细胞毒性试验MTT比色法及改进方法

参考文献
[1] 郝和平. 医疗器械生物评价标准实施指南[M] . 北京: 中国标准出版社, 2000: 10. [2]郑旭,王莉芳,陈芳,孙发展,罗晶.MTT法评价4 种医用材料的细胞毒性[J]. 西北药学杂志,2011,26(5):363-364. [3]范能全,彭兰.MTT法和XTT-PMS法测定细胞毒性的探讨[J].药物研 究,2005,14(7):28-29. [4]李红艳,夏启胜,徐梅,房青,徐波,陈志华,向青.MTT、MTS、WST-1在细 胞增殖检测中最佳实验条件的研究[J].中国康复医学杂 志,2005,20(11):824-826. [5]盛新华,卿三华,李镏洋.MTT、WST-8法测定细胞生长抑制率的结果比 较[J].山东医药,2006,46(6):20-21.
开始 预实验
细胞接种浓 度
药物浓度
时间控制
污染产生蓝 黑色
离心操作
浓度梯度
5%CO2, 37℃
血清干扰
调零孔与对 照孔
灭菌操作
细胞代数 <30
优质培养板Baidu Nhomakorabea
药品刺激性 大小
悬液均匀度
枪头注细胞 速度
上清液含结 晶物
影响评价结 果
。。。。。。
。。。。。。
翻板
贴壁牢固程 度
MTT改进
XTT
MTS
CCK-8/ WST-8
MTT比色试验
----四甲基偶氮唑盐微量酶反应色法
MTT：为黄色化合物,是一种能接收氢原子的染料，其化学名 为3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐，商品名噻唑 蓝。[2]
活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性的MTT还原为 难溶性的蓝紫色结晶物甲臜(Formazan)，并沉积在细胞中， 而死细胞无此功能。 在一定细胞数范围内，MTT结晶物形成的量与细胞数成正 比。
利用体外细胞培养方法来评价生物材 料和医疗器材或浸提液可滤出成分中 潜在的细胞毒性
生物学评价体系中最重要的检测指标 之一, 几乎是各种医疗器械和医用材 料临床应用前的必选项目.[1]
染料排除法（台盼蓝、伊红Y、苯胺黑） 克隆形成试验 四唑盐（MTT）和Alamar Blue比色试验 三磷酸腺苷（ATP）发光试验 细胞蛋白质含量测定法
基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐。[5]
原理
它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪 硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS） 的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲臜 产物。生成的甲臜物的数量与活细胞的数量成正比。用酶联免疫检测 仪在450nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。
96孔板
酶标仪
优点
▪灵敏度较传统计数法高 ▪经济
缺点
▪甲臜产物不溶于水，需溶解检测 ▪MTT反应需至少3小时，不适用急性反应
选择适当的细胞接种浓度、药物浓度 设调零孔和对照孔
注事 意项
MTT对菌敏感，应尽量无菌操作 避免血清干扰 现配现用，低温避光，以免分解
需要进一步查阅的操作细节 ---多看文献
原 理
优点
1、使用方便， 省去了洗涤细 胞 2、检测快速 3、灵敏度高， 甚至可以测定 较低细胞密度 4、重复性优于 MTT。
缺点
XTT水溶液不 稳定，需要低 温保存或现配 现用。
MTS
：3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)2H-tetrazolium [4]
purple color
主要步骤
制备细胞悬液，接种、培养细胞 MTT染色：培养一段时间后，向细胞中加入 MTT溶液，继续在37℃孵育4 h。然后除去培 养液，加二甲基亚砜(DMSO)或盐酸-异丙醇溶 解细胞中的紫色结晶物。 比色：酶联免疫监测仪在490或570nm处测 定溶液的吸光值OD(optical density)。
新合成的四唑氮衍生物，与MTT属于同类物质
原理
其原理与XTT类似，能被活细胞中线粒体脱氢酶降解而产 生棕黄色水溶性的甲臜，能直接通过光谱吸收测定OD值， 进而推测细胞的增殖情况，当与电子偶合剂PMS联用是， 能增强MTS的还原反应，提高反应的灵敏性。
优 点
其优点与XTT相同
缺 点
试剂比较贵
CCK-8/WST-8:CCK-8试剂中含有WST–8：化学名：2-(2-甲氧基-4-硝
优点
缺点
1、使用方便，省去了洗 涤细胞，不需要放射性同 位素和有机溶剂； 2、检测快速； 3、灵敏度高，甚至可以 测定较低细胞密度； 4、重复性优于MTT； 5、对细胞毒性小； 6、为1瓶溶液，毋需预制， 即开即用。
1、价格比较贵。 2、CCK-8试剂的颜色为 淡红色，与含酚红的培养 基颜色接近，不注意的话 容易产生漏加或多加。
XTT:与MTT类似，一种四唑氮的衍生物。化学名：2,3- bis(2methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)carbonyl]-2Htetrazolium hydroxide[3]
作为线粒体脱氢酶的作用底物，被活细胞还原成水溶性的 橙黄色甲臜产物。当XTT与电子偶合剂（例如phenazine methosulfate，PMS）联合应用时，其所产生的水溶性的甲 臢产物的吸光度与活细胞的数量成正比。