亚麻籽中转基因成分检测实时荧光PCR法编制说明

《亚麻籽中转基因成分检测实时荧光PCR法》
编制说明
一、任务来源
根据国家认证认可监督管理委员会2010年下达的标准编写任务通知(计划编号：2010B323k)，由辽宁出入境检验检疫局主持制定。

二、意义
亚麻籽是世界上重要的油料作物之一，富含多量不饱和，这些脂肪酸可以加速，提高能力，分解，平衡血压，以及压抑制和增长等多种功效。

以、、和为主的西方，对亚麻子作为功能的研究和开发作了大量的工作，亚麻籽也作为辅料添加在谷物早餐、面包、混合坚果和快餐食品中。

1996年加拿大萨克斯其万大学培育了一种具有抗除草剂性状的转基因亚麻籽FP967品系，又称为CDC Triffid 转基因亚麻籽。

后来被除名并规定永久不得商业化耕种，FP967品系转基因亚麻籽可以说是世界上独一无二的转基因亚麻籽。

2009年，非法转基因亚麻籽在欧洲23国以及韩国、斯里兰卡、新加坡、泰国等28个国家发现，谷物、面包等产品若发现受污染都会下架。

面对生物基因工程技术对我国经济利益带来的冲击和国外转基因产品对生态环境和消费者可能带来的风险，对转基因亚麻籽进行检测具有重要的现实意义。

三、制标依据和研究过程
本标准的编制工作引用和参考了GB/《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》的要求进行编写。

此外，参考了国内外相关文献，主要有：
1. GB/T 标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写规则
2. NOST-Spec construct-specific method for the detection of CDC triffid flax (Event FP967) using real-time PCR, EU-CRL.
标准研制过程中，在方法的特异性、灵敏度等方面做了大量实验，并对所建立的标准方法进行了应用研究。

本标准经过验证实验，证明切实可行。

本标准检验方法是在以上研究、验证和鉴定的基础上进行起草的。

四、FP967品系转基因亚麻籽品系介绍和检测引物的来源
1. FP967品系转基因亚麻籽
FP967品系转基因亚麻籽，又称为CDC Triffid 转基因亚麻籽。

由加拿大萨克斯其万大学所培
育，后来被除名并规定永久不得商业化耕种的亚麻品种，可以说是世界上独一无二的转基因亚麻籽。

2．检测引物的来源
FP967品系转基因亚麻籽通过农杆菌介导转化获得，具有抗除草剂性状。

其中als基因源自抗氯乙酰胺的拟南芥品系；neo基因源自K12且受农秆菌nos启动子调控；nos基因源自农秆菌且受农秆菌nos启动子的调控；bla基因受细菌启动子的调控。

FP967品系转基因亚麻籽的检测引物来源于 NOST-Spec construct-specific method for the detection of CDC triffid flax (Event FP967) using real-time PCR, EU-CRL.
五、FP967品系转基因亚麻籽检测引物和探针的试验结果
1. 阳性参照
采用质粒合成的方法，合成了一个同时包含77bp SAD基因和95bp NOST-Spec基因的质粒“FlaxGM”。

两个片段同时出现在同一拷贝中。

这一质粒同时用于检测内参基因SAD和GM目标基因NOST-Spec的扩增效果。

2. 实时PCR特异性与灵敏度检测结果
内源基因检测引物和探针的实用性
采用SAD (内源基因) 检测引物和探针，选取亚麻籽、小麦、大麦、大米、油菜籽、大豆、玉米、棉花等8种样品，验证亚麻籽内源检测引物和探针的特异性，并验证上述8种样品DNA提取的质量。

检测结果如图1所示。

由图1可见，本标准中SAD(内源基因) 检测引物和探针适合于对亚麻籽内源基因的检测。

图1 内源基因SAD检测引物和探针的实用性检测结果
检测引物和探针的实用性
采用NOST-Spec检测引物和探针，选取转基因亚麻籽FP967合成质粒、非转基因亚麻籽、玉米DBT418、Bt176、Bt11、GA21、DLL25、CBH351、T14、MON810、NK603、TC1507、MON863、59122、MON88017、MIR604、大豆Mon40-3-2、Monday9788、油菜籽MonGT73、HCN92、Oxy-235、Laureate23-198、MS8ⅹRF3、MS1ⅹRF1、MS1ⅹRF2、T45、棉花Mon1445、Mon531、BXN、马铃薯RBMT21-129、紫花苜蓿J101、J163、夏南瓜ZW20等33种样品，验证上述检测引物和探针的实用性。

每对引物和探针重复检测两次，检测结果如图2所示，只有FP967品系转基因亚麻籽合成质粒出现了很好的阳性增幅曲线。

其余物种样品，包括非转基因亚麻籽样品均未出现扩增曲线。

结果表明：上述检测引物和探针适合于对FP967品系转基因亚麻籽NOST-Spec基因的检测。

图2 NOST-Spec测引物和探针的实用性检测结果
实时PCR灵敏度检测结果
对FP967阳性样品的灵敏度检测结果
将合成质粒FlaxGM稀释至40拷贝/反应、20拷贝/反应、10拷贝/反应、5拷贝/反应，每个稀释度重复10次。

验证上述检测引物和探针的灵敏性。

检测结果如图所示。

由图3可见，实时PCR检测FP967阳性样品的灵敏度可以达到>5拷贝/反应。

图3 灵敏度测试结果
七、标准征求意见情况
本标准从认监委标准化管理系统中发出15家单位征求意见，有？？？家单位反馈了意见。

所有意见全部接受，并按照意见进行了修改。

八、标准验证情况
本标准由3家单位：深圳出入境检验检疫局、吉林出入境检验检疫局、黑龙江出入境检验检疫局，针对标准的内容进行了验证试验。

结果表明：该方法可实现对FP967品系转基因亚麻籽成分的定性检测。

参考文献
1. NOST-Spec construct-specific method for the detection of CDC triffid flax (Event FP967) using real-time PCR, EU-CRL.。