亚麻籽中转基因成分检测实时荧光PCR法编制说明
【检验】植物及其加工产品中转基因成分实时荧光PCR定性检验方法编制说明
对外源基因检测阳性的样品，或已知为转基因阳性的样品，如需进一步进行品系筛查和确证，则采用品系特异性普通PCR或实时荧光PCR，特异性扩增上述品系特异性片段，根据PCR扩增结果（电泳图或实时荧光扩增曲线），判定该样品中含有哪（些）种转基因油菜品系成分。
2.2与国内外相关标准、文献的关系
引用国际国内已发布的权威标准方法，属于标准等同采用。
3编制过程
3.1准备阶段（可选项）
3.2分工情况
中国检科院负责标准总体方案设计及标准草案，山东出入境检验检疫局负责转基因产品通用元件检测方法的收集，上海出入境检验检疫局负责转基因品系检测方法的收集，分工协作，保证了该标准的顺利完成。
CTAB：cetyltrithylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵。
dATP：deoxyadenosine triphosphate，脱氧腺苷三磷酸。
dCTP：deoxycytidine triphosphate，脱氧胞苷三磷酸。
dGTP：deoxyguanosine triphosphate，脱氧鸟苷三磷酸。
SDS：sod
Taq：TaqDNApolymerase，DNA聚合酶。
TE：Tris-HCl、EDTA缓冲液。
tNOS：terminator of nopaline synthase gene fromAgrobacterium tumefaciens，来源于农杆菌的胭脂碱合成酶基因终止子。
GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测
实时荧光PCR定性检测
实时荧光PCR定性检测1．引物和探针大豆及其加工产品中转基因成分实时荧光PCR检测所用引物和探针序列。
2．实时荧光PCR反应体系实时荧光PCR反应体系见表11—16，反应体系中各试剂的用量，可按照详细状况或不同的反应总体积举行适当的调节。
每个反应体系应设置两个平行测试。
3．实时荧光反应参数实时荧光定量PCR的反应参数为：37℃，5min；预变性，95℃，3min；95℃，15s，60℃，1min，40个循环。
不同仪器可按照仪器要求将反应参数作适当调节。
4．实时荧光．PCR结果分析 (1)阈值设定实时荧光PCR反应结束后，应设置荧光信号阈值，普通挑选3～15个循环的阴性对比的10倍标准差作为阈值。
阈值设定原则按照仪器噪声状况举行调节，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点，且Ct值＝40为准。
(2)实时荧光PCR定性检验的质量控制空白对比：外源基因检测Ct值大于或等于40，内参照基因检测Ct值大于或等于40。
阴性对比：外源基因检测Ct值大于或等于40，内参照基因检测Ct值在20～30。
阳性对比：外源基因检测Ct值小于或等于34。
上述指标有一项不符合者，应重新做实时荧光PCR扩增。
(3)实时荧光PCR结果判定测试样品外源基因检测Ct值大于或等于40，内参照基因检测Ct值20～30者，阴性对比、阳性对比和空白对比结果正常者，则可判定该样品未检出转基因成分。
测试样品外源基因检测Ct值小于或等于36．内参照基因检测Ct值20～30者，阴性对比、阳性对比和空白对比结果正常者，则可判定该样品检出转基因成分。
测试样外源基因检测Ct值在36～40，应重做实时荧光PCR。
再次扩增后的外源基因Ct值仍小于40，且阴性对比、阳性对比和空白对比结果正常，则可判定为该样品检出转基因成分。
再次扩增后的外源基因Ct值大于或等于40，且阴性对比、阳性对比和空白对比结果正常，则可判定为该样品未检出转基因成分。
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实时荧光定量PCR技术在粮油转基因成分检测中的应用
粮油食品科技 第 21 卷 2013 年 第 2 期
除草剂基因 EPSPS 或抗虫基因 CrylA （ b ） 等转基因 成分， 以确定是否为转基因作物。 目前， 中华人民共和国农业行业标准和中华人 民共和国出入境检验检疫行业标准中已公示相关转 便于粮 基因作物所需检测的内源基因和外源基因 ， 油质检机构借鉴并开展转基因项目的检测工作 。实 时荧光定量 PCR 自建立以来， 发展非常迅速。 已用 于食品卫生检测领域。 随着实时荧光定量 PCR 的 不断完善， 该技术将在粮油质量安全领域得到更广 泛的应用。
收稿日期： 2012 － 05 － 16 1984 年出生， 作者简介： 许安君， 男， 江苏镇江人， 质检主管．
统的定性 PCR （ 聚合酶链式反应 ） 因其在转基因检 测中的高敏感性差易造成假阳性现象， 以及操作误 差和一些反应抑制因素带来的假阴性现象 ， 使其已 经不能符合当前检测的要求。 随着技术的发展， 实 实时荧光定 时荧光定量 PCR 技术的研发不断成熟， 而且 量 PCR 技术不仅实现了对 DNA 模板的定量， 具有灵敏度高、 特异性和可靠性更强、 能实现多重反 应、 自动化程度高、 无污染性、 具有实时性和准确性 等特点。
［3 ］ ［2］ ［2］
，
对未知模板进行定量分析的
紫外灯， 灯与地面距离不宜超过 2． 0 ± 0． 1 m。 （ 2 ） 实验室工作区域的设置和要求 （ a） 试剂制备区 该实验区主要进行的操作为贮存试剂的制备、 试剂的分装和主反应混合液的制备 。试剂原材料必 须贮存在本区内， 并在本区内制备成所需的贮存试 本区并没有严格的要求。 剂。对与气流压力的控制， （ b） 样品处理区 该区域主要进行的操作为样品核酸提取 、 贮存， 扩增混合液制备。 本区的压力梯度要求为： 相对于 邻近区域为正压， 以避免从邻近区进入本区的气溶 由于在加样操作中可能会发生气溶 胶污染。另外， 瑩 瑔
转基因植物NOS基因核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)说明书
转基因植物NOS基因核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)说明书转基因植物NOS基因核酸检测试剂盒(PCR荧光探针法)说明书试剂盒简介货为了适应新加坡石斑鱼虹彩病毒染料法荧光定量PCR试剂盒快速检测和疫病研究的需要，本公司参照 OIE国际标准中规定的引物序列，经多次实验及系统优化，开发生产了本试剂盒。
应用本试剂盒进行检测具有快速、灵敏、特异、准确、安全操作简单、应用广泛和高通量检测等特点及优点。
试剂盒组成及试剂配制：酶联板（Assay plate）：一块（96孔）。
2.标准品（Standard）：2瓶（冻干品）。
3.样品稀释液（Sample Diluent）：1×20ml/瓶4.生物su标记抗体稀释液（Biotinantibody Diluent）：1×10ml/瓶。
5.辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液（HRPavidin Diluent）：1×10ml/瓶。
6.生物su标记抗体（Biotinantibody）：1×120μl/瓶（1：100）7.辣根过氧化物酶标记亲和素（HRPavidin）：1×120μl/瓶（1：100）8.底物溶液（TMB Substrate）：1×10ml/瓶。
9.浓洗涤液（Wash Buffer）：1×20ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。
10.终止液（Stop Solution）：1×10ml/瓶（2N H2SO4）。
样本处理及要求：1.血清：全血标本请于室温放置2小时或4℃过夜后于1000g离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于20℃或80℃保存，但应避免反复冻融。
2. 血浆：可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30分钟内于2 8°C 1000g离心20分钟，或将标本放于20℃或80℃保存，但应避免反复冻融。
3. 组织匀浆：用预冷的PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液（匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果），称重后将组织剪碎。
转基因成分PCR定性检测技术ppt课件
转基因成分PCR定性检测技术
转基因成分PCR定性检测技术
• 电泳及分析
1、琼脂糖凝胶电泳 2、结果分析 3、异常情况分析
转基因成分PCR定性检测技术
1、琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖凝胶电泳是一种非常简便、快速、最常用的分离纯 化和鉴定核酸的方法。 1）琼脂糖：
根据琼脂糖溶解温度，把琼脂糖分为一般琼脂糖和低熔点 琼脂糖。低熔点琼脂糖熔点为62～65℃，溶解后在37℃下维持 液体状态约数小时，主要用于DNA片段的回收，质粒与外源性 DNA的快速连接等。
Terminator
转基因作物现状
• 转基因作物现状
转基因作物的研究最早始于20世纪八十年代，1983年全球第一例 转基因植物在美国问世，1987被允许进入田间鉴定试验，1992年开始 大田产量试验，1995年完成安全性评价研究，1996年在美国最早开始 商业化生产，当年种植面积174万公顷。
据“农业生物技术应用国际服务组织（ISAAA）”2011年3月7日发 布的年度报告称：2010年，共有29个国家种植了1.48亿公顷转基因作 物；1996年到2010年，全球转基因作物累计种植面积超过10亿公顷。
转基因成分PCR定性检测技术
2）凝胶浓度选择：
琼脂糖凝胶的浓度与DNA分离范围
琼脂糖浓度(%) 0.3 0.6
0.7 0.9 1.2 1.5 2.0
线型DNA分子的分离范围(Kb)
5～60 1～20
0.8～10 0.5～7 0.9～6 0.2～3 0.1～2
转基因成分PCR定性检测技术
3）电泳缓冲液
•转基因生物
是指遗传物质基因被改变的生物，其基因改变的方式是 通过转基因技术，而不是以自然增殖或自然重组的方式产生。 简称：GMOs
食品中转基因成分的检测方法与限量标准研究
食品中转基因成分的检测方法与限量标准研究引言：随着人们对食品安全的关注度不断提高，转基因食品备受争议。
为了保护消费者权益，监管部门一直致力于开发食品中转基因成分的检测方法，并制定相应的限量标准。
本文将对现有的检测方法及限量标准进行研究。
一、食品中转基因成分检测方法1. PCR检测方法PCR（聚合酶链式反应）是一种常用的检测转基因成分的方法。
通过匹配转基因重要基因的DNA序列，PCR可以检测到极低浓度的转基因成分。
然而，由于PCR方法对样品的处理过程较为繁琐，且存在较高的假阳性率，因此在实际应用中需要进一步改进。
2. 实时荧光PCR检测方法实时荧光PCR是基于PCR技术的一种改进方法。
它可以实时监测PCR过程中的荧光信号，准确判断转基因成分的存在与否。
相比传统PCR方法，实时荧光PCR具有高灵敏度和高特异性的优势，然而其设备和试剂的成本较高，限制了其在实际应用中的推广。
3. 基因测序方法基因测序方法是一种直接检测转基因成分的手段。
通过对食品中所有DNA序列的测序，可以准确判断是否存在转基因成分。
基因测序方法在理论上能够提供最准确的结果，但由于其高昂的费用和时间成本，目前在大规模应用中还存在一定的困难。
二、食品中转基因成分的限量标准1. 限量标准的制定依据食品中转基因成分的限量标准制定依据包括食品安全评估、转基因成分检测方法的可行性和社会公众意见等。
在制定限量标准时，应综合考虑科学研究和实际情况，确保转基因食品不会对人体健康产生不良影响。
2. 不同国家的限量标准差异不同国家对转基因成分的限量标准存在一定的差异。
例如，欧盟规定，食品中转基因成分的含量超过0.9%时，必须标示出来。
而美国则没有明确的限量标准，而是采取了一种“合理衡量”的方式，需要食品生产者自行决定是否标识转基因成分。
3. 限量标准的争议与改进转基因食品的限量标准一直备受争议。
一方面，部分人认为限量标准过于宽松，难以真正保护消费者权益；另一方面，也有人认为限量标准过于严苛，对农业发展造成不利影响。
实时荧光定量PCR技术在转基因检测中的应用_敖金霞
实时荧光定量PCR 技术在转基因检测中的应用收稿日期：2008-03-05基金项目：东北农业大学创新团队项目（CXT004-3-2）作者简介：敖金霞（1977-），女，黑龙江人，博士研究生，助研，主要从事转基因作物基因检测技术方面研究。
*通讯作者：教授，博士生导师，E-mail:gaoxj5390@敖金霞1，高学军1*，仇有文1，郭士成2（1．东北农业大学生命科学与生物技术研究中心，农业部转基因生物产品成分监督检测测试中心，哈尔滨150030；2．东北农业大学生命科学学院，哈尔滨150030）摘要：实时荧光定量PCR 技术是一种新型的核酸定性、定量检测、分析技术。
随着转基因产品大规模商业化，转基因生物的环境安全和食用安全性问题引起了全球范围内广泛的争论和关注。
实时监测、定量准确、灵敏度高、反应速度快、重复性好及PCR 反应后不需电泳检测等优点，使RQ-PCR 逐步成为转基因检测的重要工具。
关键词：实时荧光定量PCR ；Taq Man 探针法；SYBR Green I 染料法；转基因检测中图分类号：TS207.3文献标识码：A随着有关转基因成分标签法的建立和对于转基因食品的重视程度及量化要求的提高，定性PCR 因其在转基因检测中的高敏感性差易造成假阳性现象，以及操作误差和一些反应抑制因素带来的假阴性现象，使其已经不能再满足人们的需要。
在这种基础之上实时荧光定量PCR（Real-time quantitative polymerase chain reaction ，RQ-PCR ）发展起来，RQ-PCR 技术不仅实现了对DNA 模板的定量，而且具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性、具实时性和准确性等特点。
目前实时荧光定量PCR 已广泛应用于分子生物学、农业、医学等学科的应用和基础研究领域，并已经在转基因检测中发挥了不可替代的作用[1-2]。
1R Q -PC R 的基本原理实时荧光定量PCR 技术是指在PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监测整个PCR 进程，最后通过标准曲线，对待测样品中的未知模板进行定量分析的方法。
食用油脂中转基因植物成分实时荧光PCR定性检测方法(三)
食用油脂中转基因植物成分实时荧光PCR定性检测方法（三）实时荧光PCR反应体系见表2。
表2 实时荧光 PCR反应体系 7.5.2 实时荧光PCR反应参数实时荧光PCR反应参数见表3。
用法不同实时荧光PCR仪，可对参数作适当调节。
表3 实时荧光PCR反应参数 7.5.3 仪器检测通道的挑选设置PCR反应管荧光信号收集条件，应与探针标志的报告基团全都。
详细设置办法可参照仪器用法解释书。
7.6 结果分析、推断和表述 7.6.1 基线和闭值的设置实时荧光PCR反应结束并分析结果时，应设置基线和闽值。
基线范围设置在3个～15个循环。
基线闭值设置在基线刚好超过正常阴性目标DNA对比扩增曲线最高点且Ct=40，通常状况下可以采纳仪器默认的基线阂值，即采纳3个～15个循环的阴性目标DNA对比的10倍标准差作为阈值。
7.6.2 质量控制7.6.2.1 平行样品的设置每个样品举行实时荧光PCR检测时应设置起码2个平行。
7.6.2.2 对比设置实时荧光PCR检测过程中应设置PCR 扩增试剂对比、PCR扩增阴性目标DNA对比、PCR扩增阳性目标DNA对比，并对DNA提取和纯化过程中设置的核酸提取空白对比同时举行实时荧光PCR检测，详细方式根据GB/T 19495.2中相关规定。
试验中设置的各种对比PCR检测结果应符合7.6.2.3～7.6.2.5。
否则，任一种对比假如浮现非下述正常结果，应重做试验。
7.6.2.3 核酸提取空白对比和PCR扩增试剂空白对比外源基因检测结果Ct≥40，内源基因检测结果Ct≥40。
7.6.2.4 PCR扩增阴性目标DNA对比外源基因检测结果Ct≥40，内源基因检测结果20≤Ct≤36。
7.6.2.5 PCR扩增阳性目标DNA对比外源基因检测结果Ct≤36。
7.7 结果推断和表述7.7.1 待测样品外源基因2个平行样检测结果Ct≥40，内源基因检测20≤Ct≤36并浮现典型的扩增曲线，同时各种试验对比结果正常，此时可以判定该样品未检出xxx基因，结果表述为未检出xxx基因。
实时荧光定量PCR技术检测转基因大豆方法的建立 (1)
测内源特异参照基因 (内源基因) ,可以判定
DNA 是否被提取出来 ,或所提 DNA 是否适
合于进行 PCR 扩增 ,从而可以避免检测结果
的假阴性 。因此 ,对大豆内源基因 Lectin[5 ]
的检测即是对被检测样品 DNA 提取质量的
检测 。
本研究通过采用特异引物首先对转基因
大豆中的内源基因进行了定性 PCR 检测 ,以 确定所提取的 DNA 是否适合于 PCR 扩增 。 PCR 电泳显示 :转基因成分含量分别为 5 %、 2 %、1 %、015 %、011 %、0 %的转基因大豆 ,均 扩增出了 118 bp 片断 (电泳结果未显示) ,该 结果表明 ,所提取的 DNA 数量和质量均适 合于 PCR 扩增 。 212 标准曲线的建立
2 结果与分析
Y = - 31176 X + 261006 , 相 关 系 数 R2 为 01991 。这样 ,将待测样品扩增得到的 Ct 值
211 大豆内源 Lectin 基因定性
( Y 值) 代入公式 ,即可得到待测样品的转基
提取出一定数量的高质量 DNA 是进行 因成分的百分含量 。
转基因成分 PCR 检测的前提条件 。通过检
015 %、011 %、0 % 的 转 基 因 大 豆 Roundup
大豆内源基因 Lectin 检测的引物如表 1
Ready 标准品购自 Fluka 公司 ( Fluka ,Buchs , 所示 ,反应在 50μL 的反应体系中进行 ,其中
Switzerland) 。
PCR 反应缓冲液 5μL , 脱氧核苷酸三磷酸
66
Ready 转 基 因 大 豆 标 准 品 ( 5 %、2 %、1 %、 015 %、011 %、0 %) 的测定 ,计算机自动生成 标准曲线 ,纵坐标为临界循环值 Ct ,横坐标 为百分含量 。根据标准曲线所得的线性计算 公式 ,将样品的 Ct 值代入公式 ,即可得到待 测样品的转基因成分的百分含量 。 1121412 检测低限的测定
实时荧光定量PCR方法快速检测转基因大豆
实时荧光定量PCR方法快速检测转基因大豆朱德斌;邢晓波【摘要】A real-time fluorescence quantitative PCR method was developed to detect genetically modified ( GM ) soybean using SYBR Green I,a double-stranded DNA-selective fluorescent dye. Special primers were used to amplify 35S promoter that was often used in GM soybeans. The fluorescence of SYBR Green I was used to monitor the quantity of PCR product. The results show that the detection limit for 35S promoter is 0. 005 nmol/L and the linear range is more than three orders of magnitude. The GM soybean and the non-GM soybean can be clearly discriminated. Thus, the method may become a convenient tool for daily GM food detection due to its rapidness, simplicity, sensitivity, safety, high throughput and low cost.%针对转基因大豆中普遍含有的35S启动子进行引物设计,以双链DNA染料SYBR Green Ⅰ为荧光标记物,利用实时荧光定量PCR方法对大豆样品进行检测.该法检测转基因大豆的检测低限为0.005 nmol/L的35S启动子,线性范围达3个数量级,可快速区分转基因大豆和非转基因大豆,具有快速、简便、灵敏、安全、高通量、低成本等优点,可推广用于转基因植物产品的快速定量检测.【期刊名称】《激光生物学报》【年(卷),期】2012(021)003【总页数】4页(P279-282)【关键词】实时荧光定量PCR;转基因大豆;35S启动子【作者】朱德斌;邢晓波【作者单位】华南师范大学生物光子学研究院激光生命科学研究所、暨激光生命科学教育部重点实验室,广东广州510631;华南师范大学生物光子学研究院激光生命科学研究所、暨激光生命科学教育部重点实验室,广东广州510631【正文语种】中文【中图分类】Q503;Q78随着近年来人们对转基因产品(genetically modified organism，GMO)安全性的日益重视，GMO标识已成为各国GMO监管的重要部分。
调味品中转基因植物成分实时荧光PCR定性检测方法(一)
调味品中转基因植物成分实时荧光PCR定性检测方法（一）本标准规定了调味品中转基因植物成分实时荧光PCR定性检测办法。
本标准适用于以玉米、大豆、油菜籽、马铃薯、大米、番茄等农产品及其加工产品为原料生产的调味品中转基因植物成分的实时荧光PCR定性检测。
本标准适用的调味品根据GB丁20903，分为酱类、豆豉、腐乳、蚝油、香辛料和香辛料调味品、复合调味料、火锅调料，详细包括豆酱、面酱、番茄酱、辣椒酱、芝麻酱、花生酱、芥未酱．豆豉．腐乳，蚝油，香辛料、香辛料调味粉，鸡精调味料、鸡粉调味料、牛肉粉调味料、海鲜调味料，风味酱、沙拉酱、蛋黄酱，火锅底料、火锅蘸料等。
其他调味品参照用法。
2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不行少的。
凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。
凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括全部的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682 分析试验室用水规格和实验办法 GB/T 19495.2 转基因产品检测试验室技术要求 GB/T19195.3 转基因产品检测核酸提取纯化办法 GB/T 19495.7 转基因产品检测抽样和制样办法 GB/T 20903 调味品分类 GB/T 27025 检测和校准试验室能力的通用要求 SN/T 1204 植物及其加工产品中转基因成分实时荧光PCR定性检验办法 3 术语、定义和缩略语 3.1 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。
3.1.1 调味品condiment 在饮食、烹饪和食品加工中广泛应用的，用于调和味道和蔼味并具有去腥、除擅、解腻、增香、增鲜等作用的产品。
3.1.2 DNA的提取和纯化DNA extraction and purification 从测试样品的各种成分中释放DNA，随后纯化DNA去除PCR反应抑制剂。
3.1.3 外源基因exogenous gene 利用生物工程技术转入的其他生物基因，使该生物品种表现新的生物学性状。
抗除草剂转基因作物实时荧光定量PCR检测
应用与环境生物学报 2009，15 ( 6 ): 866~870Chin J Appl Environ Biol=ISSN 1006-687X2009-12-25DOI: 10.3724/SP.J.1145.2009.00866随着转基因技术的日趋成熟，各种转基因农作物由实验室走向环境释放，其中不少农作物已进行商品化生产，且种植面积急剧扩大. 根据国际农业生物技术应用咨询服务中心（ISAAA ）2007年的报告，95%的转基因农作物集中在大豆、玉米、棉花和油菜籽4种植物上，抗各种杂草和抗虫害的两个转基因类型占主导地位. 由此带来的转基因生物及产品的安全性问题已经成为人们讨论的热点问题. 世界多数国家和国际组织的普遍做法是对转基因产品实施标识管理，大部分实施转基因产品标识管理政策的国家都规定了各自不同的标识阈值. 例如：欧盟（2002）规定转基因产品成分高于0.9%，巴西为4%，澳大利亚和新西兰为1%，俄罗斯、中国香港和中国台湾地区都为5%时，就必须进行标识. 我国2001年颁布实施《农业转基因生物安全管理条例》，其中第四章第二十八条明确规定，在中华人民共和国境内销售列入农业转基因生物标识目录的农业转基因生物，应当有明显的标识. 因此，为转基因产品实施标签制度的定量检测技术显得尤为重要.近年来，对转基因生物产品进行定量分析的主要方法是荧光定量PCR 技术. 由于该技术不仅实现了PCR 从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR 相比，具有特异性强和灵敏度高的特点，避免了PCR 产物进行后期处理，克服了以往PCR 技术中存在的假阳性污染和不能进行准确定量的缺点[1]，极大地提高了检测速度和自动化程度. 荧光定量PCR 技术是指在普通PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累监测整个PCR 反应的进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量的方法. 荧光定量PCR 的荧光基团包括探针类和染料类两种. 本文所用染料类如SYBR Green I 是一种非饱和菁类荧光素，利用与双链DNA 小沟结合发光的理化特征指示扩增产物的增加，其处于游离状态时，检测不到荧光信号，当结合dsDNA 后荧光强度明显增强，即被荧光探测系统检测到，荧光强度的增加与初始模板量相关. 目前实时荧光定量PCR 中抗除草剂转基因作物实时荧光定量PCR 检测*王恒波 陈如凯 陈平华**（福建农林大学农业部甘蔗遗传改良重点开放实验室 福州 350002）Detection of Genetically Modi fi ed Herbicide–tolerant Crops by Real-timeFluorescent Quantitative PCR Assay*WANG Hengbo, CHEN Rukai & CHEN Pinghua **(Key Laboratory of Genetic Improvement for Sugarcane, Ministry of Agriculture, Sugarcane Research Institute ofFujian Agriculture and Forestry University , Fuzhou 350002, China )Abstract A rapid and sensitive SYBR Green I-based real-time PCR method was developed for quantitative detection of CP4-EPSPS and PAT genes from the genetically modi fi ed (GM) herbicide-tolerant crops. The target genes from transgenic soybean and maize references were ampli fi ed to make standard curves. The transgenic ratios were then calculated according to the standard C t -copies linear graphs of these two genes. The reproducibility and melting curves of the genes were also analyzed. The results showed that the standard equations of CP4-EPSPS and PAT genes had higher R 2 values of 0.993 9 and 0.992 4, respectively. The difference in transgenic ratios between the known standards and measured crops was only 6.52%~7.90%. These results suggest that the real-time PCR assay with SYBR Green I dye is suitable for detecting the ratios of GM crops and their derivates. Fig 5, Tab 2, Ref 11 Keywords genetically modi fi ed herbicide-tolerant crop; SYBR Green I dye; real-time fl uorescent quantitative PCR; meltingcurve; detection CLC Q943.2摘 要 建立了一种以SYBR Green I 为结合染料、快速准确检测转抗除草剂基因成分的实时荧光定量PCR 方法. 以转基因大豆与转基因玉米标准品为材料，通过使用特异性引物和SYBR Green I 结合染料实时荧光定量PCR 技术，对转基因农作物中外源抗除草剂基因进行了定量检测，绘制了两种基因扩增的标准曲线图，根据标准曲线方程计算外源基因含量；并作了溶解曲线、检测方法检测灵敏度和精密度的分析. 研究发现，两者标准曲线方程线性关系良好，R 2值分别达到0.993 9与0.992 4. 通过已知标准品进行验证，实测值与真值接近，与实际含量的相对偏差是6.52%和7.90%. 结果表明，SYBR Green I 结合染料法完全可以用于转基因农作物定量PCR 检测. 图5 表2 参11关键词 抗除草剂转基因作物；SYBR Green I 荧光染料；实时荧光定量PCR ；溶解曲线；检测CLC Q943.2收稿日期：2008-12-15 接受日期：2009-03-17*国家“863”计划项目（No. 2007AA100701）和福建省科技计划重点项目（No. 2007I0036）资助 Support by the National “863” Project of China (No. 2007AA100701) and the Major Research Projects of the Department of Science & Technology of Fujian, China (No. 2007I0036)**通讯作者 Corresponding author (E-mail: phcemail@)867 6 期王恒波等：抗除草剂转基因作物实时荧光定量PCR检测使用特异性的荧光探针较多，但由于反应体系中荧光探针能与靶序列特异性杂交，同时存在猝灭不彻底、合成和标记复杂、成本较高等缺陷[2~4]. SYBR Green I荧光染料成本较低，但尚未在定量检测转抗除草剂基因作物中应用. 为了降低检测成本，本研究利用SYBR Green I荧光染料代替价格昂贵的TaqMan探针进行定量检测，分别建立了两种商品化程度最高的转基因大豆CP4-EPSSPS和转基因玉米（TC1507）PAT两种抗除草剂基因的定量PCR检测体系，以期为我国转基因定量标识检测体系提供技术支持.1 材料与方法1.1 材 料转基因大豆标准品（Roundup Ready TM soya beans）（ERM-BF410f、ERM-BF410d、ERM-BF410a），其中转基因成分含量分别占5%、1%、0%；转基因玉米标准品（TC1507 Maize），转基因成分含量分别占0%、1%、10%，以上标准品均由国际标准物质收藏中心（IRMM）制备，均购自Fluka公司. 阴性对照材料大豆为鲁豆4号、玉米吉单275，系本实验室保存.1.2 酶及试剂PCR反应试剂（包括ExTaq酶、SYBR Premix ExTaq、dNTPs、buffer）购自TaKaRa宝生物工程（大连）有限公司；CTAB提取液[200 mmol/L Tris-HCl，2 mol/L NaCl，25 mmol/L EDTA，0.5% SDS，pH 8.0]；沉淀缓冲液[2% CTAB，100 mmol/ L Tris-HCl，20 mmol/L EDTA，1.4 mol/L NaCl，1% PVP]；100 μg/mL蛋白酶K；酚 : 氯仿 : 异戊醇（25 : 24 : 1）；氯仿 : 异戊醇（24 : 1）；异丙醇；75%乙醇.1.3 主要仪器定量PCR仪：美国BIO-RAD公司生产；离心机：德国Eppendorf 5810型；PCR仪：德国Eppendorf公司Master Cycler gradient 96；核酸蛋白分析仪：瑞典APBiotech产品；生物安全柜：上海力新有限公司.1.4 PCR引物引物由上海生工生物工程有限公司合成，其核苷酸序列和扩增片段长度见表1. 引物采用中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T1195-2003、SN/T1196-2003.1.5 基因组DNA的提取采用SN/T1195-2003标准提取基因组DNA，用核酸蛋白分析仪测定核酸提取液中DNA的浓度，稀释到400 ng/μL 备用. 1.6 定性PCR对内源基因的检测与定量PCR对CP4-EPSPS和PAT外源基因的检测大豆和玉米的内源基因分别是Lectin、IVR，其检测引物如表1中所示，定性PCR反应在25 μL体系中进行. 反应体系：10×PCR Buffer（含Mg2+）2.5 μL，dNTP（2.5 mmol/L）2 μL，引物（10 pmol/L）各0.5 μL，ExTaq酶（5 U/μL）0.125 μL，模板DNA（100 ng/μL）1 μL，加灭菌双蒸水使总体积为25 μL. 扩增条件为预变性95℃ 5 min；变性94 ℃ 30 s，退火60 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s，35个循环；最后72 ℃延伸4 min.采用TaKaRa宝生物工程（大连）有限公司提供的试剂盒，在25 μL的反应体系中进行，其余按照说明书进行. 定量PCR反应条件：50 ℃ 2 min；95 ℃ 5 min；60 ℃ 40 s；40个循环. 反应结束后，记录参照样品和待测样品的Ct值，熔解曲线温度范围设置为65.0 ℃至95.0 ℃，每间隔0.5 ℃读数一次，每次1 s，并且连续记录荧光信号的变化，将温度的变化与荧光信号的变化求负倒数后对温度作图，可得到产物的 Tm值. 除特别注明外，每个试样均做3个重复，并同时设立空白对照和非转基因样品的阴性对照.1.7 DNA模板的制备提取转基因大豆含量（转基因大豆基因组量/大豆总基因组量）为5%的标准参照物质的DNA样品，利用核酸蛋白分析仪检测DNA的浓度，稀释到400 ng/μL. 用双蒸水分别将其DNA稀释1倍、5倍、25倍、125倍制作标准曲线，为了验证生成的标准曲线，特别将浓度为400 ng/μL、1%的转基因大豆标准品作为待测样品. 取不同稀释倍数的DNA待测样品进行实时荧光PCR检测，建立合适的标准曲线，用于待测转基因大豆样品的定量检测. 将转基因玉米TC1507含量为10%的参照物质提取的DNA样品稀释到400 ng/μL. 用双蒸水分别将其DNA稀释1倍、2倍、10倍、50倍、250倍制作标准曲线，用于待测转基因玉米TC1507样品的定量检测.1.8 定量标准曲线的建立和验证及溶解曲线分析通过对模拟不同转基因含量的转基因大豆和转基因玉米样品的测定，计算机自动生成标准曲线，纵坐标为Ct，横坐标为百分含量的对数. 根据回归曲线方程，将样品的Ct值代入公式，即可得到该转基因作物的百分含量.荧光染料的优势在于能检测各种双链DNA序列的扩增，无需设计探针，检测过程简便，成本低廉. 然而正是由于荧光染料能和任何dsDNA结合，对DNA模板没有选择性，因此也能与非特异的dsDNA结合，使实验容易产生假阳性信号，目前引物二聚体的问题可以通过溶解曲线分析加以解决.表1 大豆Lectin、玉米IVR内源基因和转化的CP4-EPSPS、PAT基因的PCR引物序列及产物大小Table 1 List of PCR primers designed for Lectin, CP4-EPSPS in RR soybean and IVR, PATin maize TC1507, and the sizes of their products基因 Gene引物序列 Primer sequence产物片段大小 Amplifi ed fragment (bp)Lectin Forward 5’-GCC CTC TAC TCC ACC CCC ATC C-3’Reverse 5’-GCC CAT CTG CAA GCC TTT TTG TG-3’′118CP4-EPSPS Forward 5’-CCA CTA TCC TTC GCA AGA CCC TTC C-3’Reverse 5’-CTT CTG TGC TGT AGC CAC TGA TGC-3’320IVR Forward 5’-CCG CTG TAT CAC AAG GGC TGG TAC C-3’Reverse 5’-GGA GCC CGT GTA GAG CAT GAC GAT C-3’226PAT Forward 5’-GTC GAC ATG TCT CCG GCG AG-3’Reverse 5’-GCA ACC AAC CAA GGG TAT C-3’19186815 卷应 用 与 环 境 生 物 学 报 Chin J Appl Environ Biol1.9 检测方法精密度分析[5]本实验在讨论以上两种标准品的基础上分别选择了3个不同转基因含量的浓度（0.04%、1.00%、5.00%），分别进行10次重复测定，通过统计分析方法计算两者的精密度.2 结果与分析2.1 大豆和玉米DNA的质量及其内源基因的扩增经过核酸蛋白测定仪测定，提取的基因组D N A的D260 nm /D280 nm在1.7~2.0之间，稀释DNA的浓度为400 ng/μL. 提取高质量的DNA是进行转基因成分检测的前提条件. 通过检测内源特异参照基因，可以判定DNA是否被提取出来，或所提DNA是否存在抑制PCR扩增的物质，从而可以避免检测出现的假阴性结果. 首先通过对大豆和玉米基因组中内源单拷贝Lectin基因与IVR基因进行定性PCR检测，验证所提取的基因组DNA能够适合于PCR扩增. 图1、图2分别显示Lectin基因与IVR基因扩增结果，由图可以看出，分别扩增出了预期的118 bp内源Lectin基因片段和226 bp的内源IVR基因片段，表明提取的基因组DNA质量完全符合PCR扩增的要求.2.2 定量标准曲线的建立和验证将转基因大豆含量为5%和转基因玉米含量为10%的DNA标准品，通过5倍稀释模拟5%、1%、0.2%、0.04%不同含量的转基因样品建立标准曲线，将待测样品扩增得到的Ct 值代入公式，即可得到待测样品的转基因成分的百分含量的对数，进而计算转基因成分的含量，最后通过已知百分含量的标准品进行验证所建立的标准曲线是否适合对转基因大豆和转基因玉米TC1507的定量检测. 研究表明：Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系[6]. Ct值越小，模板DNA的起始拷贝数越多；Ct值越大，模板DNA的起始拷贝数越少. 图3与图4分别是两个基因实时荧光定量扩增图. 由图可以看出，虽然两个基因的起始含量（大豆为5%和玉米为10%）不同，但是由于拷贝数/基因组的差异，它们在25个循环左右开始进入指数扩增期，且两个基因扩增稳定，浓度较低的样品用较多的循环次数才能产生较高的荧光信号，其Ct值也相应增大.检测转基因大豆得到的标准曲线方程为y = -2.9429x + 20.918，r2 = 0.9939. 其中：x为外源基因的百分含量的对数，y为Ct值，r2为线性相关系数；检测转基因玉米TC1507得到的标准曲线方程为y = -3.4394x + 23.193，r2=0.9924.以上定量PCR检测的标准曲线相关系数达到了0.99以上，具有较好的线性关系和可以接受范围内的SD值，检测灵敏度为0.04%，该灵敏度是目前国际上设定的转基因最低标识限量的25倍，已经完全能满足转基因产品标识检测的需要. 将已知转基因含量的待测样品Ct均值代入方程，得出0.9348%和1.079%，与实际含量的相对偏差是6.52%和7.9%，可以看出，线性方程完全可以满足转基因抗除草剂大豆和玉米的定量PCR检测需要.2.3 溶解曲线分析在SYBR GreenⅠ染料法检测中，染料与所有的双链DNA图1 大豆内源Lectin基因的定性检测 Fig. 1 Qualitative detection of the endogenous gene Lectin of soybean M：100 bp DNA ladder marker（Tiangen）；泳道1、2、3为5%转基因大豆标准品；4、5、6为1%转基因大豆标准品；7：阴性对照（pBI121）；8：阳性对照（鲁豆4号）；9：提取空白对照；10：试剂空白对照M: 100 bp DNA ladder marker; Lanes 1, 2, 3: Transgenic soybean reference of 5%; Lanes 4,5,6: Transgenic soybean reference of 1%; Lane 7: Negative control (pBI121); Lane 8: Positive control (Ludou No. 4); Lane 9, Environment control; Lane 10: Reagent control图2 玉米内源IVR基因的定性检测Fig. 2 Qualitative detection of the endogenous gene IVR of maizeM：100 bp DNA ladder marke（Tiangen）；1、2、3为10%转基因玉米标准品；4、5、6为1%转基因玉米标准品；7：阴性对照（鲁豆4）；8：阳性对照（非转基因玉米）；9：提取空白对照；10：试剂空白对照M: 100 bp DNA ladder marker; Lanes 1, 2, 3: Transgenic maize reference of 10%; Lanes 4, 5, 6: Transgenic maize reference of 1%; Lane 7: Negative control (Ludou No. 4); Lane 8: Positive control (Jidan No. 275); Lane 9: Environment control; Lane 10: Reagent control图3 转基因大豆标准品CP4-EPSPS基因SYBR Green I染料荧光定量PCR扩增曲线Fig. 3 Quantitative real-time PCR detection of CP4-EPSPS in GM soybeanreferences with SYBR Green I dye图4 转基因玉米TC1507标准品PAT基因SYBR Green I染料荧光定量PCR扩增曲线Fig. 4 Quantitative real-time PCR detection of PAT in GM maize referenceswith SYBR Green I dye8696 期王恒波等：抗除草剂转基因作物实时荧光定量PCR 检测相结合，不需要探针，检测方法简便；但其特异性完全依赖于引物，对引物设计要求特别高. 引物二聚体、单链二级结构以及错误的扩增产物都将引起假阳性的出现[7]，这将严重影响到定量检测的精确性和可靠性. 但利用荧光染料可以指示双链DNA 熔点的性质，通过温度的变化进行熔解曲线（Tm ）分析[8]，可识别扩增产物和引物二聚体，然后在检测的过程中通过提高退火温度，区分非特异扩增，从而降低非特异产物的影响. 一般通过熔解曲线来分析其扩增特异性. 理想的熔解曲线应该是单峰型曲线，如果出现两个或两个以上的峰，说明有引物二聚体等非特异性扩增产生. 本实验根据CP4-EPSPS 和Lectin 的扩增产物特点确定的读板温度分别为83.5 ℃和82 ℃，生成的溶解曲线如图5（A 、B ），可以看出，这两个基因的溶解曲线都是单峰型，说明PCR 扩增过程中没有出现非特异性扩增，由此推断定量PCR 扩增所获得的数据是可靠的.2.4 检测方法灵敏度和精密度的分析 对于不同检测方法来讲，其检测的灵敏度在很大程度上决定了检测结果的可信度，尤其是对于特异性不强的SYBR Green I 荧光染料法. 如果本实验的检测灵敏度不高，就很可能将阳性结果判为阴性. 本实验以模拟的转基因大豆和转基因玉米1%、0.2%、0.04%的模板进行扩增. 结果如图3、图4，所有不同含量的标准品均能够正常扩增，由此可以确定此荧光定量PCR 方法的检测灵敏度为0.04%，完全满足国际上对转基因含量检测的最低标识（欧盟2003）0.9%的要求.精密度表征测定过程中随机误差的大小，表示测量的再现性，是保证准确度的先决条件. 一般说来，精密度不高，就不可能有高的准确度；反之，精密度好，准确度不一定高. 这种情况表明测定中随机误差小，但系统误差较大. 本实验选择不同水平0.04%、1.00%和5%转基因大豆和玉米TC1507样品，进行10次重复测定，通过统计分析方法计算该检测方法检测的精密度. 从表2可知，0.04%、1.00%和5%的转基因大豆和玉米TC1507样品的最终实际测定值分别为0.040 3%、1.085 5%、5.079 7%和0.040 6%、1.051 4%、5.034 4%；变异系数分别在1.948 4%~3.711 8%，说明本实验建立的方法准确可靠，具有良好的重现性.3 讨 论3.1 实时荧光PCR 技术进行定量的方式随着转基因标签制度的实施，对转基因产品检测的要求不仅是要能够给出是或否的定性检测结果，更要能够对农作物及其产品中的转基因成分进行精确定量，因此实时荧光定量PCR 检测技术正日渐成为转基因产品检测的热点问题. 利用实时荧光PCR 技术进行定量的方式有3种：第1种方式是目前国际上采用的质量百分比（m /m ）对转基因产品进行定量，标准品是将不同质量百分比的转基因与非转基因干粉混合后提取DNA 定量检测；第2种方式是转基因产品（纯品）DNA 与非转基因产品DNA 的百分比，即将转基因产品纯品提取DNA 后，与非转基因产品的DNA 进行不同梯度的稀释，用所得的C t 值绘制出标准曲线：第3种方式是计算样品中的基因初始拷贝数，这需要将阳性质粒DNA 溶液作不同拷贝数的稀释，绘制出不同拷贝数的标准曲线[9]. 本实验采用的是第一种方式，探讨进行定量的可行性，通过标准曲线可以得出待检样品中外源基因DNA 的含量.3.2 荧光染料的优缺点由于FQ-PCR 是指在PCR 反应体系中加入能够特异标记PCR 产物的荧光物质，利用荧光信号积累实时监控整个PCR 进程，得到S 型的扩增曲线. 这种荧光物质可分为特异性荧光探针和嵌入荧光探针两大类. 本研究选用了嵌入荧光染料即SYBR Green I ，它是一种成本较低的结合染料的PCR 检测方法. 在反应体系中，加入过量SYBR 荧光染料，SYBR荧光染图5 使用SYBR Green I 染料测得标准品与待测样品的溶解曲线Fig. 5 Melting curve resulting from FQ-PCR analysiswith SYBR Green I dyeA 为引物CP4-EPSPS 特异扩增的溶解曲线；B 为引物PAT 特异扩增的溶解曲线A: Melting curve of the CP4-EPSPS gene; B: Melting curve of the PAT gene表2 转基因大豆Roundup Ready 和转基因玉米TC1507定量检测精密度结果分析Table 2 Precision analysis of quantitative detections of transgenic RR soybean and maize TC1507精密度分析Precision analysis转基因成分检测值 Quantity (% of content)转基因大豆Roundup ReadyGM soybean转基因玉米TC1507GM maize TC15070.04%1%5%0.04%1%5%平均值（10次重复）Average value (AV)标准偏差 Standard deviation (SD)变异系数 Coef fi cient of variation （CV/%）0.04030.00193.71181.08550.04753.06085.03970.05082.93890.04060.00173.20171.05140.06942.60115.03440.09811.948487015 卷应 用 与 环 境 生 物 学 报 Chin J Appl Environ Biol 料特异性地掺入DNA 双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR 染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR 产物的增加完全同步. 其优点是对模板没有选择性，使用非常方便，但也易与非特异性双链DNA 结合并产生荧光信号，从而产生假阳性，引物二聚体是最常见的假信号源，而且任何非特异的双链DNA 的存在都会产生信号，这些荧光信号有可能被当作来自目标扩增序列的信号，特别是当目的序列的扩增量很少或者根本没有的时候，但是这些不足之处可以通过融解曲线的分析[10]，优化反应条件，降低或者消除引物二聚体的干扰. 因为引物二聚体的片段一般很小，融解温度通常都比目标PCR 产物的融解温度低. 如果在高于引物二聚体的T m 但低于特异产物的T m 的温度下读板，由于引物二聚体已经变性，与之结合的SYBR Green I （SGI ）都脱离下来，因此这个时候检测到的荧光都来自目标扩增序列，这就消除了因引物二聚体而产生的荧光信号. 而在这个温度下，大部分的特异产物仍然保持双链形式与SGI 结合. 此时检测到的荧光信号，就没有了因引物二聚体而产生的干扰信号，荧光信号就与特异扩增产物量的关联性更加紧密.3.3 定量检测存在的问题在荧光定量PCR 技术中仍存在一些有待解决的问题. 在标准曲线定量中，标准品的制备是一个必不可少的过程. 目前由于无统一标准，各个实验室所用的生成标准曲线的样品各不相同，致使实验结果缺乏可比性. 另外，与传统的PCR 技术相比，FQ-PCR 的不足之处[11]是：(1) 由于运用了封闭的检测，减少了扩增后电泳的检测步骤，因此也就不能监测扩增产物的大小；(2) 因为荧光素种类以及检测光源的局限性，从而相对地限制了FQ-PCR 的复合式（Multiplex ）检测的应用能力；(3) 目前FQ-PCR 实验成本比较高，从而限制了其广泛的应用. 随着技术不断改进和发展，目前FQ-PCR 已成为转基因检测技术的主要工具，该技术未来的应用前景是令人鼓舞的，一方面FQ-PCR 技术与其它分子生物学技术相结合使定量极微量的基因表达或DNA 拷贝数成为可能. 另一方面荧光标记核酸化学技术和寡核苷酸探针杂交技术的发展以及Real Time 技术的应用，使定量PCR 技术有一个足够的基础为广大检测室所接受，将有助于对转基因生物产品成分进行准确、快速的检测.References1 Zhang LG (张立国), Zhang J (张琚). 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实时荧光定量PCR技术在转基因大豆A5547-127检测中的应用
Ａｂｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ： Ｉ ｎ ｔ ｈ ｉ ｓ ｓ ｔ ｕ ｄ ｙ ， ｒ ｅ ａ １ ． ｔ ｉ ｍｅ Ｐ ＣＲ ｗａ ｓ ｕ ｓ ｅ ｄ ｔ ｏ ｄ ｅ ｔ ｅ ｃ ｔ ｈ ｅ ｒ ｂ ｉ ｃ ｉ ｄ ｅ ｔ ｏ ｌ ｅ ｒ ａ ｎ ｔ ｇ ｅ ｎ ｅ ｔ ｉ ｃ ａ ｌ ｌ ｙ ｍｏ ｄ ｉ ｆ ｉ ｅ ｄ
仇有文， 张 明辉 。 于艳波 ， 等． 实时荧光 定量 Ｐ Ｃ Ｒ 技 术在转基 因大． ＥＡ ５ ５ ４ ７ － １ ２ ７ 检 测中 的应 Ｊ Ｅ ｆ ［ Ｊ ］ ． 东北农业 大学学报， ２ ０ １ ３ ， ４ ４ （ ７ ） ： ６ － １ Ｏ ．
Ｑｉ ｕ Ｙ ｏ ｕ ｗｅ ｎ ， Ｚ ｈ ａ ｎ ｇ Ｍｉ ｎ ｇ ｈ ｕ ｉ ， Ｙ ｕ Ｙ ａ ｎ ｂ ｏ ， ｅ ｔ ａ １ ． Ａｐ ｐ ｌ ｉ ｃ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ｒ ｅ ａ ｌ － ｔ ｉ ｍｅ Ｐ ＣＲ ｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｉ ｑ ｕ ｅ ｉ ｎ ｄ ｅ ｔ ｅ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ｇ ｅ ｎ ｅ ｔ ｉ ｃ ａ ｌ ｌ ｙ ｍｏ ｄ ｉ ｉ ｆ ｅ ｄ
ａ ｎ ｄ ｔ ｈ ｅ ｓ ｐ ｅ ｃ ｉ ｉ ｆ ｃ ｉ ｙ ｔ ｏ ｆ ｔ ｈ ｅ ｄ ｅ ｔ ｅ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ｍｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ａ ｎ ｄ ａ ｐ ｐ ｌ ｉ ｃ ａ ｂ ｉ ｌ ｉ ｔ ｙ ｗｅ ｒ ｅ ａ ｎ ａ ｌ ｙ ｚ ｅ ｄ ． Ｔ ｈ ｅ ｒ ｅ ｓ ｕ ｌ ｔ ｓ ｓ ｈ ｏ ｗｅ ｄ ｔ ｈ ａ ｔ ｔ ｈ ｅ
ｓ ｏ ｙ ｂ ｅ ａ ｎ Ａ ５ ５ ４ ７ － １ ２ ７ ［ Ｊ ］ ． Ｊ ｏ ｕ ｒ ｎ ａ ｌ ｏ ｆ Ｎ ｏ ￣ ｈ ｅ ａ ｓ ｔ Ａ ｇ ｒ ｉ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ａ ｌ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ ， ２ ０ １ ３ ， ４ ４ （ ７ ） ： ６ － １ ０ ． （ ｉ ｎ Ｃ ｈ ｉ ｎ ｅ ｓ ｅ ｗ ｉ ｔ ｈ Ｅ ｎ ｇ ｌ ｉ ｓ ｈ ａ ｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ）
转基因植物及其产品成分检测 环介导等温扩增方法制定指南
转基因植物及其产品成分检测环介导等温扩增方法制定指南1. 引言1.1 概述本篇文章旨在介绍转基因植物及其产品成分检测中的一种重要方法——环介导等温扩增，并制定相关操作指南。
转基因植物技术是现代生物技术领域的一个重要研究方向，通过引入外源基因改变植物的遗传特性，以实现对植物性状和品质的调控。
然而，随着转基因植物产品在市场上的广泛应用，对其合规性和安全性的检测也愈发重要。
目前，PCR技术是最常用于转基因植物及其产品成分检测的方法之一，但存在耗时长、复杂度高等问题。
相比之下，环介导等温扩增作为一种新兴的核酸扩增方法，在特异性、快速性、简便性以及成本效益上具有明显优势。
本文将详细介绍环介导等温扩增原理并制定相应操作指南，以期为广大科研工作者提供实验操作参考。
1.2 转基因植物简介转基因植物是通过人为手段将外源基因导入自然界中不存在的植物基因组中而产生的植物。
这些外源基因通过转化技术嵌入到植物细胞中，被遗传到下一代，并在整个生长过程中被表达出来。
转基因植物技术在农业、医药等领域具有广泛的应用前景，例如提高抗病虫害能力、改善产量和品质等。
然而，鉴别转基因植物及其产品成分的重要性日益凸显。
政府和国际组织对转基因食品进行严格管理与监控，以确保消费者的食品安全和权益。
因此，在有关立法和标签法规的约束下，开发可靠快速的检测方法是十分必要的。
1.3 环介导等温扩增方法简介环介导等温扩增（Loop-Mediated Isothermal Amplification, LAMP）作为一种新兴的核酸扩增方法，由于其高度特异性、高效率、简单操作以及成本效益受到了广泛关注。
该方法利用DNA引物和Bst DNA聚合酶在等温条件下完成扩增反应，无需复杂设备与复杂试剂制备流程，大大降低了实验操作的难度。
环介导等温扩增方法通过特异性引物对目标序列进行扩增，将其从复杂样本中快速准确地检测出来。
该方法具有传统PCR技术无法比拟的优势，如高特异性、高灵敏度、快速反应速度和便捷实施等。
211219924_农作物种子转基因成分检测能力验证样品制备技术分析与总结
农作物种子转基因成分检测能力验证样品制备技术分析与总结张 英 刘 冰 张海波 杨娟妮 张 田 陈国瑛 马亚琴（陕西省种子工作总站，西安710018）摘要：能力验证是评价检验机构技术水平和质量控制的重要手段，对近年来陕西省农作物种子检验站承担的各项转基因成分检测能力验证样品的制备工作进行回顾，总结了在能力验证样品制备工作中获取的经验与教训，分析了样品制备工作中一些好的做法和存在的问题，并提出了进一步改进的建议，为能力验证样品制备工作更为科学、规范地开展提供参考。
关键词：农作物种子；能力验证；转基因成分；样品制备能力验证是通过检验机构间的检测结果，来判定其出具检验数据的准确性、可靠性是否符合规定要求的合格评定活动[1]。
农作物种子检验机构能力验证，是了解掌握种子检验机构工作开展情况的重要渠道，也是评价种子检验机构技术水平高低的重要依据。
能力验证样品制备是能力验证工作正常开展的重要保障。
陕西省农作物种子检验站近年来多次承担各类不同转基因成分检测能力验证和比对样品的制备，用于考核通过的检验机构的能力验证、检验机构能力考评和实验室内/间的仪器比对。
工作中，陕西省农作物种子检验站科学合理地设计样品制备方案和测试方案，通过符合性验证、均匀度测试、严格质量控制等手段，保质保量、科学高效地完成了样品制备和测试工作，为评价检验机构转基因成分检测能力提供了强有力的技术支撑。
1 工作开展情况陕西省农作物种子检验站从2014年开始承担各类转基因成分检测样品的制备工作，共计制备样品2800余份。
制备的样品涉及玉米、棉花、油菜、大豆、水稻等5种作物，检测参数涵盖CaMV35S启动子、NOS终止子、Cp4-epsps基因、Bt基因、Bar/pat基因、Bt11转化体、MOM810转化体、TC1507转化体、BT176转化体、NK603转化体、NK603×TC1507转化体、DBN9936转化体、TT51-1转化体、GTS40-3-2转化体、GT73转化体、RF3转化体、抗虫棉Summary and Advice of Preparing Samples for Proficiency Testing of Agricultural Genetically Modified OrganismZHANG Ying，LIU Bing，ZHANG Hai-bo，YANG Juan-ni，ZHANG Tian，CHEN Guo-ying，MA Ya-qin（Shaanxi Seed Administration Bureau，Xi′an 710018）参考文献[1]常宏，李友强．甘肃省国家级玉米制种“四化”基地建设情况调研报告．甘肃农业，2014（8）：47-48[2]曹文凯，李慧，汤磊．泰安市高标准农田建设的主要措施及建议．山东水利，2014（5）：5-6[3]张新明．西北玉米制种基地存在的问题及发展对策．中国种业，2012（10）：16-17（收稿日期：2023-02-09）等，共计2个调控元件、3个目的基因、12个转化体，基本覆盖了国内常见的转基因作物及常见的转化体。
农作物种子转基因成分检测能力验证样品制备技术分析与总结
农作物种子转基因成分检测能力验证样品制备技术分析与总结标题：农作物种子转基因成分检测能力验证样品制备技术分析与总结摘要：随着转基因技术在农业领域的广泛应用，检测农作物种子中是否含有转基因成分成为了保障农产品质量和安全的重要手段之一。
本文通过对农作物种子转基因成分检测能力验证样品制备技术进行分析与总结，旨在提供一种高效可行的方法，以确保转基因检测结果的准确性和可靠性。
一、引言随着全球人口的不断增长以及食品安全问题的日益凸显，转基因技术被广泛用于提高农作物品质和抗病虫害能力。
然而，转基因食品引起的争议也十分激烈，因此，转基因食品的监管和检测显得尤为重要。
二、转基因成分检测需求分析通过对农作物种子中转基因成分进行检测，可以准确判断种子是否含有转基因成分，并确保农作物的纯度和品质。
针对转基因成分检测需求的分析，我们需要考虑样品的选择、DNA的提取、PCR扩增等方面。
三、样品的选择与处理合适的样品选择可以最大程度地提高转基因检测结果的准确性。
在选择样品时，应确保样品充分代表不同类型的农作物种子，并尽可能减少环境因素对样品的影响。
样品处理主要包括去除样品中的杂质、保持样品的完整性等。
四、DNA提取技术样品中的DNA提取是转基因成分检测的关键环节。
可以通过使用商用的DNA提取试剂盒来快速和高效地提取样品中的DNA。
同时，也可以根据自身实验需求，选择合适的DNA提取方法，并进行合理的操作和优化。
五、PCR扩增技术PCR扩增是检测转基因成分的重要步骤。
在PCR扩增中，选择适当的引物和扩增条件对转基因成分检测的结果至关重要。
为了提高PCR扩增的特异性和敏感性，可以进行引物序列的反复验证和PCR反应体系的优化。
六、结果分析与总结通过对多个农作物种子样品进行转基因成分检测，可以验证样品制备技术的可行性和有效性。
对实验结果进行统计分析和总结，可以评估转基因检测方法的准确性和可靠性。
结论：通过对农作物种子转基因成分检测能力验证样品制备技术的分析与总结，我们得出了一套高效可行的方法，确保了转基因检测的准确性和可靠性。
实时定量 PCR 鉴定转基因作物纯合体
实时定量 PCR 鉴定转基因作物纯合体张丽;刘丽丽;梁晓声;王海英【摘要】Rice endogenous reference gene phospholipase D gene ( PLD) and genetically modified ( GM) rice TT51-1 event-specific flanking sequence were used as PCR detection targets.And the homozygosis of GM rice TT51-1 plants originated from single plant seeds were analyzed through real-time PCR assays, which analyzed the Ct value of the endogenous reference gene and the flanking sequences.The reliability of this method was verified by calculation of GM copy number ratio based on the standard curves.It was concluded that the method was simple and accurate to identify the homozygosis of GM crops.%以水稻内标准基因磷脂酶D基因（ phospholipase D， PLD）和转基因水稻TT51－1特异性旁侧序列为检测靶标，对单株转基因水稻的种子播种后长出的单株进行了荧光定量PCR，以其内标准基因和旁侧序列Ct值的差值判断了植株的纯合体，并用标准曲线计算了转基因含量，证实了此法的可靠性，说明此法用于鉴定植株的纯合体简便准确。
【期刊名称】《中南民族大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2015(000)001【总页数】4页(P43-46)【关键词】转基因作物;纯合体;内标准基因;旁侧序列;实时荧光定量PCR【作者】张丽;刘丽丽;梁晓声;王海英【作者单位】中南民族大学生命科学学院武陵山区特色资源植物种质保护与利用湖北省重点实验室，武汉430074;中南民族大学生命科学学院武陵山区特色资源植物种质保护与利用湖北省重点实验室，武汉430074;中南民族大学生命科学学院武陵山区特色资源植物种质保护与利用湖北省重点实验室，武汉430074;中南民族大学生命科学学院武陵山区特色资源植物种质保护与利用湖北省重点实验室，武汉430074【正文语种】中文【中图分类】Q788纯合的转基因植株不仅可用于育种研究，还可用于制备转基因检测的标准物质[1].在研制转基因作物标准物质时，需要大量的候选物，并对其纯合度进行鉴定，候选物的纯合度直接影响了标准物质的量值[2]，故建立一种简单、有效的纯度鉴定方法具有重要意义.目前主要用定性PCR和荧光定量PCR对转基因作物的纯合体进行鉴定.定性PCR 法是利用4个引物的多重PCR 反应，根据PCR扩增条带数和条带的大小来鉴定转基因植株的纯合体，它要求在遗传转化过程中未发生重组，并且需要有详细的外源基因插入位点信息[3].荧光定量PCR是将盲样的Ct值代入所绘制的标准曲线，计算外源基因和内标准基因的拷贝数，转基因含量GM(%)=外源基因拷贝数/内标准基因拷贝数×100%.转基因含量约100%为纯合，约50%的为杂合，约0%的为非转基因.以上方法中，定量PCR法要求其标准曲线的绘制较为繁琐，且一般标准样品与分析样品在同一PCR板上，也限制了每次分析的样品量[4].本文以转基因水稻为研究对象，以单株转基因水稻的种子为起始材料，将种子播种后长出的单株为转基因标准物质研制的候选物，并对其纯合度进行研究和鉴定，建立了一种快速的转基因纯合度分析方法.1.1 仪器和材料Bio-Rad CFX96 Real-time PCR Detection System (Hercules, USA)，转基因水稻TT51-1种子和纯阳性转基因水稻TT51-1 DNA标准品由华中农业大学提供，DNA小量提取试剂盒DNA easy Plant Mini Kit(QIANGEN公司)，荧光定量PCR试剂盒TaqMan® Universal PCR Master Mix(ABI公司)，PCR引物和探针(上海生工生物工程技术服务有限公司)，Taqman探针5’荧光基团用FAM标记，3’荧光淬灭基团用TAMRA标记，引物探针序列如表1所示[5].1.2 转基因水稻TT51-1植株的繁殖将来自同一穗的转基因水稻种子于约37℃下水泡萌发，转移到温室中种植，待其长出一定叶片后，收取部分子叶用于基因组DNA提取和PCR扩增鉴定.1.3 基因组DNA 的提取参考操作说明书提取植物基因组DNA.采用Picogreen法测定DNA浓度，用紫外分光光度法测定OD260/280检测质量和纯度.1.4 荧光定量PCR反应体系和反应条件荧光定量PCR反应荧光信号通过CFX manager software program进行信号收集和分析.水稻内标准基因PLD和TT51-1转化体事件特异性旁侧序列的反应体系为：1×Taq Man Universal PCR Master Mix，400 nM正向引物，400 nM反向引物，200 nM探针，1.5 μL模板DNA，加ddH2O至20 μL.反应条件为：50℃ UNG酶处理2 min，94℃预变性10 min，再94℃ 15 s，60℃ 1 min，45个循环.2.1 样品的定量PCR扩增和纯合体鉴定本文随机选取16个单株，对这16个单株提取基因组DNA后进行荧光定量PCR，水稻内标准基因PLD和TT51-1转化体事件特异性旁侧序列的Ct值结果如表2所示. 由于每个模板的Ct值与其拷贝数的对数成线性关系，起始模板拷贝数越多，Ct值越小，则外源基因与内标准基因的Ct值之差越小.根据遗传学定律，经过繁殖后的单株中只存在非转基因、转基因杂合、转基因纯合3种情况.通过分析表2中的外源基因和内标准基因的Ct差值，可将16棵植株分为3类(图1)：第一类外源基因和内标准基因的Ct值之差较大，这是由于该基因组DNA中无外源基因扩增，Ct值显示无扩增或超过38个循环的非特异扩增，10、12、16号植株为非转基因水稻；第二类和第三类的转基因水稻的外源基因和内标准基因的Ct值之差分别约为1.8和0.8，第二类的转基因水稻的起始模板拷贝数较第三类少，故第二类转基因水稻为杂合，6、8、13、15号植株为杂合转基因水稻；1、2、3、4、5、7、9、11、14号植株为纯合转基因水稻.此外，纯合转基因植物与杂合转基因植物相比，在荧光定量PCR反应中也表现出两者△Ct值约为1，与理论上两者转基因含量为2倍之差相符.2.2 标准曲线的绘制在转基因含量的分析研究中，常采用标准曲线法，将含量为100%的转基因水稻TT51-1基因组DNA 5 倍梯度稀释至100000，20000，4000，800，160，32 copies/μL，以稀释后的6个浓度梯度DNA为模板进行荧光定量PCR，绘制内标准基因和旁侧序列的标准曲线，反应设置4个平行.反应所得Ct值如表3所示，扩增曲线如图2所示.内标准基因标准曲线的斜率为-3.5087，线性决定系数为0.992. 旁侧序列标准曲线的斜率为-3.4417，线性决定系数为0.998. 根据欧盟转基因网络实验室(European Network of GMO Laboratories，ENGL)对转基因检测方法中的要求，标准曲线的斜率应在-3.1～-3.6之间，代表PCR扩增效率在90%到110%之间，线性决定系数应大于0.98，说明实验结果可靠、有效[6].本次试验绘制的标准曲线均满足相关要求，可用于转基因含量的定量分析.2.3 样品转基因含量分析在标准曲线绘制的同时，对表2中的16个单株抽取6份单株(分别为11～16号样品)进行荧光定量PCR分析，并采用拷贝数百分比的方式计算转基因含量，结果见表4.通过表4中外源基因与内标准基因的拷贝数的比值大致可将6棵植株分为3类：第一类拷贝数之比为0，说明这类水稻植株的基因组中未插入外源基因，第12、16号植株为非转基因水稻；第二类拷贝数之比接近0.5，说明这类水稻的二倍体基因组中只有一条DNA双链中插入了外源基因，而处于等位基因上的另外一条DNA双链中未插入外源基因，即杂合体，故第13、15号植株为杂合转基因水稻；第三类拷贝数之比接近1.0，说明这类水稻的等位基因上一对双链DNA中均插入了外源基因，即等位基因上双链DNA的旁侧序列相同，故第11、14号植株为纯合转基因水稻.此法判断结果与通过Ct值差值法的纯合体鉴定结果一致，证明可以用Ct值差值法取代传统的转基因拷贝数百分比法来分析转基因纯合度.在转基因检测标准物质的研制过程中，标准物质候选物是指可用于制备标准物质的材料，如转基因植物和对应的非转基因植物的籽粒、叶片等.在标准物质的研制过程中，需要大量的标准物质候选物.欧盟联合研究中心下属的标准物质与测量研究所(Institute for Reference Materials and Measurements，IRMM)在研制转基因玉米98140基体标准物质(编号BF427)时，以非转基因玉米种子和转基因玉米种子为起始材料[7].美国的油脂化学家学会(American Oil Chemists’Society，AOCS)在生产转基因玉米T25基因组DNA标准物质(编号AOCS 0306-C)时，以2 mg非转基因玉米和转基因玉米T25的叶片DNA为起始材料[8].这些起始材料在生产的过程中均需要对纯合度进行鉴定[9].常规的纯合度鉴定是采用荧光定量PCR分析作物内标准基因和旁侧序列的拷贝数来计算转基因含量.由于计算含量时需要绘制标准曲线，一次分析的样品量有限，大大限制了标准物质候选物的纯合度分析效率.本文以标准物质候选物的繁殖为基础，以来自单株转基因材料的种子为起始材料，根据遗传分离定律，生长出来的植株只有非转基因、转基因杂合、转基因纯合3种情况.作物内标准基因的拷贝数恒定不变，外源基因的拷贝数可根据植株转基因纯合状态分为3组[3].在荧光定量PCR分析中，用外源基因的Ct值减去内标准基因的Ct值，将样品DNA浓度均一化.外源基因和内标准基因Ct值差值较大，说明外源基因拷贝数较少.故根据植株的3种情况，将△Ct值分为3组：若外源基因无扩增或Ct值超过38则为非转基因；△Ct值较小的即为转基因纯合，△Ct值较大即为转基因杂合，且转基因杂合与转基因纯合△Ct值差值约为1.本方法快速、简便、准确、可靠，大大提高了转基因标准物质候选物的分析效率，为转基因作物纯合度研究提供了理论和技术基础.[1] Trapmann S,Schimmel H,Kramer G N,et al.Production of certified reference materials for the detection of genetically modified organisms[J].J AOAC,2002,85 (3): 775-779.[2] Broothaerts W,Contreras M,Corbisier P,et al.Certification of reference materials of soya seed powder with different mass fractions of genetically modified 305423 soya,ERM®-BF426[R].Luxembourg: Office for Official Publications of the European Communities,2007.[3] 刘楠,陈化榜.转基因玉米目标基因纯合体快速准确的PCR鉴定方法[J].分子植物育种,2009,7(3): 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《亚麻籽中转基因成分检测实时荧光PCR法》
编制说明
一、任务来源
根据国家认证认可监督管理委员会2010年下达的标准编写任务通知(计划编号：2010B323k)，由辽宁出入境检验检疫局主持制定。
二、意义
亚麻籽是世界上重要的油料作物之一，富含多量不饱和，这些脂肪酸可以加速，提高能力，分解，平衡血压，以及压抑制和增长等多种功效。
以、、和为主的西方，对亚麻子作为功能的研究和开发作了大量的工作，亚麻籽也作为辅料添加在谷物早餐、面包、混合坚果和快餐食品中。
1996年加拿大萨克斯其万大学培育了一种具有抗除草剂性状的转基因亚麻籽FP967品系，又称为CDC Triffid 转基因亚麻籽。
后来被除名并规定永久不得商业化耕种，FP967品系转基因亚麻籽可以说是世界上独一无二的转基因亚麻籽。
2009年，非法转基因亚麻籽在欧洲23国以及韩国、斯里兰卡、新加坡、泰国等28个国家发现，谷物、面包等产品若发现受污染都会下架。
面对生物基因工程技术对我国经济利益带来的冲击和国外转基因产品对生态环境和消费者可能带来的风险，对转基因亚麻籽进行检测具有重要的现实意义。
三、制标依据和研究过程
本标准的编制工作引用和参考了GB/《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》的要求进行编写。
此外，参考了国内外相关文献，主要有：
1. GB/T 标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写规则
2. NOST-Spec construct-specific method for the detection of CDC triffid flax (Event FP967) using real-time PCR, EU-CRL.
标准研制过程中，在方法的特异性、灵敏度等方面做了大量实验，并对所建立的标准方法进行了应用研究。
本标准经过验证实验，证明切实可行。
本标准检验方法是在以上研究、验证和鉴定的基础上进行起草的。
四、FP967品系转基因亚麻籽品系介绍和检测引物的来源
1. FP967品系转基因亚麻籽
FP967品系转基因亚麻籽，又称为CDC Triffid 转基因亚麻籽。
由加拿大萨克斯其万大学所培
育，后来被除名并规定永久不得商业化耕种的亚麻品种，可以说是世界上独一无二的转基因亚麻籽。
2．检测引物的来源
FP967品系转基因亚麻籽通过农杆菌介导转化获得，具有抗除草剂性状。
其中als基因源自抗氯乙酰胺的拟南芥品系；neo基因源自K12且受农秆菌nos启动子调控；nos基因源自农秆菌且受农秆菌nos启动子的调控；bla基因受细菌启动子的调控。
FP967品系转基因亚麻籽的检测引物来源于 NOST-Spec construct-specific method for the detection of CDC triffid flax (Event FP967) using real-time PCR, EU-CRL.
五、FP967品系转基因亚麻籽检测引物和探针的试验结果
1. 阳性参照
采用质粒合成的方法，合成了一个同时包含77bp SAD基因和95bp NOST-Spec基因的质粒“FlaxGM”。
两个片段同时出现在同一拷贝中。
这一质粒同时用于检测内参基因SAD和GM目标基因NOST-Spec的扩增效果。
2. 实时PCR特异性与灵敏度检测结果
内源基因检测引物和探针的实用性
采用SAD (内源基因) 检测引物和探针，选取亚麻籽、小麦、大麦、大米、油菜籽、大豆、玉米、棉花等8种样品，验证亚麻籽内源检测引物和探针的特异性，并验证上述8种样品DNA提取的质量。
检测结果如图1所示。
由图1可见，本标准中SAD(内源基因) 检测引物和探针适合于对亚麻籽内源基因的检测。
图1 内源基因SAD检测引物和探针的实用性检测结果
检测引物和探针的实用性
采用NOST-Spec检测引物和探针，选取转基因亚麻籽FP967合成质粒、非转基因亚麻籽、玉米DBT418、Bt176、Bt11、GA21、DLL25、CBH351、T14、MON810、NK603、TC1507、MON863、59122、MON88017、MIR604、大豆Mon40-3-2、Monday9788、油菜籽MonGT73、HCN92、Oxy-235、Laureate23-198、MS8ⅹRF3、MS1ⅹRF1、MS1ⅹRF2、T45、棉花Mon1445、Mon531、BXN、马铃薯RBMT21-129、紫花苜蓿J101、J163、夏南瓜ZW20等33种样品，验证上述检测引物和探针的实用性。
每对引物和探针重复检测两次，检测结果如图2所示，只有FP967品系转基因亚麻籽合成质粒出现了很好的阳性增幅曲线。
其余物种样品，包括非转基因亚麻籽样品均未出现扩增曲线。
结果表明：上述检测引物和探针适合于对FP967品系转基因亚麻籽NOST-Spec基因的检测。
图2 NOST-Spec测引物和探针的实用性检测结果
实时PCR灵敏度检测结果
对FP967阳性样品的灵敏度检测结果
将合成质粒FlaxGM稀释至40拷贝/反应、20拷贝/反应、10拷贝/反应、5拷贝/反应，每个稀释度重复10次。
验证上述检测引物和探针的灵敏性。
检测结果如图所示。
由图3可见，实时PCR检测FP967阳性样品的灵敏度可以达到>5拷贝/反应。
图3 灵敏度测试结果
七、标准征求意见情况
本标准从认监委标准化管理系统中发出15家单位征求意见，有？？？家单位反馈了意见。
所有意见全部接受，并按照意见进行了修改。
八、标准验证情况
本标准由3家单位：深圳出入境检验检疫局、吉林出入境检验检疫局、黑龙江出入境检验检疫局，针对标准的内容进行了验证试验。
结果表明：该方法可实现对FP967品系转基因亚麻籽成分的定性检测。
参考文献
1. NOST-Spec construct-specific method for the detection of CDC triffid flax (Event FP967) using real-time PCR, EU-CRL.。