土壤分析

土壤微生物的分析测定

土壤微生物（soil microorganism)是指生活在土壤中借用光学显微镜才能看到的微生物。土壤微生物是土壤的重要重要组成部分，特别是在土壤质量的演变过程中，土壤微生物具有相对较高的营养转化能力，土壤中占多数的分别是细菌、放线菌、真菌。由于在不同地带、不同土壤类型、不同季节和不同的土壤条件及农业措施等影响下，微生物的数量组成是不同的。为此对某一地区的土壤进行采样并分离菌株，对提纯所得的菌株作生理生化分析，对了解某一区域的土壤微生物性质意义深远。

1.土样的采集及处理

1.1 采样工具

GPS导航仪、取土器、铁铲（锹）、小刀、卷尺、采样袋（布袋、纸袋或塑料网袋）、采样标签、记号笔等。

1.2 土样采集

土壤采自郊外，采集深度0~20cm，采样时先刮去2-3cm厚的表层土，用铁锹挖成一个深20cm的完整垂直剖面，再取宽10cm、厚2cm的土片，采用5点采集法，共采集6个土样，每个土样500g。取样时先用铁锹铲出一个耕层断面，然后与断面平行取土。每个采样点的取土深度及采集数量均一致，样品中上层土与下层土的含量相同；取土器入土时要与地面垂直，且保持同一深度。用刀和尺将土片削成宽2cm、厚2cm、长（自上而下）15－20cm 的土条，捏碎大块，剔除石砾、植物残体等混杂物。

1.3 样品的处理

采样多点混合，充分拌匀成为混合土样。每一个混和土样中称取1kg，样品的数量过多时采用四分法除去多余的土壤，即将样品放在干净的平面上，将其碾碎、混匀，并铺成平面四方形，沿对角线将土壤平均分成四份，对角的两份混匀成为一份，取其中一份。如果得到的样品仍然比较多，可以再继续采取四分法处理，一直达到需求的数量为止。

1.4 土壤稀释液的制备

取土样10g，放入盛有90ml无菌水并带有10粒无菌玻璃珠三角瓶中，震荡10分钟，制成均匀的土壤悬液，取10ml原液于试管，用1支1ml无菌液盛有9ml无菌水的试管中充分混合，再用无菌试管从此试管中再吸取1ml悬液，加入另一盛有9ml的无菌水的试管中，以此类推配制10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6.、10-7不同稀释度的土壤溶液。

2 土壤微生物的分离与计数

2.1 土壤细菌MPN计数

2.1.1 选择性试管分离

按牛肉膏蛋白胨琼脂培养基的配方(蛋白胨5.0g，琼脂18.0g，牛肉膏3.0g，蒸馏水1000mL，pH 7.0~7.2)，依次按试剂加入500ml的容量瓶中，加入一定量的无菌蒸馏水，震荡均匀后定容至500ml，将溶液倒入三角瓶内，120℃灭菌20min。灭菌完毕后，待三角瓶温度降至50℃时，在无菌操作台上将溶液倒入试管。倒入试管时，右手持盛装培养基的三角瓶置于火焰旁，左手将试管塞塞拔出，瓶口保持对着火焰，然后用右手手掌边缘与无名指夹住瓶塞，左手拿试管并将试管塞在火焰附近打开，迅速倒入，待冷却。

2.1.2 试管的标记

选取10-7~10-3 5个相连的稀释度，将不同的稀释度悬液分别接种至不同培养基的试管中，每管接悬液1ml，每一稀释度重复3管，不同土壤稀释液细菌分离的培养皿标记如下表1所示：

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表1 不同稀释度土悬液细菌筛选试管编号

土壤浓度10-3 10-410-510-610-7

I1 II1 III1 IV1 V1

试管编号I2 II2 III2 IV2 V2

I3 II3 III3 IV3 V3 于28℃培养7~14d，根据各稀释系列试管中有无细菌得出数量指标，并根据重复数量不同利用三次重复测数统计表查出细菌近似值。

每克干土中细菌数=

干土所占百分比释倍数

数量指标第一位数的稀

近似值⨯

2.2 放线菌的分离计数

2.2.1 选择性试管分离

按改良高氏I号培养基的配方(蛋白胨5.0g，磷酸氢二钾0.5g，硫酸亚铁0.01g，琼脂18.0g，硝酸钾1.0g，硫酸镁0.5g，氯化钠0.5g，蒸馏水1000mL，pH7.0)，临用时在已融化的高氏I号培养基中加入重铬酸钾溶液，以抑制细菌和霉菌的生长，每100ml培养基加入3%重铬酸钾。按上述方法把培养液倒入试管待冷却。

2.2.2 试管的标记

选取10-6~10-2 5个相连的稀释度，将不同的稀释度悬液分别接种至不同培养基的试管中，每管接悬液1ml，每一稀释度重复3管，不同土壤稀释液细菌分离的培养皿标记如下表2所示：

表2 不同稀释度土悬液放线菌筛选试管编号

土壤浓度10-3 10-410-510-610-7

A1 B1 C1 D1 E1

试管编号A2 B2 C2 D2 E2

A3 B3 C3 D3 E3

于28℃培养7~14d，根据各稀释系列试管中有无细菌得出数量指标，并根据重复数量不同利用三次重复测数统计表查出放线菌近似值。

每克干土中细菌数=

干土所占百分比释倍数

数量指标第一位数的稀

近似值⨯

2.3 真菌的分离计数

2.3.1 选择性试管分离

按马丁培养基的配方(蛋白胨5.0g，磷酸二氢钾1.0g，琼脂18g，琼脂18.0g，葡萄糖10.0g，硫酸镁0.5g，蒸馏水1000mL)，为抑制大部分细菌及放线菌的生长，1000ml培养基中加入1%孟加拉红水溶液3.3ml，临用时每100ml培养基加1%链霉素液0.3ml。按上述方法把培养液倒入试管待冷却。

2.3.2 试管的标记

选取原液~10-4 5个相连的稀释度，将不同的稀释度悬液分别接种至不同培养基的试管中，每管接悬液1ml，每一稀释度重复3管，不同土壤稀释液细菌分离的培养皿标记如下表3所示：

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表3 不同稀释度土悬液真菌筛选试管编号

土壤浓度原液10-110-210-310-4

a1 b1 c1 d1 e1

试管编号a2 b2 c2 d2 e2

a3 b3 c3 d3 e3

于28℃培养7~14d，根据各稀释系列试管中有无细菌得出数量指标，并根据重复数量不同利用三次重复测数统计表查出真菌近似值。

每克干土中细菌数=

干土所占百分比释倍数

数量指标第一位数的稀近似值

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