动平衡毛细管电泳的研究进展

动平衡毛细管电泳的研究进展曾礼娜 夏之宁∗ 董志强 熊彩侨（重庆大学化学化工学院 重庆 400030）摘 要 动平衡毛细管电泳(KCE)是一种既能测定配受体间相互作用热力学参数、还可获得配受体间动力学参数的新方法。

本文对动平衡毛细管电泳的发展历史、作用模式和原理，以及动平衡毛细管电泳目前存在的一些问题进行了评述。

关键词 毛细管电泳动力学 结合速率常数 解离速率常数Research Advance of Kinetic Capillary ElectrophoresisZeng Lina, Xia Zhining*, Dong Zhiqiang, Xiong Caiqiao(College of Chemistry and Chemical Engineering, Chongqing University, Chongqing 400030)Abstract Kinetic capillary electrophoresis is a new method developed on the basis of affinity capillary electrophoresis; it is able to determine not only the thermodynamic but also the kinetic parameters of the interaction between target and ligand molecules. In this paper its history, mode, principle and even some problems are reviewed.Keywords Kinetic capillary electrophoresis, Association rate constant, Dissociation rate constant结合常数K b 是描述配体、受体分子间相互作用的最主要参数，配受体的正向结合速率常数k on 和反向解离速率常数k off 则可以表征配体、受体间结合的快慢。

这三个参数在生物学和药学中都具有十分重要的作用，其关系如式(1)和(2)所示。

动力学常数的研究可用于指导研究药物在体内药物代谢动力学和药物效应动力学的应用，还可用于指导判断药物起效的快慢、对机体作用的激烈程度以及如何创造有利条件使反应朝着高疗效低副作用的方向发展。

比如，药物与血清白蛋白结合的动力学常数可用于表征药物被血清白蛋白储存和转运的可能、快慢、强弱等。

式中，T 、L 和C 分别表示靶体、配体和结合物，K d 为解离常数。

在众多的研究分子间相互作用的技术中，亲和毛细管电泳法(affinity capillary electrophoresis, ACE)近年来得到快速的发展。

它是一种研究平衡条件下配受体间相互作用的毛细管电泳方法，在分子与胶束、抗原与抗体、冠醚等主体分子与客体分子、药物与蛋白质、药物与DNA 以及药物与RNA 等相互作用的研究中发挥了重要的作用[1~4]。

但ACE 的不足之处在于其只能测定结合常数K b ，而无法测得其它的诸如动力学常数k on 和k off 这样的我们国家自然科学基金项目(20375051，20775096)和科技部国际科技合作计划项目(2006DFA43520)资助 2007-12-06收稿，2008-01-17接受 T L + C k on k off doff on K k k K 1==（1）（2）更加关心的参数。

2002年， Krylov 等[5]在平衡态毛细管电泳的基础上，提出了一种新概念的毛细管电泳——非平衡态毛细管电泳。

在随后几年中，他们又对非平衡态毛细管电泳进行了完善，形成了一种具有多种操作方式的新的毛细管电泳方法——动平衡毛细管电泳(Kinetic capillary electrophoresis, KCE)[6]。

KCE 是在非平衡条件下对非共价结合的配、受体的亲和性进行表征，其要求相互作用的二者中必须有一个为生物大分子。

他们在KCE 的数学模型中引入了运行时间t 和距检测器的迁移距离x 这两个参量，使得KCE 对配受体作用的动力学研究成为可能。

KCE 可用于以下几个方面的研究：1)测定相互作用体系的结合常数K b 和正向结合速率常数k on 与反向的解离速率常数k off ；2)蛋白等生物分子的亲和定量分析；3)毛细管内温度的测定；4)热力学的亲和相互作用以及5)组合库中配体的筛选等[7~10]。

1动平衡毛细管电泳(KCE)的基本原理在KCE 运行过程中主要包含有两个步骤：1)靶体分子T 和配体分子L 首先进行亲和相互作用；2)通过电泳将T 、L 和结合物C 进行分离的步骤。

这两个步骤可通过以下三个偏微分方程来表示[6]：其中L 、T 和C 分别为配体分子L ，靶体分子T 和结合物C 的浓度，v L 、v T 和v C 分别为它们的电泳速度，t 是绝对迁移时间，x 是距离毛细管进样端的长度。

以上三个偏微分方程的求解依赖于毛细管电泳的初始和边界条件：初始时物质L 、T 和C 在毛细管中的分布、它们引入毛细管的方式及其在毛细管中的迁移。

2 KCE 的作用模式根据不同的初始条件和边界条件，可将KCE 分为以下七种作用模式(图1)[11]。

在以下的叙述中均假设T 的迁移速度大于L 的迁移速度。

（3） （4） （5）()()()()()()()()()()()()()()()x t T x t L k x t C k x x t C v t x t C x t C k x t T x t L k xx t T v t x t T x t C k x t T x t L k xx t L v t x t L on off C off on T off on L ,,,,,,,,,,,,,,,+−=∂∂+∂∂+−=∂∂+∂∂+−=∂∂+∂∂2.1 平衡混合之非平衡毛细管电泳(non-equilibrium capillary electrophoresis of equilibrium mixtures, NECEEM)NECEEM 是先将T 和L 混合孵化使其达到平衡后，以平衡混合物为样品，在充满运行缓冲液(Run buffer)的毛细管进样端压入一段样品区段，进行毛细管电泳。

由于平衡混合物中含有T 、L 和C 三种物质，且这三者具有不同的电泳淌度，当三者在电泳过程能够快速分离时，则假设T 和L 不再结合形成C 。

那么，在三者实现分离的同时，C 也会不断地解离。

因此，可测得T 、L 和C 的峰以及C 解离产生的T 和L 的“涂层”，如图2所示。

其中，T 和L 的峰与平衡状态下T 和L 的浓度相对应，而T 和L 的“涂层”曲线与k off 呈指数相关性。

因此，通过一次电泳过程，就可以获得足够的信息用于计算平衡结合常数K b 和C 的解离速率常数k off 。

且当孵化溶液与运行缓冲液的组成与温度相同时，可利用公式offb on k K k =计算k on 。

图1 动平衡毛细管电泳的七种作用模式的示意图Fig. 1 Schematic representation of initial and boundary conditions of seven modes of KCEEM 为平衡混合物，模式缩写的含意见下面正文DetectorKrylov 等建立了NECEEM 的数学计算模型[12]，并由式(6)和(7)计算了蛋白与DNA 的K b 、k on 和k off [5, 13]， []()()[]()1320321011A A A L A A A T K d ++−++= （6） T L off t A A A k ⋅⎟⎟⎠⎞⎜⎜⎝⎛+=232ln （7）式中A 1为游离的L 的峰面积，A 2为通过检测器时结合物L·T 的峰面积，A 3为结合物解离产生的L 的峰面积，t L 、t T 和t L·T 分别为L 、T 和L·T 的迁移时间，[T]0和[L]0分别为平衡混合体系中T 和L 的总浓度。

Krylov 采用了与蛋白没有相互作用的荧光素标记DNA ，由荧光检测方法，首先证明了C 与DNA 的荧光强度一致[14]。

在此基础上，以峰面积比代替浓度比，计算得到大肠杆菌蛋白(SSB)与DNA 的K b 、k on 和k off 分别为(3.6 ± 0.7)×106 L/mol 、(7.2± 3.6)×104 L/(mol·s)和(3.3 ± 1.6)×10-2 s -1，人凝血酶(Thr)与DNA 的K d 和k off 分别为(240±16)×10-9 mol/L 和(8.8±1.0)×10-3 s -1。

采用NECEEM 法可以在一次实验中对K b 、k on 和k off 进行求解，但是采用这种方法可能会存在以下两个问题：一是T 、L 、C 的分离存在一定的困难；二是结合物C 的浓度很低，可能无法测得。

当进行生物大分子与小分子间的相互作用时，由于T(一般是生物大分子)的分子量一般都非常大，而L 的分子量相对较小, 在1:1结合的情况下，T 和结合物C 在荷质比上的差异很小，表现在电泳淌度上的差异就很小，因此很难对T 和结合物C 进行分离。

另外，由于在平衡孵化的过程中，T 与L 的浓度一般都较小(微摩尔级)，因此结合物C 的浓度则更低，对其进行定量测定需要选择一种高灵敏度的检测方法。

2.2 扫集毛细管电泳(sweeping capillary electrophoresis, SweepCE)在NECEEM 的基础上，2004年Krylov 等提出了KCE 的另一种模式——SweepCE 。

SweepCE 是预先将毛细管内充满含有一定浓度L(即相互作用体系中电泳淌度较小的物质)的缓冲液，在进样杯中装入含有一定浓度T 的缓冲液，出口端装运行缓冲液，然后进行电泳。

由于T 的电泳淌度大于L ，所以电泳开始后，T 不断地进入毛细管而与毛细管中的L 发生相互作用形成结合物C 。

在这个过程中，由于L 物质灌满了整个毛细管，结合物C 的离解受到了很大的抑制，因此在这个过程中C 的离解可以忽略。

此法得到的电泳谱图中含有两个平台和一个电泳峰，其中两个平台分别与T 和L 相对应，电泳峰则是T 和L 形成的结合物C，通过谱图获得的信息可直接用于k on 的测定。

其具体的计算公式为：图2 NECEEM 的电泳示意图[12]Fig. 2 Schematic NECEEM electropherogram with experimental parameters used for quantitative measurements [12]()()()()11exp 1exp exp ,0000+−⎭⎬⎫⎩⎨⎧−⎟⎟⎠⎞⎜⎜⎝⎛−−++−⎭⎬⎫⎩⎨⎧−⎟⎟⎠⎞⎜⎜⎝⎛−−−−⎟⎟⎠⎞⎜⎜⎝⎛−−=t v x v v t v x L k t v x v v t v x T k t v x v v t v x L k L x t L L L T L on T L T T on L L T L on θθθ()()()()11exp 1exp exp ,0000+−⎭⎬⎫⎩⎨⎧−⎟⎟⎠⎞⎜⎜⎝⎛−−++−⎭⎬⎫⎩⎨⎧−⎟⎟⎠⎞⎜⎜⎝⎛−−−−⎟⎟⎠⎞⎜⎜⎝⎛−−=t v x v v t v x L k t v x v v t v x T k t v x v v t v x T k L x t T L L T L on T L T T on T L T T on θθθ()()()∫−−−−=tC C on d v x t T v x t L k x t C 0,,,τττττ ()⎩⎨⎧≥<=0100x x x L L θ 式中L 0，T 0分别为电泳前L ，T 的初始浓度。