拟南芥中一个未知功能蛋白的叶绿体亚细胞定位研究

植物学通报 2006, 23 (3): 249￣254收稿日期: 2005-12-20; 接受日期: 2006-03-07

基金项目: 科技部重大基础研究前期研究专项(973预研) (2003CCA01100)* 通讯作者 Author for correspondence. E-mail: znyang@

．研究报告．

拟南芥中一个未知功能蛋白的叶绿体亚细胞定位研究

王鹏程１ 王晨１ 米华玲２ 周根余１ 杨仲南１＊

(1上海师范大学生命与环境科学学院 上海 200234)(2中国科学院上海植物生理生态研究所 上海 200032)

摘要 生物信息学分析表明, 模式植物拟南芥叶绿体中含有大约4 000多种蛋白质, 目前只分离得到1 000多种, 其他预测的叶绿体蛋白的实验验证对叶绿体功能研究有重要意义。本文对一个预测的叶绿体未知功能蛋白AT5G48790进行了亚细胞定位研究。我们克隆了该基因5'端长178 bp 的DNA 片段, 与绿色荧光蛋白(GFP)基因构建重组载体pMON530-cTP-GFP 。转基因植株通过激光共聚焦显微镜观察, GFP 只在叶绿体中特异表达。实验结果表明, AT5G48790的确为叶绿体蛋白。本实验方法也可用于其他预测的蛋白质的实验验证。

关键词 融合蛋白, 亚细胞定位, 转运肽

Study of Subcellular Localization of the Expressed Protein in

Arabidopsis thaliana

Pengcheng Wang 1, Chen Wang 1, Hualing Mi 2, Genyu Zhou 1, Zhongnan Yang 1*

1

(College of Life and Envionment Science, Shanghai Normal University , Shanghai 200234)

2

(Shanghai Institute Plant Physiology and Ecology , Chinese Academy of Sciences , Shanghai, 200032)

Abstract Bioinformatics analysis has revealed about 4 000 proteins in chloroplasts; however, only about 1 000 proteins have been validated. Thus, we established an experimental system to verify predicted chloroplast proteins. At5g48790 was predicted to be an Arabidopsis chloroplast protein.The 178 bp segment of the 5' sequence of this gene was cloned and fused with GFP to construct a binary vector pMON530-cTP-GFP for genetic transformation. On confocal laser-scanning microscopy,green fluorescent signals were localized in chloroplasts in transgenic Arabidopsis plants. The results suggest that At5g48790 encodes a chloroplast protein. This experiment can also be used to investi-gate other proteins predicted to be located in chloroplasts in Arabidopsis ．Key words fusion protein, subcellular localization, transit peptide

叶绿体是高等植物以及藻类中的一类重要的细胞器, 由叶绿体膜、类囊体和基质3部分构成, 其主要功能是进行光合作用, 另外还参与氨基酸、脂肪酸的生物合成(Motohashi et al.,2001)。在拟南芥中, 叶绿体蛋白质绝大部分由

核基因组编码在细胞质中合成, 叶绿体基因组编码87个蛋白(Abdallah et al., 2000)。拟南芥基因组序列分析表明, 14%左右的核基因编码的产物定位在叶绿体中(Abdallah et al., 2000)。进一步的生物信息学分析表明, 拟南芥中4 255个

25023(3)

核基因组编码的蛋白质为叶绿体蛋白(Friso et al., 2004), 其中25%蛋白质的功能尚不明确。

近年来, 亚细胞蛋白质组学的兴起为阐明细胞器的组成、蛋白质的功能提供了强有力的方法。Peltier等(2000)利用质谱和二维电泳,结合N-端Edman测序分析, 系统地分离出豌豆的61个内腔蛋白和类囊体外周蛋白。在模式植物拟南芥中, Peltier等(2002)又分离出81个内腔和类囊体周边蛋白, Kieselbach等(2000)利用蛋白质组学的方法对类囊体蛋白进行分析并确定了2个蛋白, Ferro等(2003)利用液相色谱技术分离出112个叶绿体膜蛋白, Schubert等(2002)则从类囊体腔中分离出36个蛋白, Friso等(2004)利用多种方法从类囊体膜蛋白质组中分离出154个蛋白质, Froehlich等(2003)利用改良的二维电泳分离出了叶绿体膜蛋白392个, Kleffmann等(2004)采用串联质谱技术(MS/MS)从拟南芥中分离出690个叶绿体蛋白。这些实验数据的积累, 为叶绿体蛋白质的亚细胞定位、功能注释和大规模的蛋白质分选提供了可能, 同时为优化叶绿体蛋白质的预测软件提供了基础。

绝大多数叶绿体蛋白的N端具有转运肽(chloroplast transit peptide, CTP)序列特征, 通过对细胞质中合成的蛋白质前体的N端进行序列分析, 可以预测出构成叶绿体蛋白质组的蛋白质。目前广泛应用的预测软件主要有SignalP、TargetP、LumenP、ChloroP和PSPORT等。叶绿体蛋白质的亚细胞定位实验已有报道, Mitsuda等(2001)以cDNA与sGFP构建融合蛋白用于研究AVP2基因在叶绿体中的定位, Motohashi等(2001)以APG2基因N端转运肽序列与sGFP构建融合蛋白研究其亚细胞定位。我们利用包含转运肽的基因组DNA序列建立了一套用于研究蛋白质在叶绿体中亚细胞定位的实验方法, 并成功得到了未知功能蛋白AT5G48790定位在叶绿体中的信息。１ 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana) Col-0, 由本实验室种植(培养室条件: 22℃, 16小时光照/8小时黑暗, 光通量密度110µmol.m－

2.s－1, 湿度约为30%)。

1.1.2 菌株和质粒大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α菌株由本实验室提供, 农杆菌ASE菌株、含GFP基因的质粒pEGFP和植物双元表达载体pMON530由中国科学院上海植物生理生态研究所黄海研究员提供。

1.1.3 试剂各种酶和生化试剂分别购自上海生工、大连宝生物和Sigma等公司。

1.1.4 引物合成包含基因At5g48790 N端转运肽片段的引物5'端: ATG TCA CCG TCC TTC TCC;3'端 GTC CAT GGT ATT GTT GTT ATA CCC TC (下划线表示引入NcoⅠ位点); GFP内部引物序列为5'端: GTT GAA TTA GAT GGT GAT AAT; 3'端 ATA ACC TTC GGG CAT GGC ACT C。

1.2 方法

1.2.1 质粒提取、DNA片段克隆和重组质粒鉴定参照分子克隆实验指南(Sambrook and Russell, 2002)。

1.2.2 DNA片段回收采用BioDev公司回收试剂盒, 并按其说明书进行操作。

1.2.3 农杆菌介导拟南芥的转化参照浸花法(Clough and Bent, 1998)进行。

1.2.4 转基因T0代种子筛选种子用70%乙醇+0.01%Triton X-100混合液浸泡10分钟, 无菌水冲洗4次, 用Top agar(0.1%琼脂水溶液)均匀涂布在卡那霉素抗性(50 µg.mL−1)的PNS固体培养基上, 4℃春化2天后, 在培养室中培养。

1.2.5 转基因植株的PCR检测以筛选出来的T1代植株的总DNA为模板, 采用GFP引物进行PCR扩增。