不同通气条件下米根霉发酵产L-乳酸的代谢调控

不同通气条件下米根霉发酵产L-乳酸的代谢调控1

姜绍通，郑志，罗水忠，潘丽军

合肥工业大学生物与食品工程学院，合肥 (230009）

E-mail: jiangshaotong@

摘要：米根霉发酵生产L-乳酸是一个好氧的代谢过程，供氧程度直接影响到葡萄糖对乳酸的转化率。本文研究了不同摇瓶条件对米根霉发酵体系中LDH与ADH的酶活变化，以及乳酸和乙醇转化率的影响，结果表明：当装液量从10%增加到30％，乳酸的产量及相应的LDH活力呈下降趋势，而乙醇浓度及ADH活力随着装液量的增加而提高。摇床转速为220 r/min时，乳酸产量最大，对应的LDH活力也最大；摇床转速为160 r/min时，乙醇产量与ADH活力较高。单膜封口发酵乳酸浓度与LDH活力分别比双膜封口发酵提高64.4％和49.9%，而双膜封口发酵时乙醇最大浓度与最大ADH活力分别比单膜封口发酵提高30.0%和25.5%。研究通过单因素实验在装液量20％，摇瓶转速220r/min下可得到摇瓶下的最大乳酸转化率，此时乳酸含量为68.14g/L，LDH活力为5.97U/mL，乙醇浓度为16.28 g/L，ADH 活力为15.44U/mL。

关键词：米根霉；不同摇瓶条件；乳酸；乙醇

中图分类号：TQ921+. 3

1．引言

好氧微生物在发酵过程中，菌体对氧的消耗速率往往会很高，因此，氧的供应是影响发酵生产效率的重要因素，其供给水平会直接影响到目标产物形成的效率，是代谢控制发酵中需要研究的一项重要调控技术[1]。米根霉发酵生产L-乳酸是一个较复杂的代谢过程，发酵产物主要有乳酸和乙醇。但供氧程度的不同，会影响到目标产物乳酸与主要代谢副产物乙醇的分配，降低乳酸的转化效率[2]。较低的通气条件会使得菌体生长受到抑制，酒精发酵程度提高，使得乳酸产量降低；较高的通气条件会使得兼性厌氧发酵过程受到抑制，因此在发酵过程中菌株能够正常生长，保持菌体活力，能持续将葡萄糖转化为乳酸[3]。所以，研究米根霉发酵过程中不同通气条件下LDH与ADH的酶活变化以及发酵终产物乳酸和乙醇的比例变化，分析不同通气条件下碳代谢流变化情况，具有一定的实际意义。本实验通过研究摇瓶条件下的装液量、摇床转速、封口膜等不同通气条件下米根霉发酵过程中LDH与ADH的酶活变化以及发酵终产物乳酸和乙醇的比例变化，分析不同通气条件下碳代谢流变化情况，研究的结果为实现提高L-乳酸的发酵产率具有一定意义。

2 材料和方法

2.1材料

米根霉（Rhizopus oryzae）AS 3.3461，购于广州微生物研究所菌株保藏中心。菌种保藏采用PDA培养基；发酵培养基组成为：葡萄糖120g/L，（NH4）2SO4 4 g/L，KH2PO40.3 g/L，ZnSO4Ÿ7H2O 0.44 g/L，MgSO4Ÿ7H2O 0. 25 g/L，CaCO360 g/L（单独灭菌），pH 值自然。

2.2 方法

2.2.1 孢子悬浮液的制备

1本课题得到高等学校博士学科点专项科研基金（项目编号：20040359008）的资助。

PDA 斜面培养基接种后，在32ºC 下恒温培养3～5天后，用适量的无菌水洗下，制成孢子悬浮液。用血球计数板确定孢子数量，再稀释至大约106个孢子/mL ，使得每次接种浓度相当。 2.2.2 摇瓶条件下不同通气条件发酵实验

（1）不同装液量的研究

保持培养基成分和发酵条件相同，发酵液的体积分别为10%、20%、30%，置于32 ℃气浴恒温摇床，220 r/min 振荡培养至64h 结束，每个条件下做三组平行实验。期间每隔8h 取一次样，洗涤菌丝体，将洗净的菌丝体称重并加入一定体积的pH=7.4的 0.1 mol/L 磷酸缓冲溶液，破碎离心后测定LDH 、ADH 酶活，过滤后的发酵液用于测定L-乳酸与乙醇浓度。所有结果均取三个结果的平均值。

（2）不同转速的研究

培养基成分及培养方法同基本发酵培养基，接种规模为2％，装液量为20%，温度为32 ℃，分别选取160 r/min 、220 r/min 、280 r/min 进行比较研究。样品处理及检测内容同上。

（3）限氧条件的研究

培养基保持不变，但摇瓶分别采用单层和双层封口膜封口，以造成部分限氧条件，研究部分限氧条件下的米根霉碳代谢特性。接种规模为5％，温度为32 ℃，转速为220 r/min ，装液量为20％。实验中，每隔8h 取一次样，至64h 结束，样品处理及检测内容同上。

2.3 分析方法

发酵液中乳酸含量的测定按参考文献[4]进行，乙醇含量的测定按参考文献[3]报道的方法进行，菌丝体中LDH 和ADH 活力测定按参考文献[5]进行，粗酶液总蛋白含量测定按参考文献[6]进行。

3 结果与讨论

3.1 不同装液量下的碳代谢特性

装液量是米根霉发酵过程中通气条件的重要影响因素。不同的装液量使得摇瓶中的剩余空间不同，振荡培养中的发酵液流体性质也不同，使得摇瓶内溶氧不同，从而对碳分流有重要的影响。分别以10％、20％、30％装液量，32 ℃恒温摇床，220 r/min 振荡培养，每隔8h 取一次样，测定乳酸浓度、乙醇浓度，ADH 和LDH 酶活，结果见图1～图4。

乳酸浓度 /(g /L )

time /(h) 10% 20% 30%

图1 不同装液量对乳酸浓度的影响

Fig. 1 The effect of volume on the L-lactic acid concentration

L D H 活力 /(U /m L )

time /(h)

10% 20%

30%

图2 不同装液量下的LDH 活力变化

Fig. 2 The effect of volume on the LDH activity

从图1可以看出，当装液量为10%时，乳酸的产量最大，达到69.33g/L ，20%和30％装液量的其次，但区别不显著。图2则表明，三种装液量下的LDH 活力变化趋势基本相同，都是先升后降，LDH 活力最大值均出现在发酵40h 。其中，以10％装液量下的LDH 较高，达到6.14U/mL ；30％的最小，为5.36U/mL ，变化趋势与乳酸含量的变化趋势基本一致。图3中，随着装液量的增加，乙醇浓度相应增大，10％装液量下的乙醇浓度为15.82g/L ，30%

时最大，达到17.48 g/L 。曲线反映乙醇浓度出现波峰后都有一定程度的下降，可能是随着发酵的进行，有少量乙醇从发酵液中挥发出去，或者是在样品预处理离心时，剪切产热使得部分乙醇挥发。图4则显示了三种装液量下的ADH 活力变化情况，都是先升后降，最大值均出现在发酵40h 以后，且随着装液量从10％上升到30％时， ADH 活力均相应从13.72 U/mL 上升至16.62U/mL 。

综合图1～图4可以看出，在摇床发酵转速恒定，装液量从10％增加到30％时，摇瓶的有效空间减少，导致空气中的氧气传递量降低，所以，发酵液中L-乳酸浓度逐渐降低，菌丝体中的LDH 活力也呈下降趋势；而乙醇浓度随着装液量从10％增加到30％时，却有一定增加，ADH 活力也表现出相应趋势。但由于10％的装液量，发酵液总体积较小，所以，在后续的研究中，均采用20％的装液量。

3.2不同转速下的碳代谢特性

不同转速既影响到发酵液中氧气的传递效率，也对菌丝形态产生影响，菌丝形态又直接影响到乳酸产量，从而对碳分流有重要的影响。研究分别在160 r/min 、220 r/min 、280 r/min 转速，装液量20%，32 ℃恒温摇床振荡培养条件下，其乳酸、乙醇浓度以及ADH 和LDH 活力变化情况，结果见图5～图8。

乙醇浓度 /(g /L )

time /(h) 10% 20% 30%图3 不同装液量下的乙醇浓度变化 Fig. 3 The effect of volume on the alcohol concentration 10%

20%

30%

A D H 活力 /(U /m L )

time /(h)

图4 不同装液量下的ADH 活力变化 Fig. 4 The effect of volume on the ADH activity