变了特定碱基 的产物，但留有缺口。因此， 的产物，但留有缺口。因此，产物是线状的 DNA链 由于引物互补位置不同， DNA链，由于引物互补位置不同，两个管的产 物的缺口位置也不同， 物的缺口位置也不同，当把两个反应管的产 物混合，经变性和退火处理， 物混合，经变性和退火处理，来自不同反应 管的线状DNA链可杂交形成双链环状的DNA DNA链可杂交形成双链环状的DNA分 管的线状DNA链可杂交形成双链环状的DNA分 但仍有缺口。 子，但仍有缺口。由于环化分子可以转化大 肠埃希菌，在体内可把缺口修复， 肠埃希菌，在体内可把缺口修复，这样可以 获得定点改变了特低碱基的基因。 获得定点改变了特低碱基的基因。
方法：增加Mg 的浓度、改变dNTP的比例、 dNTP的比例 方法：增加Mg2+ 的浓度、改变dNTP的比例、调 节热循环参数、利用Mn 节热循环参数、利用Mn2+替代天然辅助因子 加入dITP 三磷酸脱氧核苷酸类似物） dITP（ Mg2+ 、加入dITP（三磷酸脱氧核苷酸类似物） 此方法可获得改善活性和稳定性的突变产物， 此方法可获得改善活性和稳定性的突变产物， 但易错PCR一般只产生点突变， PCR一般只产生点突变 但易错PCR一般只产生点突变，因此其产生的 突变体在多样性方面尚有一定缺陷。 突变体在多样性方面尚有一定缺陷。
扩增战略： 扩增战略：
PCR随机诱变 三、 PCR随机诱变
当对目的序列了解很少的情况下， 当对目的序列了解很少的情况下，需 要引入大量的随机诱变，构建突变库， 要引入大量的随机诱变，构建突变库，再 逐个筛选和鉴定 策略 1、利用简并引物 (error2、易错 PCR (error-prone PCR )
首先设计两个PCR反应以产生两个含 首先设计两个PCR反应以产生两个含 PCR 突变位点的DNA片段， DNA片段 突变位点的DNA片段，随后将上述两个 PCR产物混合 二者通过末端互补区结合 产物混合， PCR产物混合，二者通过末端互补区结合 并在适宜的温度下互为引物延伸 互为引物延伸得到完 并在适宜的温度下互为引物延伸得到完 整的含突变的基因，对第一次PCR PCR产物进 整的含突变的基因，对第一次PCR产物进 行纯化处理可显著提高突变效率
1、利用简并引物
简并引物的特点 端有十几个碱基是随机组合的。 5’端有十几个碱基是随机组合的。这一方 端有十几个碱基是随机组合的 法除引物特殊外， 法除引物特殊外，其余均与定点突变技术完 全一样。 全一样。利用简并引物可以产生大量随机突 变，并且这些突变都集中在很窄的一段区域 内。
易错PCR errorPCR（ PCR） 2 易错PCR（error-prone PCR）
连续易错PCR 连续易错PCR error（sequential error-prone PCR )
在通常情况下，经过一次易错PCR很难获得满 在通常情况下，经过一次易错PCR很难获得满 PCR 意结果，由此发展出连续易错PCR 意结果，由此发展出连续易错PCR 将一次PCR扩增得到的有用突变基因作为下一 将一次PCR扩增得到的有用突变基因作为下一 PCR PCR扩增的模板 连续反复地进行随机诱变， 扩增的模板， 次PCR扩增的模板，连续反复地进行随机诱变， 使每一次获得的小突变累积而产生重要的有 益突变。 益突变。
大引物PCR 大引物PCR 定点诱变技术路线
（圆点指突变位点） 圆点指突变位点）
3、环状诱变 PCR 法
定义：以整个带有目的基因的质粒为模板，用诱变剂 定义：以整个带有目的基因的质粒为模板， 进行扩增，最后产生环状的带有目的突变的质粒。 进行扩增，最后产生环状的带有目的突变的质粒。
方法：
①两个引物反向、紧邻但没有重叠区，扩增产物是平 两个引物反向、紧邻但没有重叠区， 末端的线性DNA 需用T4连接酶环化处理。 DNA， T4连接酶环化处理 末端的线性DNA，需用T4连接酶环化处理。 Stratagene公司开发的定点突变试剂盒为代表 公司开发的定点突变试剂盒为代表， ②以Stratagene公司开发的定点突变试剂盒为代表， 两个引物也是反向的并且其5 端有l5个碱基以上的 端有l5 两个引物也是反向的并且其5’端有l5个碱基以上的 重叠区，扩增产物为带黏性末端的线性DNA DNA， 重叠区，扩增产物为带黏性末端的线性DNA，可自 行环化。 行环化。
环状诱变 PCR 法
环状诱变 PCR 法
TAMS定点诱变技术 4、 TAMS定点诱变技术
有目的地扩增突变链定点诱变技术: 有目的地扩增突变链定点诱变技术:能够一次引入多个 位点的突变，并且能够有目的扩增突变链， 位点的突变，并且能够有目的扩增突变链，从而使突变链 效率几乎达到100% 效率几乎达到100% 线性单链DNA模板的制备。 线性PCR DNA模板的制备 PCR） 1、线性单链DNA模板的制备。（线性PCR） 突变链的合成: 个锚锭引物(Anchor5 Anchor3’ (Anchor5’和 2、突变链的合成:用2个锚锭引物(Anchor5 和Anchor3 ) 和多个诱变引物(Mut1 Mut2)， (Mut1和 和多个诱变引物(Mut1和Mut2)，首先在多核苷酸激酶的作 用下使每个引物磷酸化 接着在DNA聚合酶的作用下使引 磷酸化， DNA聚合酶 用下使每个引物磷酸化，接着在DNA聚合酶的作用下使引 DNA连接酶的作用下。 物与线性模板退火、延伸，最后在DNA连接酶的作用下 物与线性模板退火、延伸，最后在DNA连接酶的作用下。 合成突变链。 合成突变链。 有目的地扩增突变链：设计扩增引物(PCR5 (PCR5和 )， 3、有目的地扩增突变链：设计扩增引物(PCR5和PCR3 )， 使其3 端碱基分别与锚锭引物引入的突变碱基配对 端碱基分别与锚锭引物引入的突变碱基配对， 使其3’端碱基分别与锚锭引物引入的突变碱基配对，扩增 引物只能退火到突变链而不是亲本链， 引物只能退火到突变链而不是亲本链，所以只有突变链才 能扩增。 能扩增。
PCR诱变 PCR诱变
PCR诱变 PCR诱变
PCR定点诱变 （1）PCR定点诱变 几种碱基变化的PCR PCR引入 （2）几种碱基变化的PCR引入 （3）PCR随机诱变（易错PCR） PCR随机诱变 易错PCR 随机诱变（ PCR）
PCR定点诱变 一、PCR定点诱变
应用PCR原理，可以直接进行定点诱变， 应用PCR原理，可以直接进行定点诱变，并 PCR原理 且不需要采用噬菌体M13. 且不需要采用噬菌体M13. 首先，把需诱变的基因克隆于质粒上， 首先，把需诱变的基因克隆于质粒上，把 带有诱变目标基因的质粒，分成两个反应管， 带有诱变目标基因的质粒，分成两个反应管， 每个反应管加入不同的引物， 每个反应管加入不同的引物，每个反应管的 一对引物中， 一对引物中，有一个引物需按诱变意图改变 碱基，即该碱基是错配的， 碱基，即该碱基是错配的，每对引物的互补 位置不同， 位置不同，同一管中每条几乎处于同一起点 但放向相反。 但放向相反。
重叠延伸PCR (over1、重叠延伸PCR (over-lap extension PCR, OEOE-PCR ) 大引物PCR PCR法 2、大引物PCR法（megaprimer PCR ) 3、环状诱变 PCR 法 4、TAMS 定点诱变技术
重叠延伸PCR OE-PCR） 1、重叠延伸PCR （OE-PCR）
TAMS定点诱变技术 TAMS定点诱变技术
几种碱基变化的PCR PCR引Байду номын сангаас 二 几种碱基变化的PCR引入
首先，在诱变引物合成时， 首先，在诱变引物合成时，按设计使某位置发生 种核苷酸均有出现的可能。例如， 4种核苷酸均有出现的可能。例如，要合成一段含三个 的引物，只要在G原料中加入一定比例的A G的引物，只要在G原料中加入一定比例的A、C、T，那么 可以出现在G位置上含G 的产物。 可以出现在G位置上含G、A、T或C的产物。这段引物是 结合于基因上需要诱变的位置的。 PCR之前 之前， 结合于基因上需要诱变的位置的。在PCR之前，需把目标 目标基因或序列克隆于质粒， 目标基因或序列克隆于质粒，并使目标基因两端的质粒上 均有内切酶切点，以方便把克隆片段切出。 均有内切酶切点，以方便把克隆片段切出。
大引物PCR PCR法 2、大引物PCR法（megaprimer PCR )
先设置一个PCR反应产生一个含突变的DNA 先设置一个PCR反应产生一个含突变的DNA PCR反应产生一个含突变的 片段，然后再以此DNA DNA片段作为引物与原模板 片段，然后再以此DNA片段作为引物与原模板 退火进行PCR扩增得到含突变的完整的基因。 PCR扩增得到含突变的完整的基因 退火进行PCR扩增得到含突变的完整的基因。 因为作为引物使用的DNA DNA片段较通常的引物要 因为作为引物使用的DNA片段较通常的引物要 大许多甚至有上百碱基， 大许多甚至有上百碱基，所以命名为大引物 PCR法 PCR法。
PCR后 经PCR后，每个管产生了含有改变了特定碱基 的产物，但留有缺口。因此， 的产物，但留有缺口。因此，产物是线状的 DNA链 由于引物互补位置不同， DNA链，由于引物互补位置不同，两个管的产 物的缺口位置也不同， 物的缺口位置也不同，当把两个反应管的产 物混合，经变性和退火处理， 物混合，经变性和退火处理，来自不同反应 管的线状DNA链可杂交形成双链环状的DNA DNA链可杂交形成双链环状的DNA分 管的线状DNA链可杂交形成双链环状的DNA分 但仍有缺口。 子，但仍有缺口。由于环化分子可以转化大 肠埃希菌，在体内可把缺口修复， 肠埃希菌，在体内可把缺口修复，这样可以 获得定点改变了特低碱基的基因。 获得定点改变了特低碱基的基因。