实验24-黑曲霉发酵生产柠檬酸
教案实验四 黑曲霉发酵生产柠檬酸
实验四黑曲霉发酵生产柠檬酸【目的要求】1. 掌握实验室菌种种子生产方法。
2. 掌握柠檬酸发酵原理及过程，掌握柠檬酸液体发酵及中间分析方法。
3. 熟悉并记录黑曲霉培养过程中培养基中基质的变化与产物的形成情况；4. 掌握钙盐法提取柠檬酸的原理与方法。
【基本原理】黑曲霉发酵生产柠檬酸实验中需要大量活化的孢子，其制备是采用麸皮培养基中保藏的黑曲霉孢子，在新的麸皮培养基上于适当的温度下活化并大量繁殖，从而产生大量活化孢子。
黑曲霉发酵法生产柠檬酸的代谢途径被认为是：黑曲霉生长繁殖时产生的淀粉酶、糖化酶首先将薯干粉或玉米粉中的淀粉转变为葡萄糖；葡萄糖经过酵解途径（EMP）转变为丙酮酸；丙酮酸氧化脱羧形成乙酰辅酶A，然后在柠檬合成酶的作用下生成柠檬酸。
黑曲霉在限制氮源和锰等金属离子条件下，同时在高浓度葡萄糖和充分供氧的条件下，TCA 循环中的酮戊二酸脱氢酶受阻遏，TCA 循环不能充分进行，使柠檬酸大量积累并排出菌体外。
其理论反应式为：C6H12O6+1.5O2→C6H8O7+2H2O除了含有大量柠檬酸外，还有大量的菌体，少量没有被黑曲霉利用的残糖、蛋白质、脂肪、胶体化合物以及无机盐类等。
柠檬酸提取就是从成分复杂的发酵液中分离提纯获得柠檬酸。
从柠檬酸发酵液中提取柠檬酸的方法主要有：钙盐-离子交换法、溶剂萃取法、“吸交”法、离子色谱法等。
目前国外生产主要采用钙盐-离子交换法和溶剂萃取法；国内生产主要采用钙盐-离子交换法，“吸交”法和离子色谱法正在推广中。
钙盐法首先采用过滤或超滤除去发酵液中的菌丝体等不溶残渣，然后在澄清过滤液中加入碳酸钙（或氢氧化钙）发生中和反应，生成难溶的柠檬酸钙沉淀，利用在80-90℃下柠檬酸钙的溶解度极低的特性，通过过滤（或离心）将它与可溶性的糖、蛋白、氨基酸、其它有机酸、无机离子等杂质分离开，用80-90℃热水反复洗涤柠檬酸钙，除去残糖和其他可溶性杂质，经过滤（或离心）获得较净的柠檬酸钙，然后在洗净的柠檬酸钙中缓慢地加入稀硫酸进行酸解反应，生成柠檬酸和硫酸钙沉淀，经过滤（或离心）除去硫酸钙沉淀，获得粗制的柠檬酸。
黑曲霉产柠檬酸
柠檬酸发酵工艺条件的优化摘要柠檬酸（2-羟基丙烷三羧酸），是重要的工业原料。
可从植物原料中提取，也可由糖进行发酵制得。
实验研究了不同硫酸铵浓度分别对黑曲霉摇瓶发酵和实罐发酵生产柠檬酸的影响。
在菌浓度、发酵过程PH、酸度、残糖、温度在发酵过程中的变化几个方面对实罐和摇瓶发酵进行了相关比较。
结果表明：1）摇瓶发酵的最适硫酸铵浓度为0.4%；实罐发酵最适硫酸铵浓度为0.5%，实罐发酵时硫酸铵浓度过高将产生大量泡沫不利发酵；2）实罐发酵与摇瓶发酵在起始含糖量、菌浓度及发酵温度相同的情况下，随发酵进行，摇瓶发酵的温度更稳定，两者的菌浓度、残糖、PH值变化规律高度一致，酸度变化规律基本一致。
另外实验还就温度对黑曲霉发酵生产柠檬酸的影响作用进行了探讨，结果表明实罐发酵的最适温度约为35℃，温度过高会导致发酵液水分流失过多而使发酵失败。
1. 课题背景1.1柠檬酸简介柠檬酸（citric acid）是生物体主要代谢产物之一，在自然界中分布很广，主要存在于柠檬、柑橘、菠萝、梅、李、梨、桃、无花果等果实中，尤以未成熟者含量居多。
柠檬酸又名枸橼酸，学名2-羟基丙烷三羧酸、2-羟基丙烷-1,2,3-三羧酸.分子式：C6H8O7 （相对分子质量：192.13）物理性质：无色透明或半透明晶体，或粒状、微粒状粉末，虽有强烈酸味，但令人愉快，稍有涩味。
极易溶于水，溶解度随温度的升高而增大。
化学性质：从结构上讲柠檬酸是一种三羧酸类化合物，并因此而与其他羧酸有相似的物理和化学性质。
加热至175°C时它会分解产生二氧化碳和水，剩余一些白色晶体。
柠檬酸是一种较强的有机酸，有3个H+可以电离；加热可以分解成多种产物，与酸、碱、甘油等发生反应。
1.2柠檬酸用途柠檬酸被称为第一食用酸味剂，极广泛地用作酸味剂、增溶剂、缓冲剂、抗氧化剂等，用于饮料、糖果、酿造酒、冰淇淋、酸奶、罐头食品、豆制品与调味品等的生产中。
另外，在药物、美容品、化妆品工业上也有着重要的应用。
黑曲霉产柠檬酸最适发酵条件的探讨
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１材料与方法 ．
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【 键词 】 黑 曲霉 关 柠檬酸 发 酵 条件 添 加 剂 ， ５０×１４个 ／ ｌ接 入 菌 种 ， 床 转 速 ３ ０ 按 ． ０ ｍ 摇 ０ ｒ／ｍ ｎ 温 度 ３ ℃ ｉ， ４ 培 养 ４ ｈ后 记 录产 酸情 况 。 ８
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实验4 柠檬酸发酵
实验4 柠檬酸发酵及提取及精制1.实验目的与要求：了解利用黑曲霉生产柠檬酸的原理与流程，掌握柠檬酸的发酵生产方法。
了解树脂提纯及精制柠檬酸的方法，进一步学习并掌握离子交换法的操作过程。
2.实验主要内容：本实验以糖为发酵原料，黑曲霉为产生菌。
黑曲霉产柠檬酸多，耐酸力强。
ph1.6～1.7时尚能生长。
且酸度大时产生葡萄糖酸、草酸等副产物较少，故进行柠檬酸发酵时，培养液以在pH2-3为宜。
在一般发酵中，均产生多种酸，其中，低碳链的直链脂肪酸如甲酸、乙酸等称为挥发酸，而乳酸、柠檬酸等称为非挥发酸。
挥发酸和非挥发酸的总和称总酸。
酸的测定方法常采用中和法、电位滴定法及比色法等。
若待测液色泽很深，可采用外指示剂法。
本试验用中和法测定柠檬酸发酵中的总酸。
柠檬酸的定性检验用Deniges 试剂。
发酵完后，利用树脂对柠檬酸进行提纯及精制。
3.实验所需仪器设备：三角瓶、酸式滴定管、烧杯、吸管、水浴锅、恒流泵、树脂交换柱、收集器、旋转蒸发仪、酒精灯、滤纸、漏斗、碱滴定管、铁台、蝴蝶夹、酚酞指示剂、布氏漏斗、抽滤纸、抽滤水泵、离心机和离心管、滴管、天平、玻璃棒、牛角勺、广泛pH 试纸4.实验所需试剂（每班所需试剂量）：阴离子交换树脂2000g、阳离子交换树脂2000g、碳酸钙500g、硫酸500g1、黑曲霉斜面菌种3支、硝酸铵200g，KH2P04 200g，MgS04 250g，蔗糖2000g， HCl500ml、NaOH500ml 、H2S04ml5.实验步骤：（1）树脂预处理分别称取一定量的树脂(阳离子交换树脂和阴离子交换树脂)，清洗漂去杂质，放在交换柱中，先用1mol／LNaOH，后用水洗，再用1mol／L HCl，最后用水洗至pH≥4。
每次所用溶液体积为树脂体积的3倍，流速的大小为柱截面积，两种树脂的预处理方法相同。
（2）柠檬酸发酵1）接种取柠檬酸发酵培养液3瓶，用接种环向每瓶接入黑曲霉孢子2～3环，25―28℃摇床培养5～7d。
黑曲霉生产柠檬酸的发酵工艺流程
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黑曲霉产柠檬酸工艺条件的优化解析
生物与化学工程学院专业实验报告题目黑曲霉产柠檬酸发酵工艺条件的优化学生姓名：王一专业班级：生物工程2012010302班学号：1201815076课程名称：发酵生产技术综合实验指导教师：李信义日期：2013.6.2--2013.6.29黑曲霉发酵产柠檬酸工艺条件的优化[摘要]：柠檬酸是生物体主要代谢产物之一，在自然界中分布很广，主要存在于柠檬、柑橘、菠萝、梅、李、梨、桃、无花果等果实中，尤以未成熟者含量居多。
柠檬酸又名枸橼酸,分子式为C6H8O7,物理性质：无色透明或半透明晶体，或粒状、微粒状粉末，有强烈酸味，稍有涩味；极易溶于水，溶解度随温度的升高而增大。
化学性质：从结构上讲柠檬酸是一种三羧酸类化合物，加热至175°C时它会分解产生二氧化碳和水，剩余一些白色晶体。
柠檬酸是一种较强的有机酸，有3个H+ 可以电离；加热可以分解成多种产物，与酸、碱、甘油等发生反应。
同时柠檬酸，是重要的工业原料。
可从植物原料中提取，也可由糖进行发酵制得。
本实验研究了不同接种量、温度、PH、发酵有效体积、溶解氧对黑曲霉产柠檬酸发酵的效率，已选出最适宜黑曲霉发酵产酸的条件。
[关键词]：黑曲霉柠檬酸发酵条件优化[Abstract]：Citric acid is one of the main metabolites of the organism, is widely distributed in nature, mainly in lemon, orange, pineapple, peach, pear, plum, fig fruit, especially in the most immature content. citric acid or citric acid. Molecular formula is 786O H C ,physical properties: colorless transparent or translucent crystal, or granular, granular powder, although have strong sour, slightly astringent. Easily soluble in water, the solubility increases with the increasing of temperature. Chemical properties: citric acid from the structure is a kind of three carboxylic acid compounds, heated to 175°C it will decompose to produce carbon dioxide and water, the remaining number of white crystal. Citric acid is a strong organic acid, 3 H ionization; heating can be decomposed into a variety of products, reacts with the acid, alkali, glycerin etc..At the same time, citric acid, is an important industrial raw materials. It can be extracted from plant materials, can also be prepared by sugar fermentation. The experimental study of different inoculation quantity, temperature, PH, dissolved oxygen, fermentation volume on the efficiency of citric acid fermentation of Aspergillus niter, has to choose the most suitable fermentation conditions of Aspergillus niter.[Keywords]：Aspergillus niter Citric acid Fermentation Conditions Optimization目录1.综述 (1)2.实验仪器药品材料及分析方法 (1)2.1实验设备 (1)2.2实验试剂及材料 (1)2.3菌株 (1)2.4分析方法 (1)3.实验设计 (2)3.1培养基的制备 (2)3.2斜面种子和液体种子的制备 (2)3.3温度对柠檬酸发酵的影响 (2)3.4溶解氧对柠檬酸发酵的影响 (2)3.5接种量对产柠檬酸发酵的影响 (2)3.6发酵液有效体积对产柠檬酸发酵的影响 (3)3.7初始PH值对产柠檬酸发酵的影响 (3)3.8柠檬酸的测定 (3)4.结果与分析 (3)4.1不同初始PH的柠檬酸产率 (3)4.2不同接种量的柠檬酸产率 (4)4.3不同温度的产柠檬酸率 (5)4.4不同发酵液有效体积的产柠檬酸率 (6)4.5不同溶氧的产柠檬酸率 (7)4.6正交实验及结果 (7)5.结论与展望 (8)5.1结论 (8)5.2展望 (8)6.参考文献 (8)7.感受 (9)1.综述柠檬酸（citric acid）又名枸橼酸。
实验七黑曲霉发酵柠檬酸
需要加强黑曲霉发酵柠檬酸的 应用研究，探索其在不同领域
的应用潜力。
感谢您的观看
THANKS
06
结论与展望
本实验的结论
黑曲霉发酵柠檬酸实验表明，在适宜的条件下， 黑曲霉能够有效地将葡萄糖转化为柠檬酸。
通过优化培养基成分和发酵条件，可以提高柠檬 酸的产量和产率。
本实验为黑曲霉发酵生产柠檬酸提供了理论依据 和技术支持，为工业化生产提供了参考。
黑曲霉发酵柠檬酸的应用前景
01
柠檬酸是一种重要的有机酸，广泛应用于食品、医药、化工等 领域。
柠檬酸的生物合成途径主 要涉及糖酵解、三羧酸循 环和柠檬酸循环三个过程。
丙酮酸在丙酮酸羧化酶的 作用下生成草酸，草酸进 一步被还原成柠檬酸。
ABCD
在糖酵解过程中，葡萄糖 被降解为丙酮酸，产生 ATP和NADH。
柠檬酸在三羧酸循环中被 氧化成二氧化碳和水，同 时释放能量供细胞代谢使 用。
影响柠檬酸发酵的因素
溶氧量控制
通过控制发酵罐内的搅拌速度和通气 量来调节溶氧量，以确保黑曲霉的正
常生长和代谢。
pH值监测与调节
定期监测发酵液的pH值，并适时添 加酸或碱来调节pH值至适宜范围。
泡沫控制
通过添加消泡剂或调节搅拌速度来控 制发酵过程中的泡沫。
柠檬酸的提取与测定
提取
发酵结束后，将柠檬酸菌泥与发酵液 分离，然后用有机溶剂将柠檬酸提取 出来。
01
02
03
营养物质
碳源、氮源、磷源等营养 物质的种类和浓度对柠檬 酸的产量有显著影响。
温度和pH值
适宜的温度和pH值可以提 高黑曲霉的发酵活性和柠 檬酸的产量。
溶氧浓度
溶氧浓度对柠檬酸的产量 也有影响，过高或过低的 溶氧浓度都不利于柠檬酸 的积累。
实验24黑曲霉发酵生产柠檬酸
实验24⿊曲霉发酵⽣产柠檬酸⿊曲霉发酵⽣产柠檬酸柠檬酸（citric acid ）⼜名枸橼酸，学名2-羟基丙烷三羧酸（2-hydroxytricarboxylic acid ）、2--羟基丙烷-1，2，3-三羧酸（2-hydroxy propane-1，2，3-tricarboxylic acid ）。
商品柠檬酸有两种形式：⼀种为⽆⾊透明，有光泽的含⼀个结晶⽔的晶体，其分⼦式为C 6H 807·H 2O,相对分⼦质量为210.14。
另⼀种为⽆⾊半透明全对称晶体的⽆⽔柠檬酸，分⼦式为C 6H 8O 7，相对分⼦质量192.13。
柠檬酸因⽆毒、⽔溶性好、酸味适度、易被吸收和价格低廉等优点，被⼴泛应⽤于⾷品、医药、化⼯、化妆品、清洗（洗涤）、建筑等⼯业部门。
1893年前，⼈们主要从柑橘、菠萝和柠檬等果实中制取柠檬酸。
1893年后发现微⽣物可产⽣柠檬酸，1951年美国Miles 公司⾸先采⽤深层发酵法⽣产柠檬酸。
我国在20世纪40年代初期开始浅盘发酵⽣产柠檬酸，60年代开始采⽤薯⼲粉直接深层发酵法⽣产柠檬酸。
能够产⽣柠檬酸的微⽣物很多，青霉、⽑霉、⽊霉、曲霉、葡萄孢菌及酵母中的⼀些菌株都能够利⽤淀粉质原料或烃类⼤量积累柠檬酸。
⾄今世界上消费的柠檬酸主要采⽤发酵法，⽽最具商业竞争优势的是采⽤⿊曲霉（Asp.niger ）、⽂⽒曲霉(Asp.Wentii )和解脂假丝酵母等菌种的深层液体发酵。
⽬前国内外普遍采⽤⿊曲霉的糖质原料发酵⽣产柠檬酸。
本实验以薯⼲粉或⽟⽶粉为原料，采⽤⿊曲霉，通过深层液体（摇瓶）发酵产⽣柠檬酸。
柠檬酸发酵液经过滤除去菌丝体和残存杂质，过滤液中加⼊碳酸钙中和，⽣成柠檬酸钙沉淀。
将获得柠檬酸钙再⽤稀硫酸酸解⽣成柠檬酸和硫酸钙沉淀⽽制得粗制柠檬酸液，粗制柠檬酸液再经活性碳脱⾊、离⼦交换脱盐制得精制柠檬酸液。
精制柠檬酸液经真空浓缩、结晶制得符合英国药典BP-98版标准的⽆⽔或⼀⽔柠檬酸。
黑曲霉利用香蕉提取物生产柠檬酸
中文译文黑曲霉利用香蕉提取物生产柠檬酸摘要：将香蕉提取物作为碳源进行柠檬酸生产的实验。
使用的是微生物黑曲霉菌株。
对不同类型的生物反应器进行了测试：泡沫柱反应器和搅拌反应器，对于搅拌反应器两种不同类型的叶轮在不同转速的条件下进行了研究：六片桨叶的涡轮桨和赖特宁架A310涡轮。
在测试过程中对各个参数进行了测量：生化性能（生物量w/v 和霉的直径）、化学性能（总糖和柠檬酸的浓度）和物理性能（溶解氧分压DOT ；氧摄取率OUR ；粘性；气体/液体的体积传质系数，a K L )。
结果表明柠檬酸的产量与微生物的形态有严格的联系；霉必须以颗粒的形式生长，如在泡沫柱反应器总提供温和的环境中进行；另外，随着机械的搅拌，霉的颗粒状态被破坏，霉的形态变为丝状，并且柠檬酸的产量明显减少。
对发酵结果进行讨论，以达到更好的了解影响扩大生产规模的主要因素。
关键词：柠檬酸、黑曲霉、混合、泡沫柱反应器、搅拌器、叶轮、农业产品、物理参数注释：L C 溶解氧浓度（千克/立方米）*L C 平衡溶解氧浓度（千克/立方米）LS C 校准溶解氧浓度（千克/立方米）D 叶轮直径（mm ）D 颗粒的平均直径mmDOT 溶解氧分压DOT* 平衡溶解氧分压cdt dDOT ⎥⎦⎤⎢⎣⎡ 溶解氧分压的变化在图表2区域c 中(1/s)a DOT 溶解氧分压在图表2的区域a 中va G 平均流速梯度a K L 体积传质系数（1/s)N 搅拌转速（每分钟转数）P N 功率数Q N 抽号OUR 氧摄取率（千克/立方米·小时）P 柠檬酸浓度（千克/立方米）0P 体积功耗（瓦/立方米）Q 体积气体流速RI 流变指数S 底物浓度（千克/立方米）T 时间（秒，小时，天）T 温度（℃）X 生物量浓度(千克/立方米）S X Y / 生物产量S P Y / 柠檬酸产量液体表观粘度备注：o 初始条件f 最后条件简介：最近在先进的工业国家，柠檬酸消耗量的增加主要是在食品和制药工业（约占到总需求的70%）方面，以及用于生物降解，用于生物降解的这种性能表明柠檬酸能够代替磷作为洗涤剂从而能控制环境的污染。
黑曲霉的次级产物的提纯
淮北师范大学信息学院07生物工程实验课题：利用黑曲霉生产柠檬酸的实验设计方案设计成员：万纹纹王磊陈晨夏柱宝指导老师：高翔利用黑曲霉生产柠檬酸的实验设计方案实验步骤： 筛选 → 诱变 → 培养基条件 → 发酵→ 产品分离纯化 一、 菌种的筛选：1、 土壤采样：采样人： 万纹纹 王磊 陈晨 夏柱宝 采样时间：采样地点： 环境条件：用取样铲，将表层5cm 左右的浮土除去，取5～25cm 处的土样10～25g ，装入事先准备好的塑料袋内扎好。
应在三处不同的地点进行采样，将采集好的样品带回实验室备用。
2、 倒平板： 将PDA 培养基加热融化，待冷却至55-60℃倒平板15皿。
PDA 培养基配方：马铃薯 200g 蔗糖 20g 琼脂 20g 蒸馏水 1000ml PH 自然3、 制备土壤稀释液：各称土样10g ，迅速倒入带玻璃珠的90mL 无菌水的三角瓶中(玻璃珠用量以充满瓶底力最好)，振荡约20min ，使土样充分打散，用一支1ml 无菌吸管从中吸取1ml 土壤悬液加入盛有9ml 无菌水的大试管中充分混匀，然后在用无菌吸管从此试管中吸取1ml 加入另一盛有9ml 无菌水的试管里，混合均匀，以此类推制成110-、210-、310-、410-、510-、610-不同稀释度的土壤溶液。
4、 涂布：将倒好平板的底面用记号笔标上410-、510-和610-三种稀释度，然后用无菌吸管分别由410-、510-和610-三管土壤稀释液中各吸取0.1ml 对号放入已写好稀释度的平板中，用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻地涂布均匀，室温静置5-10min ，使菌液吸附进培养基。
5、 培养： 将涂布好的平板倒置于35℃的培养箱中培养3-5d.6、 挑菌落：黑曲霉形态特征：在固体培养基上，菌落由白色逐渐变至棕色。
孢子区域为黑色，菌落呈绒毛状，边缘不整齐，菌丝有隔膜和分枝，是多细胞的菌丝体，无色或有色，有足细胞，顶囊生成1层或2层小梗，小梗顶端产生一串串分生孢子。
(完整word版)黑曲霉发酵柠檬酸
黑曲霉发酵生产柠檬酸（中北)生物技术18083108 陈园园摘要：黑曲霉,半知菌亚门，丝孢纲,丝孢目，丛梗孢科，曲霉属真菌中的一个常见种。
广泛分布于世界各地的粮食、植物性产品和土壤中，是重要的发酵工业菌种。
大多数曲霉菌如泡盛曲霉、米曲霉、温氏曲霉、绿色木霉和黑曲霉都具有产柠檬酸的能力,而黑曲霉的产酸能力更强。
黑曲霉从土壤中分离培养，土壤来源有要求。
黑曲霉和黑根霉菌种用于发酵产柠檬酸，了解产物发酵生产的机理，柠檬酸发酵的发酵条件，掌握发酵过程步骤,了解产物提取的几种方法,学习利用沉淀法提取柠檬酸的原理,掌握沉淀法提取柠檬酸的方法是本次实验的目的要求。
关键词：黑曲霉、黑根霉、柠檬酸实验材料和试剂:样品：新鲜土壤样品（来源于食堂垃圾堆处)培养基:查氏培养基、马铃薯培养基无菌水：带有玻璃珠装有20mL无菌水三角瓶试剂：400U/mL庆大霉素液、10％苯酚、酚酞指示剂、碳酸钙、0。
1M NaOH 、0.1M H2SO4实验器材:无菌培养皿、培养箱、无菌吸管、无菌离心管、电子天平、记号笔、玻璃涂棒、酒精灯、火柴、圆底烧瓶、抽滤瓶、玻璃棒、抽滤设备、冰箱实验步骤一．黑曲霉、黑根霉菌种的分离和培养1。
黑曲霉的分离培养①土壤样品的采集用取样铲，将表层5cm左右的浮土除去，取5～25cm处的土样10～25g，装入事先准备好灭菌容器内扎好。
编号并记录地点、土壤质地、植被名称、时间及其他环境条件。
一般样品取回后应马上分离，以免微生物死亡。
②制平板：在融化好的查氏培养基中加入链霉素0。
2mL/瓶制3块PDA培养基、3块查氏培养基平板。
③制备土壤稀释液：1。
称取土壤2g，放入18mL带有玻璃珠的无菌水三角瓶中，同时加入3滴10％苯酚溶液，振荡5min，即为稀释10－1的土壤悬液。
2。
另取无菌离心管2支,用记号笔编上10－2、10－3、10－4，再加入0.9mL无菌水.取10－1的土壤稀释液，吸取0。
1mL加入第一只离心管中,并在试管内轻轻吹吸数次，使之充分混匀，即成10－2土壤稀释液。
一种提高黑曲霉发酵生产柠檬酸产量的方法
一种提高黑曲霉发酵生产柠檬酸产量的方法在工业生产中，柠檬酸是一种重要的有机酸，广泛应用于食品、医药、化工等领域。
而黑曲霉是目前最主要的柠檬酸生产微生物，因其高效、高产等优点而备受青睐。
然而，对于黑曲霉发酵生产柠檬酸的方法，如何提高其产量一直是一个备受关注的问题。
本文将从深度和广度的角度，探讨一种提高黑曲霉发酵生产柠檬酸产量的方法。
一、原理解析在进行黑曲霉发酵生产柠檬酸时，关键的生产环节是发酵过程。
而要提高柠檬酸的产量，需要从以下几个方面进行优化：发酵菌株的选取、培养基的配方、发酵条件的控制等。
1. 发酵菌株的选取在选择发酵菌株时，需要考虑其对柠檬酸产量的影响。
一般来说，通过筛选高产菌株，可以有效提高柠檬酸的产量。
选择某些高柠檬酸产量的黑曲霉菌株，能够在一定程度上提高发酵产酸量。
2. 培养基的配方培养基的配方是影响柠檬酸产量的重要因素之一。
通过优化培养基的氮源、碳源、矿物盐等成分比例，可以为黑曲霉提供更适宜的生长环境，从而增加柠檬酸的产量。
添加适量的葡萄糖、氨基酸等营养物质，可以刺激黑曲霉的生长，提高柠檬酸的产量。
3. 发酵条件的控制发酵过程中的温度、pH值、氧气供应等条件的控制对柠檬酸产量也有着重要的影响。
合理的温度和pH值可以促进黑曲霉的生长和柠檬酸的产生，而充足的氧气供应则能提高发酵效率，进而增加柠檬酸的产量。
二、实践应用上述原理虽然看似简单，但在实际应用中却需要综合考虑各个因素，并进行合理的优化。
在进行黑曲霉发酵生产柠檬酸时，可以通过以下方法来提高产量：1. 优化菌株选取首先需要对已有的黑曲霉菌株进行筛选，选择出高产柠檬酸的菌株。
这需要借助研究机构或者实验室的支持，通过采用分子生物学技术等手段进行筛选和改良。
2. 调整培养基配方针对不同菌株、不同生产条件，可以优化培养基的配方，以满足黑曲霉生长和柠檬酸产量的需求。
在生产实践中，可以根据具体情况进行调整，以获得最佳效果。
3. 控制发酵条件在实际生产过程中，通过精确控制发酵过程中的温度、pH值和氧气供应，可以更好地满足黑曲霉生长和柠檬酸产量的需求。
黑曲霉发酵提取柠檬酸
黑曲霉发酵提取柠檬酸实验一黑曲霉保藏菌的复苏实验目的：了解黑曲霉保藏菌的生长状况和保藏菌的活化处理过程。
实验原理：能够产生柠檬酸的微生物很多，青霉、毛霉、木霉、曲霉及葡萄孢霉中的一些菌株都能够利用淀粉质原料大量积累柠檬酸。
目前国内主要利用黑曲霉（Aspergillus niger）通过固体发酵或液体深层发酵生产柠檬酸。
发酵法生产柠檬酸的代谢途径被认为是微生物产生糖化霉首先将淀粉转变为葡萄糖，葡萄糖经过糖酵解途径（EMP）转变为丙酮酸氧化酶氧化生成乙酸和CO2，继而经乙酰磷酸形成乙酰辅酶A，然后在柠檬酸合成酶的作用下乙酰辅酶A和草酰乙酸合成为柠檬酸。
产生的柠檬酸经碳酸钙作用形成柠檬酸钙沉淀，再经稀硫酸作用释放出柠檬酸。
实验步骤：1、观察保藏菌的生长状况，记录PH2、黑曲霉复苏培养基的配制（1）、分别称取蔗糖30g，KNO3 1g, K2HPO4 1g, 麸皮10%，MgSO4.7H2O 0.5g, KCL 0.5g, FeSO4.7H2O 0.01g, 于500ml搪瓷缸中。
（2）、加蒸馏水100ml，调节pH至7.0-7.2（3）、牛皮纸包扎，灭菌3、保藏菌的活化扩增（1）配制5ºBe’麦芽琼脂培养基（2）20℃麦芽汁，糖度为5（3）加0.7%的琼脂（4）加热，使其沸腾（5）分装与试管中，每管约3ml（6）包扎灭菌，制成斜面培养基（7）在超净工作台上划菌，包扎（8）置于28~30℃培养箱中培养实验要求：分析复苏和保藏培养基的区别，原因，营养成分的差异和操作的目的和意义。
并加注参考文献。
实验二黑曲霉一级种子的制备实验目的：了解种子扩大培养的程序，比较复苏均至一级种子的生境变化。
实验原理：黑曲霉在生长过程中不仅需要有充足的营养成分，而且还需要一定的氧气环境等。
通过拌菌等增加菌种与培养基营养成分的充分接触，获得良好的生长。
实验步骤：1、观察活化的保藏菌生长状况，并记录。
2、在超净工作台上，将2-4管/组，活化的保藏菌分别加入约3mL双蒸水。
黑曲霉生产柠檬酸的发酵工艺流程
黑曲霉生产柠檬酸的发酵工艺流程1.首先，选择适当的黑曲霉菌种作为发酵的起始种。
First, choose the appropriate Aspergillus Niger strain as the starting culture for fermentation.2.将黑曲霉菌种接种到含有适量碳源和氮源的发酵基质中。
Inoculate the Aspergillus Niger strain into a fermentation medium containing suitable amounts of carbon and nitrogen sources.3.确保发酵基质的pH值在合适的范围内，通常为3.0至6.0。
Ensure that the pH of the fermentation medium is within the appropriate range, typically between 3.0 and 6.0.4.控制发酵温度在25°C至35°C之间，提供适宜的温度条件。
Control the fermentation temperature between 25°C and 35°C to provide suitable conditions for growth.5.确保发酵过程中的通气充足，以促进微生物的生长和代谢活动。
Ensure adequate aeration during the fermentation processto promote microbial growth and metabolic activity.6.在发酵过程中定期监测黑曲霉的生长情况和产酸量。
Regularly monitor the growth of Aspergillus Niger and the production of citric acid during the fermentation process.7.当黑曲霉的生长达到高峰并且产酸量稳定时，进行收获。
利用黑曲霉发酵产生柠檬酸
利用黑曲霉发酵生产柠檬酸摘要：柠檬酸是目前以微生物发酵生产的重要有机酸之一，它的用途非常广泛，需求日益增长。
目前国内柠檬酸年产量约2.5×105吨，其中半数以上供出口之用。
80年代，我国国内的柠檬酸消费急剧上升，速度远远超过了西方发达国家。
随着人民生活水平的提高，对食品和饮料等含柠檬酸制品的需求量猛增，但就人均消费量来看，我国的柠檬酸消费还是很低的，以用于食品和饮料的柠檬酸为例，我国的人均消费量远低于美国和日本，市场潜力巨大，因此增加柠檬酸生产不仅可以满足国内日益增长的需要，也是换取外汇的重要手段之一。
柠檬酸是葡萄糖经柠檬酸循环而形成的最有代表性的代谢产物，早已发展成大规模的商用生产。
常用的菌种是黑曲霉，产酸浓度在每升发酵液中＞150g。
关键词：黑曲霉，柠檬酸，三羧酸循环1、柠檬酸用途柠檬酸被称为第一食用酸味剂，极广泛地用作酸味剂、增溶剂、缓冲剂、抗氧化剂等，用于饮料、糖果、酿造酒、冰淇淋、酸奶、罐头食品、豆制品与调味品等的生产中。
另外，在药物、美容品、化妆品工业上也有着重要的应用。
它是香料和饮料的酸化剂，在食品和医学上用作多价螯合剂，同时是化学中间体，用于制造药物，也可用于金属清洁剂、媒染剂等。
柠檬酸的盐类、酯类和衍生物也各具特点，用途极为广泛而有良好的发展前景。
2、黑曲霉黑曲霉，子囊菌亚门，丝孢目，丛梗孢科中的一个常见种。
广泛分布于世界各地。
食品工业上用作发酵菌种，如用于食醋生产制曲、麸曲法白酒生产制曲、柠檬酸发酵等，主要是利用此黑曲霉分泌产生淀粉酶、糖化酶、柠檬酸、葡萄糖酸、五倍子酸等的功能；在生物肥料工业上，黑曲霉具有裂解大分子有机物和难溶无机物，便于作物吸收利用，改善土壤结构，增强土壤肥力，提高作物产量的效果。
3、柠檬酸循环（citric acid cycle，CAC）又称三羧酸循环（tricarboxylic acid cycle，TCA），Krebs循环，由诺贝尔获奖者（1953年）、德国学者H.A.Krebs于1937年提出。
黑曲霉发酵生产柠檬酸生产工艺的优化
黑曲霉发酵生产柠檬酸生产工艺优化摘要柠檬酸（2-羟基丙烷三羧酸），是重要的工业原料。
可从植物原料中提取，也可由糖进行发酵制得。
实验研究了不同硫酸铵浓度分别对黑曲霉摇瓶发酵和实罐发酵生产柠檬酸的影响。
在菌浓度、发酵过程PH、酸度、残糖、温度在发酵过程中的变化几个方面对实罐和摇瓶发酵进行了相关比较。
结果表明：1）摇瓶发酵的最适硫酸铵浓度为0.4%；实罐发酵最适硫酸铵浓度为0.5%，实罐发酵时硫酸铵浓度过高将产生大量泡沫不利发酵；2）实罐发酵与摇瓶发酵在起始含糖量、菌浓度及发酵温度相同的情况下，随发酵进行，摇瓶发酵的温度更稳定，两者的菌浓度、残糖、PH值变化规律高度一致，酸度变化规律基本一致。
另外实验还就温度对黑曲霉发酵生产柠檬酸的影响作用进行了探讨，结果表明实罐发酵的最适温度约为35℃，温度过高会导致发酵液水分流失过多而使发酵失败。
关键词：黑曲霉，柠檬酸，硫酸铵，实罐，摇瓶AbstractCitric acid(2-hydroxytricarboxylic acid), is an important industrial raw material. It can be extracted from plant materials or be obtained by fermentation of sugar. In this treatise, we studied the different impacts to the fermentations in erlenmeyers and fermenters which were made by the different concentration of the ammonium sulfate. We compared the differences between the fermentation in erlenmeyers and fermenters by analyzing the concentration of the bacteria, the PH during the fermentation process, acidity, residual sugar and the temperature changes during the fermentation process. The results showed that: 1) the optimum concentration of ammonium sulfate for the fermentation in erlenmeyer is 0.4% while the optimum concentration of ammonium sulfate for the fermentation in fermenters is 0.5%.when the concentration of ammonium sulfate is too high, the fermentation cannot be succeed for the large number of foam. 2) when the initial sugar content, bacteria concentration and fermentation temperature are under the same circumstances, the fermentation in the erlenmeyer has more stable fermentation temperature. Both the two methods of fermentations have the same variation in the concentration of the bacteria ,residual sugar, PH value and changes of acidity. Another experiment also studied the influence to the fermentation in the fermenter made by temperature. The result showed that the production of citric acid from the fermentation of Aspergillus niger is the highest when the temperature is 35℃,when the temperature is too high , fermentation will fail for the excessive loss of water. Keywords：citric acid, Aspergillus niger, fermentation, erlenmeyer, fermenter, ammonium sulfate1. 课题背景1.1柠檬酸简介[1]柠檬酸（citric acid）是生物体主要代谢产物之一，在自然界中分布很广，主要存在于柠檬、柑橘、菠萝、梅、李、梨、桃、无花果等果实中，尤以未成熟者含量居多。
柠檬酸分离提取实验
五、结果及思考题
1、发酵醪液气味如何？ 2、两种发酵醪柠檬酸产率有无差别？为什么 3、柠檬酸提取方法的讨论
发酵工艺学实验——
柠檬酸分离提取实验
中国海洋大学 食品科学与工程学院
一、实验目的
1、了解柠檬酸的提取原理； 2、掌握从发酵液中提取柠檬酸的步骤；
二、实验原理
柠檬酸有称枸枸橼酸，学名2-羟基丙烷三 羧酸或2-羟基丙烷-1，2，3-三羧酸，是水果 中含量极为丰富的一种有机酸。柠檬酸因无毒 水溶性好、酸味适度、易被吸收和价格低廉的 优点，被广泛的应用于食品、医药、化工、洗 涤等工业部门。 本实验以玉米淀粉为原料，采用黑曲霉通 过摇瓶发酵产生柠檬酸，柠檬酸发酵经过过滤 出去菌丝体和残有物质，滤液中加入碳酸钙使 柠檬酸生产沉淀，将获得柠檬酸钙混合液离心 后保留沉淀，家硫酸酸化形成柠檬酸和硫酸钙
沉淀：将滤液放在80℃恒温水浴锅保温一段时间后，加入
Ca(OH)2调ph至6-8，并在80℃下保温30min，于5000r/min下离 ，并在 心10min的柠檬酸钙沉淀 80℃
酸化结晶：将沉淀移至三角瓶中，加入20%的硫酸调节ph
至2.0，用滤纸过滤得清液，取清液进行蒸发结晶，注意控制 结晶的温度和时间，不要使之被焦糖化，冷却后的到柠檬酸 晶体
的沉淀，过滤得粗柠檬酸液，将粗柠檬酸 液进行 蒸发结晶得到柠檬酸晶体，进一步纯化柠 檬酸。
三、实验仪器及试剂
试剂：柠檬酸发酵醪液 碳酸钙固体、 Ca(OH)2、98%浓硫酸 仪器：滤纸、离心机、纱布、电炉、恒 温水浴锅
四、பைடு நூலகம்验步骤
粗提取：将醪液加热至80℃，保温一段时间用8层纱布过滤
除去菌丝体：对照组中因加入了2gCaCO3需要加入配制的20% 的硫酸10ml充分酸化；洗涤纱布，将柠檬酸充分洗下，保留 滤液
产柠檬酸用黑曲霉的选育
产柠檬酸用黑曲霉的选育产柠檬酸用黑曲霉的选育摘要：利用已有菌种进行分离复壮、斜面培养、麸曲培养，然后发酵，检测产生柠檬酸的量，选择产酸能力较高的菌种，在选出菌种的基础上重复此步骤，挑选出产酸能力最大的菌种，通过实验结果，表明第二次选育的菌种的产酸能力比第一次选育出的种子能够提高75.88％。
关键词：黑曲霉薯粉柠檬酸菌种选育引言柠檬酸又名枸橼酸，外观为白色颗粒状或白色结晶粉末，无臭，有强烈的酸味，它存在于天然果实中，其中以柑桔、菠萝、柠檬、无花果等含量较高。
早期柠檬酸是以天然果实为原料加工而成，1893年德国微生物学家Wehmen发现二种青霉菌能够积累柠檬酸，1951年美国Miles公司首先采用深层发酵大规模生产柠檬酸。
我国1968年用薯干为原料采用深层发酵法生产柠檬酸成功，柠檬酸生产由于工艺简单、原料丰富、发酵水平高，至20世纪70年代中期，已初步形成了生产体系。
柠檬酸行业是我国生物农业中的一个重要行业，广泛用于食品、医药、生物工程、精细化工等行业，具有极其广阔的发展前景，而黑曲霉是生产柠檬酸最为重要的菌种，它的产酸能力将直接影响柠檬酸的产量，因此黑曲霉的选育将会产生极大的经济效益。
1)国内外黑曲霉菌种选育研究概况。
产柠檬酸黑曲霉已经历了几十年的诱变(induced mutation)筛选，对常用的诱变处理具有一定的抗性。
中科院有人尝试把离子束应用于产柠檬酸黑曲霉的诱变，并取得了一定效果。
在此影响下，有人做过用低能离子束注入黑曲霉来优化菌种的产酸能力。
李文玲等也曾经用Co<sup>60</sup>～γ射线诱变产柠檬酸的黑曲霉菌种，也取得了很大的成果。
欧美是除中国以外全球第二大柠檬酸主产区，柠檬酸生产企业的经济和技术实力比较雄厚，一般都是集技术开发、工业设计和生产一体化的跨国集团企业，相比中国柠檬酸行业，在技术和管理上具有很大的优势，在菌种的选育方面也比我们的经验丰富。
本文研究的育种方法从我国的国情出发，方法简单易学，效果显著，在目前生产分散，技术水平低的实际情况下具有一定的借鉴和推广意义。
利用黑曲霉发酵产生柠檬酸
利用黑曲霉发酵生产柠檬酸摘要：柠檬酸是目前以微生物发酵生产的重要有机酸之一，它的用途非常广泛，需求日益增长。
目前国内柠檬酸年产量约2.5×105吨，其中半数以上供出口之用。
80年代，我国国内的柠檬酸消费急剧上升，速度远远超过了西方发达国家。
随着人民生活水平的提高，对食品和饮料等含柠檬酸制品的需求量猛增，但就人均消费量来看，我国的柠檬酸消费还是很低的，以用于食品和饮料的柠檬酸为例，我国的人均消费量远低于美国和日本，市场潜力巨大，因此增加柠檬酸生产不仅可以满足国内日益增长的需要，也是换取外汇的重要手段之一。
柠檬酸是葡萄糖经柠檬酸循环而形成的最有代表性的代谢产物，早已发展成大规模的商用生产。
常用的菌种是黑曲霉，产酸浓度在每升发酵液中＞150g。
关键词：黑曲霉，柠檬酸，三羧酸循环1、柠檬酸用途柠檬酸被称为第一食用酸味剂，极广泛地用作酸味剂、增溶剂、缓冲剂、抗氧化剂等，用于饮料、糖果、酿造酒、冰淇淋、酸奶、罐头食品、豆制品与调味品等的生产中。
另外，在药物、美容品、化妆品工业上也有着重要的应用。
它是香料和饮料的酸化剂，在食品和医学上用作多价螯合剂，同时是化学中间体，用于制造药物，也可用于金属清洁剂、媒染剂等。
柠檬酸的盐类、酯类和衍生物也各具特点，用途极为广泛而有良好的发展前景。
2、黑曲霉黑曲霉，子囊菌亚门，丝孢目，丛梗孢科中的一个常见种。
广泛分布于世界各地。
食品工业上用作发酵菌种，如用于食醋生产制曲、麸曲法白酒生产制曲、柠檬酸发酵等，主要是利用此黑曲霉分泌产生淀粉酶、糖化酶、柠檬酸、葡萄糖酸、五倍子酸等的功能；在生物肥料工业上，黑曲霉具有裂解大分子有机物和难溶无机物，便于作物吸收利用，改善土壤结构，增强土壤肥力，提高作物产量的效果。
3、柠檬酸循环（citric acid cycle，CAC）又称三羧酸循环（tricarboxylic acid cycle，TCA），Krebs循环，由诺贝尔获奖者（1953年）、德国学者H.A.Krebs于1937年提出。
黑曲霉发酵柠檬酸合成途径与代谢调控
黑曲霉发酵柠檬酸合成途径与代谢调控摘要:柠檬酸是微生物发酵法生产的重要有机酸,用途极为广泛。
我们厂柠檬酸发酵采用的是黑曲霉深层发酵技术，所以对黑曲霉发酵的过程的了解和分析有利于我们实现对发酵的控制和对发酵现在出现的问题从根本上找到解决的途径。
关键词:柠檬酸;黑曲霉合成途径; 黑曲霉代谢调控发酵有机酸以柠檬酸为主,它占酸味剂市场的70 %左右。
柠檬酸又名枸橼酸，学名α-羟基丙烷三羧酸，是生物体主要代谢产物之一。
化学名称2-羟基丙三羧酸，英文文献俗名citric acid，分子式C6H8O7。
无色或白色晶体，无臭，味极酸，易溶于水和乙醇、微溶于乙醚、水溶液呈酸性反应。
一、柠檬酸发酵菌黑曲霉积累柠檬酸的机理1、黑曲霉柠檬酸生物合成途径上面的生物反应可以通过化学方程式来表示：（1）C6H12O6→2CH3COCOOH+2ATP+2NADH（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）葡萄糖通过酵解生成分子的丙酮酸（2）CH3COCOOH+CO2+ATP→C4H4O5+ADP+Pi丙酮酸在丙酮酸羧化酶的作用下氧化脱掉一个COOH（羧基）生成草酰乙酸（3）CH3COCOOH＋CoA＋NAD＋→CH3C0-CoA＋NADH＋＋CO2丙酮酸在丙酮酸脱氢酶的作用下脱氢生成乙酰coa（即活化的乙酸：CH3COOH）（4）C4H4O5+ CH3COOH→C6H8O7草酰乙酸和乙酰coa缩合成为柠檬酸黑曲霉利用糖类发酵生成柠檬酸,其生物合成途径现普遍认为是:葡萄糖经EMP、HMP 途径降解生成丙酮酸,丙酮酸一方面氧化脱羧生成乙酰CoA ,另一方面经CO2 固定化反应生成草酰乙酸,草酰乙酸与CoA 缩合生成柠檬酸。
(1)生长期与产酸期都存在EMP与HMP途径，前者EMP:HMP=2:1，后者EMP:HMP=4：1(2)黑曲霉柠檬酸产生菌中存在TCA循环与乙醛酸循环，在以糖质原料发酵时，当柠檬酸积累时，TCA和乙醛酸循环被阻断或减弱。
(3)由于TCA和乙醛酸循环被阻断或减弱，草酰乙酸是由丙酮酸（PYR）或磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）羧化生成的。
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黑曲霉发酵生产柠檬酸
柠檬酸（citric acid ）又名枸橼酸，学名2-羟基丙烷三羧酸（2-hydroxytricarboxylic acid ）、2--羟基丙烷-1，2，3-三羧酸（2-hydroxy propane-1，2，3-tricarboxylic acid ）。
商品柠檬酸有两种形式：一种为无色透明，有光泽的含一个结晶水的晶体，其分子式为C 6H 807·H 2O,相对分子质量为210.14。
另一种为无色半透明全对称晶体的无水柠檬酸，分子式为C 6H 8O 7，相对分子质量192.13。
柠檬酸因无毒、水溶性好、酸味适度、易被吸收和价格低廉等优点，被广泛应用于食品、医药、化工、化妆品、清洗（洗涤）、建筑等工业部门。
1893年前，人们主要从柑橘、菠萝和柠檬等果实中制取柠檬酸。
1893年后发现微生物可产生柠檬酸，1951年美国Miles 公司首先采用深层发酵法生产柠檬酸。
我国在20世纪40年代初期开始浅盘发酵生产柠檬酸，60年代开始采用薯干粉直接深层发酵法生产柠檬酸。
能够产生柠檬酸的微生物很多，青霉、毛霉、木霉、曲霉、葡萄孢菌及酵母中的一些菌株都能够利用淀粉质原料或烃类大量积累柠檬酸。
至今世界上消费的柠檬酸主要采用发酵法，而最具商业竞争优势的是采用黑曲霉（Asp.niger ）、文氏曲霉(Asp.Wentii )和解脂假丝酵母等菌种的深层液体发酵。
目前国内外普遍采用黑曲霉的糖质原料发酵生产柠檬酸。
本实验以薯干粉或玉米粉为原料，采用黑曲霉，通过深层液体（摇瓶）发酵产生柠檬酸。
柠檬酸发酵液经过滤除去菌丝体和残存杂质，过滤液中加入碳酸钙中和，生成柠檬酸钙沉淀。
将获得柠檬酸钙再用稀硫酸酸解生成柠檬酸和硫酸钙沉淀而制得粗制柠檬酸液，粗制柠檬酸液再经活性碳脱色、离子交换脱盐制得精制柠檬酸液。
精制柠檬酸液经真空浓缩、结晶制得符合英国药典BP-98版标准的无水或一水柠檬酸。
5.3.1 柠檬酸发酵 1、 实验目的
了解柠檬酸发酵原理及过程，掌握柠檬酸深层液体发酵及发酵过程中生化指标的分析方法。
2、实验原理
黑曲霉发酵法生产柠檬酸的代谢途径被认为是：黑曲霉生长繁殖时产生的淀粉酶、糖化酶首先将薯干粉或玉米粉中的淀粉转变为葡萄糖；葡萄糖经过酵解途径（EMP ）和HMP 途径转变为丙酮酸；丙酮酸由丙酮酸氧化酶氧化生成乙酸和CO 2，继而经乙酰磷酸形成乙酰辅酶A ，然后在柠檬酸合成酶（柠檬酸缩合酶）的作用下生成柠檬酸。
黑曲霉在限制氮源和锰等金属离子条件下，同时在高浓度葡萄糖和充分供氧的条件下，TCA 循环中的ɑ-酮戊二酸脱氢酶受阻遏，TCA 循环变成“马蹄型”,代谢流汇集于柠檬酸处,使柠檬酸大量积累并排出菌体外。
其理论反应式为:
O H O H C O O H C 27862612625.1+→+
柠檬酸理论得率为106.7%，若以含一个结晶水的柠檬酸计为116.7%。
3、实验装置材料与流程 （1） 实验装置与材料
① 实验装置 旋转式摇床、恒温培养箱、高速离心机（4000-6500r/min ）。
② 菌种 黑曲霉（Asp.niger ）柠檬酸生产菌株Co8-27。
③ 材料 麸皮、马铃薯 、薯干粉、蔗糖、玉米粉、大麦芽、大米、琼脂、淀粉酶（中温酶与高温酶）。
④ 器皿 15mL 试管、100mL 三角瓶、2000mL 烧杯、500mL 三角瓶、离心管若干。
⑤ 试剂 0.1429mol/L NaOH 、1%酚酞试剂、斐林甲、乙溶液、0.01%标准葡萄糖溶液。
（2） 试剂
0.1429mol/L NaOH、1%酚酞试剂、斐林甲和乙溶液、0,01%标准葡萄糖溶液、淀粉酶（中
温酶和高温酶）
（3）实验流程
保藏菌株→活化菌株（斜面培养）→200mL三角瓶麸曲培养→500~1000mL三角瓶液体发酵。
（4）斜面培养基:
①马铃薯琼脂培养基去皮马铃薯200g切成小块，加水约500mL，煮沸30min，然后用纱布过滤，滤液加蔗糖20g，琼脂20g，溶化后自来水定容至1000mL，分装于经干热灭菌后的带棉塞试管内，121℃灭菌20min，取出摆成斜面备用。
②麦芽汁琼脂培养基2/3大麦芽加1/3大米磨碎成粉，按麦芽粉:水＝1:4比例加水，置60℃下糖化4h至碘液显示无色，然后离心15min，获得麦芽汁（或取啤酒厂未加酒花的麦芽汁）调整浓度50Brix，添加25g/L琼脂，分装于经干热灭菌后的带棉塞试管内。
于121℃灭菌15~20min，取出摆成斜面备用。
③一级种子（麸曲种子）培养基
含麸皮的查氏培养基（g/L）：蔗糖30；KNO31.0；K2HPO41.0；MgSO4·7H2O 0.5；KCI 0.5；FeSO4·7H2O 0.01；调节pH7.0~7.2，加水定容至1000mL，添加800g麸皮，拌匀至无干粉又无结团，分装入8~10个500mL三角瓶中,塞入8层纱布并包扎好。
于121℃下灭菌30min，趁热摇散，冷却至35℃备用。
麸曲培养基：取新鲜麸皮，用60目筛子筛去细粉，按麸皮:水＝1:1.0～1.3比例加水,拌匀至无干粉又无结团，或用水洗麸皮表面，挤去水分至有水感而水不下滴为宜。
上述麸皮装入500mL三角瓶中，每瓶装80～100g湿料，塞入8层纱布并包扎好。
于121℃下灭菌30min，趁热摇散，冷却至35℃备用。
④摇瓶发酵培养基
取细度为40目以上的薯干粉6～8g，装入500mL三角瓶中，再加入40mL水和5个单位α-淀粉酶（中温）/g薯干粉，于75~80℃下液化15min，瓶口塞入8层纱布包扎好，于110℃灭菌15~20min，冷却备用。
（5）玉米粉液化
取细度为60目以上的玉米粉300g装入2000mL烧杯中，加入1000mL水和7~8个单位α-淀粉酶（高温）/g玉米粉，于80℃液化10min后，继续加热至90℃保温30min，碘检不变色后，再加热到100℃煮沸（5~10min），趁热经过二层纱布过滤，滤液加水冷却并调整糖度至15~20%和蛋白质含量不超过4g/L，取过滤清夜40mL分别装入500mL三角瓶中，瓶口塞入8层纱布包扎好，于121℃灭菌15~20min，冷却备用。
4、实验步骤及方法
（１）种子制备
①斜面种子制备用接种环挑取冰箱保存的斜面菌种一环于斜面培养基上，于35℃恒温箱中培养3~5d，待长满大量黑色孢子后，即为活化的斜面种子。
②孢子悬浮液的制备用无菌移液管吸取5mL无菌水至黑曲霉斜面上，用接种环轻轻刮下孢子，装入含有玻璃球的三角瓶中，盖好塞子振荡数分钟。
每支斜面的孢子悬浮液可接2~3瓶麸曲三角瓶。
③吸取孢子悬浮液2mL接入上述麸曲种子培养基中，然后摊开纱布、扎好，并在掌心轻轻陪拍三角瓶，使孢子与培养基充分混合，于30~32℃下恒温培养1d后，再次拍匀，于35℃下培养，每隔12~24h摇瓶一次，孢子长出后停止摇瓶，这样继续培养3~4d，即成种曲。
（２）摇瓶发酵培养
将麸曲孢子（或直接将斜面种子）接种于上述薯干粉或玉米粉的摇瓶发酵培养基中。
接
种量：一支斜面接4~5瓶，一瓶麸曲孢子接20~35瓶。
500mL三角瓶装液量为40mL，于转速为200r/min（24h前为100r/min，24h后为200r/min）、300r/min（24h前为100r/min，24h 后为300r/min）旋转摇床上，35℃下培养3~4d。
（３）发酵过程检测
①发酵0h、24h、48h、72h、96h分别各取下两瓶检测残糖、柠檬酸含量，以观察发酵过程中黑曲霉的耗糖与柠檬酸生成速率。
②柠檬酸含量检测：一般检测发酵过程中的总酸，采用0.1429mol/LNaOH溶液滴定
发酵过滤清夜
③总糖及残糖(还原糖)测定: 采用斐林试剂法。
5、实验结果与记录
表5-3 黑曲霉柠檬酸摇瓶液体发酵（24h前为100r/min，24h后为200r/min）
6、实验数据处理
（1）平均耗糖速率（g/h）：单位时间内黑曲霉消耗糖（还原糖）的克数。
（2）平均柠檬酸生成速率（g/h）：单位时间内黑曲霉生成柠檬酸的克数。
（3）糖酸转化率（％）：黑曲霉生成柠檬酸的克数与消耗糖（还原糖）的克数之比的百分数。
7、实验结果与讨论
（1）试以发酵时间为横座标，以糖消耗量、柠檬酸生成量、糖酸转化率为纵座标作图，
说明三者随发酵时间的变化，并加以分析。
（2）试比较表1与表2的结果，阐述通风量对柠檬酸发酵产酸的影响。
8．参考文献
（1）王博彦、金其荣.《发酵有机酸生产与应用手册》北京.中国轻工业出版社.2000.
（2）罗大珍、林稚兰.《现代微生物发酵及技术教程》北京.北京大学出版社.2006.
9．预习与思考题
请预习《发酵有机酸生产与应用手册》和《现代微生物发酵及技术教程》中柠檬酸发酵部分并思考：
（1）柠檬酸发酵关键技术是哪些？
（2）若要提高柠檬酸发酵产量和发酵的糖酸转化率，应再考虑设计哪些实验？。