免疫学论文

免疫学实验论文

题目：间接ELISA法测定抗原免疫动物体内的抗体效价

姓名：詹峥学号：2011304200206 专业：生物科学1102

指导教师：祁高富职称：副教授

中国·武汉

二0一三年十一月

间接ELISA法测定抗原免疫动物体内的抗体效价

摘要：间接ELISA法测定抗原免疫动物体内的抗体效价，是免疫学中经典的抗原-抗体实验。用已知抗原注射兔或小鼠，一段时间后抽取被免疫动物的血液，分离出抗血清。再运用间接ELISA法，用同种已知抗原包被酶标板，洗脱后用脱脂牛奶封闭，加入一抗；洗脱后加入酶标二抗；再次洗脱后加入分离出的抗血清；显色后测定其吸光度，与阴性组对照即可测得抗体效价。此种方法能够快速并且准确地测定未知抗体的效价，因而得到了更为广泛的应用。

关键词：抗原：抗体：间接ELISA：效价

前言：利用抗原与抗体特异性反应的特性对抗原或抗体进行量或质的测定分析，是最经典的血清学方法，这类分析方法不断改进从而具有特异、灵敏和快速的特点。为了得到高效价抗体从而更加便捷地进行各项试验，准确测定未知抗体的效价便成为了亟待解决的问题。本文将从抗原注射、抗血清获得、抗体效价测定等方面展开叙述，并就实验中所出现的问题进行论述。

1.抗原注射

给实验动物注射抗原从而使动物体产生抗血清是本次实验的第一步。用具有抗原性的物质注入到健康动物的机体后，将引起免疫应答，并会形成浆细胞，分泌抗体。抗体主要存在于血清中，经多次免疫，使血清中的抗体量达到要求浓度，然后采集动物血液，再从血液中分离析出血清，从而获得抗血清。对实验动物的选择也有一定的要求，常用的免疫动物有家兔、羊、马、大鼠、小鼠、豚鼠等。免疫用动物应选适龄、健壮，最好为雄性。家兔一般选择选择年龄在6个月以上当年繁殖的♂性，体重2～3公斤，免疫前用金属编号牌固定兔耳，或用染料涂沫在动物的背部，作出明确的标记。在对实验动物进行免疫时，免疫原所用剂量需要控制，合成免疫原为2mg(半抗原约为20～200 μg)。家兔为300～600 μg/次，每次不超过2mL；小鼠为10～100 μg /次（10-20，20~40 μg / ml），每次不超过0.5mL。

免疫的途径可以分为：皮下注射、肌肉注射、静脉注射等。对于免疫时间的间隔，可溶性抗原首次免疫10天后进行二次免疫，颗粒性抗原可1~2周每次。

本次实验分为四组，每组4只小鼠1只兔子，将每组小鼠编号1、2、3、4，将兔子也

编号1、2、3、4；小鼠的注射方法为尾静脉注射或腹腔注射，1、3号作为实验组注射抗原牛血清白蛋白(BSA)50μg，2、4号作为对照组，注射等量生理盐水50μg；兔子的注射方法为肌肉注射或耳静脉注射，1、3组作为实验组注射抗原400μg，2、4组作为对照组注射等量生理盐水400μg。

2. 抗血清获得

将实验动物免疫过后，获得抗血清即为实验的第二步。要得到血清便需要对实验动物进行血液获取。实验小白鼠的身体总血量为1.5ml，将实验小白鼠放入有孔离心管，并使其尾巴露出孔外之后，通过断尾的方法，用手术剪间断小鼠尾巴末端，从尾根部朝下轻轻捋过整条尾巴，用1.5ml离心管接取大约0.5ml血液；实验兔子取血方法耳静脉抽学法，用酒精对实验兔子耳部消毒处理之后，用医用注射器从兔耳远心端向近心端扎入，每次抽取10ml 血液。将所取得的血液收集并做好标记，4℃冷藏过夜。再将血液中血块去除，离心取上清液（3000rpm，20min），加入叠氮钠，混匀，-20℃保存。

3.抗体效价测定

获得了抗血清之后，实验最为关键的一步即为抗血清中抗体效价的测定，本次实验采用间接ELISA法。

3.1实验原理：抗原(抗体)包被在固相载体上，加待测抗体(抗原), 再加相应酶标记抗体(抗原)，生成抗原(抗体)--待测抗体(抗原)--酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。借助分光光度计的光吸收计算抗体(抗原)的量。

3.2实验材料：

牛血清白蛋白（BSA)：抗原，10 μg/ml溶液，包被液配制；

鼠抗BSA：待测抗体样品，用PBST从1：1000开始倍比稀释，连续稀释8个稀释度;HRP 标记羊抗小鼠IgG ——二抗（按说明书稀释使用，用PBST稀释。每班8个板，

480孔，总量48000 μl，实际5.5 μl到55ml）；

包被缓冲液：0.05 M pH 9.6碳酸盐缓冲液（Na2CO3 1.59克，NaHCO3 2.93克，加水900ml，调pH，再定容至1L）；

0.01M PBS溶液：NaCl 8.5 g, Na2HPO4.12H2O 2.85g或Na2HPO4.2H2O 1.13g，KCl 0.2g，

KH2PO4 0.27g，蒸馏水定容至1000ml，pH7.4；

PBST洗涤液：含0.05 % Tween 20的0.01 M 的PBS（pH 7.4 ）;底物溶液：TMB（3,3‘,5,5’-

四甲基联苯胺）；

2M H2SO4 ：（市售浓硫酸为18.4 M，根据要配制的2M硫酸体积，吸管吸好相应体积浓硫酸沿着器壁缓慢加到水中）；

酶标板，酶标仪；

保鲜膜；

排枪

3.3实验步骤：

加抗原：取酶标板，加入100μl/孔的抗原溶液。（用包被缓冲液稀释，用排枪加）

包被抗原：保鲜膜包好，37℃1h或4 ℃过夜，抗原分子通过疏水作用力结合到96微孔板上。

封闭：甩干后以PBST（200μl/孔）洗涤3次，3min/次每孔加入100 μl 5%（W/V)脱脂奶粉溶液（用PBS溶液配制），保鲜膜包好，37℃处理2h。

加待测血清：取出包被、封闭好抗原的酶标板,甩干孔内液体，以PBST（200μl/孔）洗涤3次，3min/次标记各孔，加入相应稀释度的抗体100μl/孔，37℃，保鲜膜包好，60min。加二抗：甩干孔内液体，以PBST（200μl/孔）洗涤4次，3min/次，各孔加入酶标二抗100μl/孔（用PBST稀释10000X,X=1、2、4、8、16、32、64、128.全班每8板需48ml，实配55ml），37℃，保鲜膜包好，45min。

显色：甩干孔内液体，以PBST（200μl/孔）洗涤4次，3min/次，加入TMB底物溶液50μL/孔。

结果分析：避光显色10min(抽屉中），然后每孔加入50 μl 的2M 硫酸终止反应，利用分光光度计测量光吸收值。

4.实验现象

加入显色液并避光保存10min后，可观察到阳性反应均出现蓝色，随着抗体稀释颜色逐渐变浅；而阴性反应无颜色变化。加入2M硫酸之后溶液由蓝色变为黄色。

5.分析讨论

由于抗体稀释倍数不同，阳性反应中抗原会与相应的抗体结合，出现颜色反应。溶液的吸光度值反映出抗体抗原结合的程度。所有的样品经过分光光度计测量之后得到如下结果：

微板编号：2013-11-3-0019 检验项目：11生科

读板时间：检验人：超级用户