鸡胚绒毛尿囊膜在抗血管形成研究中的应用_王含必

种植成功率密切相关。在 ５￣１１ 日龄鸡胚中种植的 肿瘤， ７２ｈ 内可见到肿瘤生长的两期完整表现； １２￣ １３ 日龄的种植仅可保持原种植瘤的体积， ７２ｈ 后开 始皱缩； １４￣１６ 日龄种植的肿瘤均失败。其次， 种植 时机的选择与肿瘤的生长状况密切相关。５￣６ 日龄 种植的肿瘤生长最快， 终体积最大， 可由 １ｍｍ 长到 １０ｍｍ； ７￣９ 日龄种植的肿瘤生长缓慢， 终直径仅可 达 ３￣５ｍｍ； １０￣１１ 日龄的鸡胚中种植的肿瘤生长最 慢， 终平均直径为 １．５￣２．５ｍｍ。最后， 种植瘤的体积 与肿瘤的生长情况密切相关。直径 ２ｍｍ 的肿瘤组织 随着种植时间的延长， 血管开始向肿瘤方向生长， 最 终形成以肿瘤为中心的“辐辏状”血管床； 体积较大 的种植肿瘤（ 直径 ２￣４ｍｍ） 呈现两期不同的表现： 种 植后 ７２￣９６ｈ 内， 所有种植瘤的体积都有不同程度 的减小； 此后， 肿瘤进入快速生长期， 终平均直径可 达 ５￣７ｍｍ。
Ｒｉａ 等［１４］采用 ＣＡＭ 研究内膜异位囊肿中血管形 成和 ＭＭＰｓ 的表达。收集 ４４ 例 ＩＩＩ￣ＩＶ 期的卵巢内膜 异位囊肿和 １０ 例正常内膜， 用原位杂交方法检测 ＭＭＰ－２ 和－９ 的表达， 同时检测 ＭＶＤ。结果发现： 内膜 异位囊肿的 ＭＶＤ 计数明显高于正常内膜， 微血管定 位在异位内膜细胞附近， 随着分期增加， 浸润深度也 明显增加。检测发现 ＭＭＰ－２ 和－９ 在内膜异位囊肿 中的表达强度明显高于正常内膜， 期别越高， 表达越 强。ＩＶ 期内膜异位囊肿较 ＩＩＩ 期有明显高的血管增生 能力， 在正常内膜中无血管增生反应。上述资料提示 在 ＥＭｓ 中， 血管形成和细胞外基质的降解都与其发 生相关， 且与期别成正相关， 内膜异位细胞和一些 宿主基质细胞在 ＥＭｓ 形成过程中共同发挥着作用。
ＣＡＭ 与肿瘤 ＣＡＭ 模型最初用于肿瘤的浸润、转移和血管形 成的研究， 此后又发展为研究抗血管形成药物的体 内模型［３，４］。Ｋｎｉｇｈｔｏｎ 曾用 ６３２ 只鸡胚系统观察种植 瘤在 ＣＡＭ 中的生长及血管形成全过程， 其发现对 构建模型有重要指导意义。首先， 种植时机的选择与
收稿日期： ２００４－ １０－ １８ 修回日期： ２００５－ ０３－ ３０
的生物学特性使其日趋广泛的应用于各类研究中［１６，１７］。
有学者以 ＣＡＭ 为体内模型研究 ＶＥＧＦ 及其受体的
相互作用机制［１８］， 还有学者以 ＣＡＭ 为模型研究低氧
对各个器官发育的影响［１９］。
参考文献
１ Ｒｉｂａｔｔｉ Ｄ， Ｎｉｃｏ Ｂ， Ｖａｃｃａ Ａ， ｅｔ ａｌ． Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｉｏｃ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｂｅｄ： ａ ｕｓｅｆｕｌ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ｓｔｕｄｙｉｎｇ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ａｎｔｉ－ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｖｉｖｏ． Ａｎａｔ Ｒｅｃ， ２００１， ２６４（４）： ３１７－３２４
种植瘤的生长变化与血管形成密切相关， 同时 受血管形成机制调控。肿瘤生长与血管的形成主要 分成 ３ 期。初期（ 无血管期） ： 种植后 ２４ｈ， ＣＡＭ 的血 管尚未长入到种植瘤中， 肿瘤源性血管开始消失， ４８ｈ， 种植瘤中心部位开始出现坏死， 外周细胞仍存 活， 此期肿瘤生长缓慢， 营养物质的供给和代谢物的 排出都以扩散的形式完成。二期（ 新生血管期） ： 始于 种植后 ７２ｈ， 组织学检查可见 ＣＡＭ 的血管长入种植 瘤内。三期（ 快速生长期） ： 始于新生血管化完成后， 整个肿瘤中遍布新生血管， 通过血液系统完成物质 交换， 提供肿瘤生长所需的营养成份和排泄代谢产 物。种植后 ７￣８ｄ， 种植瘤中心开始退化萎缩， 逐渐被 鸡胚的间质细胞所取代。
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鸡胚绒毛尿囊膜在抗血管形成研究中的应用
中国医学科学院中国协和医科大学北京协和医院妇产科（ １００７３０） 王含必综述 郎景和审校
摘 要 鸡胚绒毛尿囊膜（ＣＡＭ）是研究血管形成与抗血管形成的理想体内模型。鸡胚血管网到第８ｄ发育成毛细 血管丛， 快速增长持续到 第１１ｄ， 而 此 时 机 体 的 免 疫 系 统 尚 未 完 全 建 立 ， 对 异 物 的 刺 激 不 产 生 排 异 反 应 ， 便 于 观 察 诱 导剂及抑制剂对机体免疫的影响。ＣＡＭ已广泛的应用于肿瘤的研究中， 包括对血管形成及抗血管形成的研究。目前 ＣＡＭ用于研究血管形成在子宫内膜异位症（ ＥＭｓ） 发病中的作用机制， 是理想的研究ＥＭｓ发病原因的体内模型。
关键词 鸡胚绒毛尿囊膜 肿瘤 子宫内膜异位症
生理情况下， 新生血管形成主要发生在胚胎发 育和女性月经周期内膜修复过程； 在某些病理情况 下， 如损伤修复、炎症等也常伴发血管生成， 特别是 肿瘤生长和转移与血管生成密切相关。早在 １９１２年， 鸡 胚 绒 毛 尿 囊 膜 （ ＣＡＭ） 模 型 首 次 成 功 用 于 肿 瘤 研 究。鸡胚对抑制血管生成的药物较敏感， 是一种较理 想的研究抗血管形成药物的筛选模型， 是研究血管 形成和抗血管形成的最佳体内模型之一［１］。
ＣＡＭ 与子宫内膜异位症（ ＥＭｓ ） ＥＭｓ 是 指 功 能 性 子 宫 内 膜 在 子 宫 腔 以 外 的 部 位 生 长 。 目 前 在 众 多 ＥＭｓ 发 生 学 理 论 中 ， １９２７ 年 Ｓａｍｐｓｏｎ 提出的经血逆流 种 植 学 说 被 广 泛 接 受 ， 但 内膜细胞种植过程中的黏附、侵袭及血管形成机理 至今不甚明了。自 ２１ 世纪初， 尝试构建鸡胚 ＥＭｓ 模 型并将其应用于相关研究中。 Ｍａａｓ 等［６］利用鸡胚模型研究子宫内膜细胞的种 植侵袭过程。将子宫内膜细胞种植到 ＣＡＭ 后， 通过 免疫组化和免疫荧光技术检测发现， 种植 ２４ｈ 后， 内 膜 的 腺 细 胞 和 基 质 细 胞 与 ＣＡＭ 的 间 质 细 胞 相 接 触； ４８ｈ 后， 内膜腺细胞和基质细胞穿过绒毛上皮层 向 ＣＡＭ 的间质层浸润； ７２ｈ 后， 镜下可见腺细胞和 基质细胞融入到 ＣＡＭ 的组成细胞中。该实验证实 内膜腺细胞及基质细胞都具有侵袭力， 但腺细胞的 作用需通过基质细胞来实现， 也即内膜腺细胞和基 质细胞共存是使内膜具有侵袭力、形成内膜异位样 病灶的基础， 同时也提出了内膜细胞异位种植的可 能过程。在实验中还可见 ＣＡＭ 血管渗透到子宫内 膜种植灶中， 提示血管形成在 ＥＭｓ 形成过程中可能 起到一定作用。 大量临床观察发现， 在腹腔内膜异位种植灶周围 有大量新生血管形成［６］， 血管内皮生长因子（ ＶＥＧＦ） 在 ＥＭｓ 子宫内膜中表达增加提示 ＥＭｓ 患者的血管 形成能力强于非 ＥＭｓ 患者［７］。有学者尝试将 ＣＡＭ 用 于 ＥＭｓ 血管形成的研究中［８］。Ｍａａｓ 等［９］以 ＣＡＭ 作为 ＥＭｓ 血管形成的体内模型， 发现 ＥＭｓ 患者腹水促血 管生成的能力明显高于对照组， 巨噬细胞分泌的肿 瘤坏死因子 α （ ＴＮＦ－α） 在血管形成中也发挥了作 用。因此认为， 阻断血管形成在 ＥＭｓ 的治疗中可能 成为一条新的治疗途经。Ｋｒｅｓｓｉｎ 等［１０］将非 ＥＭｓ 患者 的子宫内膜组织种植到 ＣＡＭ 上， 分别收集 ０，２４，４８ 和 ７２ｈ 的标本， 用 ＲＴ－ＰＣＲ 检测 ＶＥＧＦ ｍＲＮＡ 在不
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同时期的表达差异， 结果发现种植 ７２ｈ 后 ＶＥＧＦ１６５ ｍＲＮＡ 的表达较 ２４ｈ 增加了 １０ 倍， 在实验中未涉及 对血管增生反应的检测。
Ｄｒｅｎｋｈａｈｎ 等［１１］采用 ＣＡＭ ＥＭｓ 模型研究血管形 成 蛋 白 １， ２（ ＡＮＧＰＴ１／ＡＮＧＰＴ２） 在 子 宫 内 膜 细 胞 异 位种植血管形成中的作用。将收集的子宫内膜种植 到 ＣＡＭ 上， 分别培养 ０， ２４， ４８ 和 ７２ｈ， 采用 ＲＴ－ＰＣＲ 的检测方法检测两种蛋白在核酸水平的表达， 免疫 组化的方法检测蛋白水平的表达， 结果发现两种蛋 白的表达普遍存在， 但在 ２４ｈ 内 ＡＮＧＰＴ２／ＡＮＧＰＴ１ 的比例有明显的增加， 提示 ＡＮＧＰＴ２ 可能是血管形 成中的优势蛋白。另外还证实内膜异位种植过程中 血管形成活跃， 血管形成蛋白在内膜异位的形成中 很可能承担重要角色。
除了血管形成蛋白、ＶＥＧＦ 外， ＭＭＰｓ 也与 血 管 形成密切相关， 是细胞外基质调节的关键酶。Ｎａｐ 等［１２］ 将人类内膜种植到 ＣＡＭ 上形成 ＥＭｓ 样病灶， 采用 免疫组化的方法检测基质金属蛋白酶 （ ＭＭＰｓ） 的表 达， 同时抑制其作用， 结果发现 ＭＭＰｓ 在各种组织中 都有表达， 抑制 ＭＭＰ－１， －２， －３， －７ 和－１３ 的作用明 显 抑制了病灶的形成。同时证实 ＭＭＰｓ 在 ＥＭｓ 病灶早 期形成过程中起重要作用。Ｗｏｌｂｅｒ 等［１３］构建 ＣＡＭ 的 ＥＭｓ 模型， 用竞争 ＰＣＲ 方法检测 ＭＭＰ－１（ 间质胶原 酶） 和 ＭＭＰ－２（ 白明胶酶 Ａ） ｍＲＮＡ 的表达。结果发 现 ＭＭＰ－１ 的 ｍＲＮＡ 表达明显增加， 而后者无明显 的改变， 提示这些酶在异位内膜碎片的血管形成和 种植过程中可能发挥着不同作用。
Ｍａｌｉｋ 等［１５］以 ＣＡＭ 作为 ＥＭｓ 体内模型， 探索荧 光剂用于 ＥＭｓ 的早期诊断。其将含有荧光剂（ＡＬＡ） 的子宫内膜组织种植到鸡胚中， 结果发现最佳种植 时期是胚龄 ７￣９ｄ， 最佳收集标本的时间是种植 后
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３￣５ｄ。种植灶的荧光强度随着种植时间的延长而增
加， 种植后 １０￣１４ｈ 达到高峰， 而非 ＥＭｓ 者子宫内膜
的荧光强度明显弱于 ＥＭｓ 者， 提示 ＡＬＡ 可以选择
性蓄积在异位子宫内膜中， 该方法为 ＥＭｓ 早期诊断
开辟了新思路。
ＣＡＭ 在肿瘤和 ＥＭｓ 研究中， 尤其在血管形成
与抗血管形成的研究中发挥着重要作用。由于鸡胚
在前述实验基础上， 有学者利用 ＣＡＭ 模型进 行肿瘤相关研究。Ａｍｉｎ 等［５］以 ＣＡＭ 为模型研究甘氨 酸的作用， 发现甘氨酸抑制了 ５０％以上的胚胎血管 形成， 减少了 ３０％以上的损伤修复血管形成中所需
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要的纤维蛋白的形成， 使微血管密度明显下降。还使 乳 腺 癌 的 生 长 减 少 １５％ ， 微 血 管 密 度 （ ＭＶＤ） 下 降 ２０％。提示甘氨酸可抑制胚胎血管形成， 抑制损伤修 复和肿瘤生长。用 ＣＡＭ 模型研究抗 ＶＥＧＦ 抗体在 肿瘤治疗中的作用机制， 以骨肉瘤 ＯＳ￣７２３ 细胞构 建鸡胚模型， 将抗 ＶＥＧＦ 抗体作用于种植的肿瘤细 胞后计数 ＭＶＤ， 结果发现肿瘤细胞凋亡与血管形成 呈显著负相关， 高度血管化的肿瘤其凋亡指数显著 低于低度血管化的肿瘤， 而在增殖指数上无明显差 异。提示阻断肿瘤血管形成可促进肿瘤细胞的凋亡 以达到抑制肿瘤生长的目的。
ＣＡＭ 及血管网的发育 鸡 胚 有 ４ 层 胚 膜 （ 卵 黄 囊 膜 、羊 膜 、浆 膜 、尿 囊 膜） 和 ２ 套血管网（ 卵黄囊血管网、尿囊膜浆膜血管 网） 。鸡胚尿囊出现在孵育的第 ３．５ｄ， 在孵育 ４￣１０ｄ， 尿囊腔迅速增大至胚外体腔并包围羊膜， 以后尿囊 外壁与绒毛膜紧贴形成尿囊绒毛膜。中胚层的双层 结构由绒毛膜和尿囊膜组成， 在这两层中形成丰富 的血管网。不成熟的血管散在分布于中胚层， 直到第 ８ｄ 形成毛细血管丛， 覆盖在绒毛上皮细胞表面。毛 细血管快速增殖持续到第 １１ｄ， 此后内皮细胞有丝 分裂指数迅速下降［２］， 到第 １８ｄ， 血管系统最终形成。 鸡胚孵化至第 ８ｄ 时， 胚膜和血管网的发育已趋 稳定， 而机体免疫系统尚未完全建立， 此时对各种异 物几乎不产生排斥反应， 便于观察各种诱导剂和抑 制剂对血管生成的影响。鸡胚的胸腺细胞在第 １１ｄ 出现， 细胞介导的免疫反应在第 １３￣１４ｄ 出现， 当鸡 胚的免疫系统发育完善后， 对种植的异物产生排异， 使其褪化萎缩。