不同来源白首乌rDNAITS序列分析

不同来源白首乌r DNA ITS 序列分析张宁1,闫滨1,徐星航2,徐凌川13(1.山东中医药大学药学院,山东济南250355;2.山东省济钢高级中学,山东济南250100)[摘要]　目的:研究白首乌不同种的I TS 序列遗传差异性,分析序列差异性在白首乌品种鉴定及种质资源研究中的意义。

方法:从不同来源的白首乌中提取总DNA,以核基因组I TS 通用引物进行扩增,扩增产物经克隆后,进行测序。

结果:获得4个不同来源样品的ITS 全序列及518S 全序列以及两端的18S,26S 的部分序列,其中戟叶牛皮消Cynanchumbungei ITS 序列为国际首次获得,登录号分别分别为G U198970(野生种),G U479037(栽培种)。

各样品间ITS 序列存在不同,4个样品序列间共存在10个变异位点。

结论:I TS 序列对白首乌种质资源鉴定具有较好的分辨性,为鉴别不同来源的白首乌提供了依据。

[关键词]　白首乌;克隆;I TS 序列;序列分析[稿件编号]　20100121007[通信作者]　3徐凌川,教授,E 2mail:xulingchuan518@sina .com [作者简介]　张宁,硕士研究生,E 2mail:zhangning301@ 白首乌主要来源为戟叶牛皮消Cynanchumbungei Decne .、耳叶牛皮消 C.au riculatum Royle ex W ight 、隔山消C.w ilfordii He m sl .的块根[1],均具有补肝肾,强筋骨,益精血,乌须发等功效。

1977年版的《中国药典》以白首乌药名收录的仅为萝藦科植物戟叶牛皮消,由于该种资源较少,之后的各版药典均未收载。

因此,白首乌作为传统的著名抗衰老中药的概念趋于弱化,近年来,泰山白首乌(戟叶牛皮消)开始进行人工栽培[223],为该中药的复兴、原植物资源保护和开发利用奠定了基础。

为确保泰山白首乌的种质、种源,有必要对其进行分子生物学方面的研究,以配合G AP 种植方面的性状观察和良种选育。

在用于解决属下不同种和种内系统发育和分类问题时,目前常采用核糖体DNA 中的内转录间隔区(internal transcribed s pace,I TS )序列的测定,以分析物种的同源性和不同居群的遗传水平[425]。

郑传进等[6]报道了耳叶牛皮消的I TS 序列,但白首乌其他种的DNA 序列未见报道。

本实验从隔山消,耳叶牛皮消,泰山白首乌(野生种)和泰山白首乌(人工栽培种)4种植物叶片中提取了DNA 并测定其I TS 序列,旨在为白首乌的分子鉴定提供依据。

1　材料和方法111　材料　于2009年8月采集4种植物的新鲜嫩叶,直接用于DNA 提取,4种植物均经山东中医药大学药学院生药系徐凌川教授鉴定,材料来源见表1。

表1　不同来源的白首乌样品标号拉丁名采集地点1隔山消Cynanchum.w ilfordii昆嵛山2耳叶牛皮消C.auriculatum 本校药圃3泰山白首乌C.bungei 济南梯子山4泰山白首乌C.bungei泰山白首乌种植基地112　DNA 提取[7]　取新鲜叶片,参照Rodrigues 组织培养表面消毒的方法处理后各011g,加液氮研磨成细粉后,使用改良的CT AB 法提取总DNA ,于-20℃保存备用。

113　PCR 扩增　以提取的DNA 为模板,采用PCR扩增通用引物I TS 1:TCCGT AGGTG AACCTGCGG;I TS 4:T CCTCCGCTT ATTG AT ATGC (均由上海生工生物工程技术有限公司合成)进行扩增。

PCR 扩增体系总体积为50μL,包括:模板DNA (适宜浓度)5μL,引物I TS1与I TS4(10μmol ・L -1)各1μL,dNTP (10mmol ・L -1)1μL,10×PCR buffer (含MgCl 2)5μL,Taq 聚合酶(5U ・μL -1)0125μL,加灭菌三蒸水至50μL 。

PCR 扩增条件为:98℃预变性5m in,然后进入如下循环:95℃变性35s,55℃退火35s,72℃延伸40s,35个循环,72℃延伸8m in 。

扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳进行分析。

114　PCR 扩增产物的纯化、克隆、测序　将扩增的目的I TS 序列进行琼脂糖凝胶电泳,通过UN I Q 210・7351・柱式DNA 胶回收试剂盒(上海生工生物工程技术有限公司)对凝胶目的条带进行纯化回收;通过A 2tailing Kit (SK2291)试剂盒在3′端加A;然后按照T 2载体PCR 产物扩增试剂盒(SK2211)提供的克隆方法,通过Eco R I 和H ind Ⅲ双酶切pUCm 2T 载体,通过连接反应插入PCR 产物;接着制备感受态细胞(产品编号SK2301,2302),培养皿培养后,用牙签挑白斑至含氨苄青霉素的液体培养基中,37℃培养过夜,提取质粒,用Pst I 单酶切,用M13通用引物进行测序,获得目的片段序列。

2　结果211　白首乌凝胶电泳检查　4种不同的白首乌的DNA 提取产物与扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳分析均有条带,表明DNA 提取方法以及扩增方法均可行。

见图1,2。

212　白首乌I TS 序列的长度分析　根据基因库中近缘种隔山消LYPS2009030854,确定r DNA 内转录间隔区I TS1,I TS2与3个编码区18S,518S,26S 的界限,测得4个样品的18S,I TS1,518S,I TS2,26S 的基因序列,1,2,3号样品碱基为729bp,4号样品由于存在1个碱基缺失为728bp,其中I TS1序列的长度为234bp,518S 序列的长度为162bp,I TS2序列的长度为245bp 。

3种不同来源的白首乌(4个样品)中共有10个碱基存在变异,其中5个为碱基颠换,4个为碱基转换,1个为碱基缺失。

I TS1的变异位点有4个,I TS2的变异位点有6个,518S 无变异位点,I TS1的(G +C )%的量在481291%～501427%,518S (G +C )为541938%,I TS2的(G +C )%的量在611224%～621449%。

213　白首乌各样品序列间的碱基差异性与遗传距离分析　利用DNAMAN 软件对各样品间的碱基差异进行分析和遗传距离分析,所得结果见表2。

3号和4号的遗传距离为01001,碱基相似度为9919%,其次分别为2号和3号(01010,9910%),2号和4号(01011,9819%),1号和3号(01022,9718%),1号和4号(01023,9717%),遗传距离最大碱基相似度最小的为1号和2号(01029,9711%)。

即泰山白首乌济南野生种和泰安栽培种的遗传距离最近,碱基相似度最高,隔山消与耳叶牛皮消的遗传距离最远,碱基相似度最低。

表2　白首乌各样品的遗传距离(对角线上方)和碱基相似度(对角线下方)No 11234101029010220102329711%01010010*******%9910%0100149717%9819%9919%214　白首乌4种样品特异性鉴别位点(以I TS1的第1个位点为1)　4个样品的I TS 区合并518Sr DNA 序列总长度为728～729bp,Clustal X 排序后简并长度为729bp,共存在10个鉴别位点,集中于I TS1与I TS4区,518S 区相当保守,未发现变异位点。

结果见表3。

3　讨论311　不同来源白首乌克隆测序、比对　本实验用PCR 扩增的DNA 片段直接进行测序,为保证测序的准确性,采用克隆测序的方法,将所测得的白首乌的18S ～26S r DNA 序列输入到NCB I 上的Genbank 中用B last 进行比对,并且界定出样品的18S r RNA ～26S r RNA 基因及其间隔序列各部分的序列。

发现供试的3种白首乌(4个样品来源)与已登录的隔山消(LYPS2009030854)18S ～26S r DNA 序列具有较高的同源性。

本实验所用材料戟叶牛皮消即泰山白・8351・ 表3　白首乌不同样品的特异性鉴别位点No1位点/bp811231632244054134805505676041A A G C G T G G C C 2C A C C T A G T A G 3A A G G G T G G A C 4A-G G G T A G A C首乌为中国特有植物,其I TS序列(3号样品)为国际首次获得,基因库中登录号分别为G U198970和G U479037。

312　I TS在白首乌类药材鉴定、道地性药材鉴别以及遗传育种方面的意义　近年来,分子标记技术和DNA指纹分析技术的迅猛发展及其在农作物种质鉴定上的广泛应用,为揭示药用植物的遗传差异和鉴定中药材品种的道地性提供了新的方法和手段,其中核糖体DNA(即nr DNA)I TS区(包括I TS1,518S和I TS2)序列已被广泛的用于植物属内、近缘属间及同一物种不同居群间的系统发育分析等。

因此只要建立合理的检测方案,即可将不同药材鉴别出来[829]。

本实验通过对白首乌3个种序列分析表明,隔山消、耳叶牛皮消、泰山白首乌(济南野生种和人工栽培种)都有其特定的I TS变异位点,种间可根据I TS序列组成、碱基含量和遗传距离等方面的差异进行区别。

此外,同种内不同来源的样品(野生种和栽培种)也存在微小的差异,通过各自的变异位点能从分子水平上将它们区分开来。

对于白首乌其他更多产地来源或种内变异的分子鉴定研究还有待于今后进行深入研究。

3号和4号2个样品的同源性最高,碱基相似度达到了9919%,只有2个碱基差异,123位4号样品存在1个碱基缺失,480位存在1个碱基转换,这2个位点可以作为鉴别泰山白首乌道地药材的I TS特异位点,说明用I TS序列鉴别白首乌的道地性是可行的。

目前,泰山白首乌野生资源岌岌可危,药材在临床和保健方面供不应求,市场价格以达到400元/ kg。

笔者在泰山白首乌的栽培过程中,发现了与野生种在形态上有变异的栽培变种,定名为“泰白1号”,生长周期短,产量高,品质优良。

随着今后在泰山白首乌分子标记育种方面研究的深入,今后将以此为基础培养出更多泰山白首乌优质高产的新品种,以满足市场供应。

[参考文献][1]　肖培根.新编中药志[M].北京:化学工业出版社,2002:521.[2]　徐凌川,张荣君,张华,等.泰山白首乌规范化种植基地环境质量评价[J].山东中医杂志,2007,26(10):709.[3]　张荣君,徐凌川,郭素,等.泰山白首乌规范化种植研究[J].现代中药研究与实践,2007,21(6):3.[4]　蔡金娜,周开亚,徐珞珊,等.中国不同地区蛇床的r DNA I TS序列分析[J].药学学报,2000,35(1):56.[5]　赵欢,吴卫,郑有良,等.核糖体DNA I TS序列分析在药用植物研究中的应用[J].时珍国医国药,2009,20(4):959.[6]　郑传进,赵树进.基于r DNA I TS序列的何首乌PCR2RF LP分子鉴别[J].华南理工大学学报:自然科学版,2009,37(6):74. [7]　Rodrigues K F.The foliarfungal endophytes of the Amaz onian pal mEuterpe oleracea[J].Mycol ogia,1994,86(3):376.[8]　Stensrud O,Hy wel Jones N L,Schumacher T.Towards a phyl oge2netic classificati on of Cordyceps:I TS nr DNA sequence data confir mdivergent lineages and paraphyly[J].Mycol Res,2005,109(1):41.[9]　W ang C Z,L i P,D ing J Y,et al.I dentificati on of Fritillaria pal2lidiflora using diagnostic PCR and PCR2RF LP based on nuclear ri2 bos omal DNA internal transcribed s pacer sequences[J].Planta Med,2005,71(4):384.・9351・Sequence ana lysis of rD NA2I TS of Ba i Shouwu fro m d i fferen t spec i esZHANG N ing1,Y AN B in1,XU Xinghang2,XU L ingchuan13(1.Faculty of Phar m acy,Shandong U niversity of Trditional Chinese M edicine,J i′nan250355,China;2.J igang Senior H igh School Shandong Province,J i′nan250100,China)[Abstract]　O bjecti ve:To study the genetic diversity of r DNA I TS sequences in different s pecies of Bai Shou wu,utilize the mo2 lecular diversity of I TS sequences t o authenticate the different s pecies of Bai Shou wu.M ethod:Firstly,t otal DNA was extracted fr om the different s pecies of Bai Shou wu.Secondly,the I TS sequence was amp lified by PCR with universal p ri m er of I TS and sequenced af2 ter cl oning and purificati on.Result:Fr om f our s pecies the comp lete sequence of I TS and5.8S r DNA,the partial sequences of18S r DNA and26S r DNA were obtained.The r DNA I TS sequences of Cynanchum bungei(sign in No.G U198970and No.G U479037)were obtained.Ten variable sites among the sequences were f ound.Conclusi on:I TS sequence could be used t o authenticate the s pecies. The method could be used t o identify ger mp las m res ources and authenticate.[Key words]　Bai Shou wu;cl one;I TS regi on;sequence analysisdo i:10.4268/cjc mm20101207[责任编辑　吕冬梅]本刊近况简介《中国中药杂志》为中国中文核心期刊,中国科技核心期刊;为“中国科学引文数据库”、“中国学术期刊综合评价数据库”和“中国科技论文统计源”核心期刊,并且被《中国学术期刊文摘》中、英文版收录。