不同来源白首乌rDNAITS序列分析

不同来源白首乌r DNA ITS 序列分析

张宁1

,闫滨1

,徐星航2

,徐凌川

13

(1.山东中医药大学药学院,山东济南250355;2.山东省济钢高级中学,山东济南250100)

[摘要]　目的:研究白首乌不同种的I TS 序列遗传差异性,分析序列差异性在白首乌品种鉴定及种质资源研究中的意

义。方法:从不同来源的白首乌中提取总DNA,以核基因组I TS 通用引物进行扩增,扩增产物经克隆后,进行测序。结果:获得4个不同来源样品的ITS 全序列及518S 全序列以及两端的18S,26S 的部分序列,其中戟叶牛皮消Cynanchum

bungei ITS 序列为国际首次获得,登录号分别分别为G U198970(野生种),G U479037(栽培种)。各样品间ITS 序列存在

不同,4个样品序列间共存在10个变异位点。结论:I TS 序列对白首乌种质资源鉴定具有较好的分辨性,为鉴别不同来源的白首乌提供了依据。

[关键词]　白首乌;克隆;I TS 序列;序列分析

[稿件编号]　20100121007

[通信作者]　3徐凌川,教授,E 2mail:xulingchuan518@sina .com [作者简介]　张宁,硕士研究生,E 2mail:zhangning301@

白首乌主要来源为戟叶牛皮消Cynanchum

bungei Decne .、耳叶牛皮消 C.au riculatum Royle ex W ight 、隔山消C.w ilfordii He m sl .的块根

[1]

,均具有

补肝肾,强筋骨,益精血,乌须发等功效。1977年版的《中国药典》以白首乌药名收录的仅为萝藦科植物戟叶牛皮消,由于该种资源较少,之后的各版药典均未收载。因此,白首乌作为传统的著名抗衰老中药的概念趋于弱化,近年来,泰山白首乌(戟叶牛皮

消)开始进行人工栽培[223]

,为该中药的复兴、原植物资源保护和开发利用奠定了基础。为确保泰山白首乌的种质、种源,有必要对其进行分子生物学方面的研究,以配合G AP 种植方面的性状观察和良种选育。

在用于解决属下不同种和种内系统发育和分类问题时,目前常采用核糖体DNA 中的内转录间隔区(internal transcribed s pace,I TS )序列的测定,以分析

物种的同源性和不同居群的遗传水平[425]

。郑传进等[6]

报道了耳叶牛皮消的I TS 序列,但白首乌其他种的DNA 序列未见报道。本实验从隔山消,耳叶牛皮消,泰山白首乌(野生种)和泰山白首乌(人工栽培种)4种植物叶片中提取了DNA 并测定其I TS 序列,旨在为白首乌的分子鉴定提供依据。1　材料和方法

111　材料　于2009年8月采集4种植物的新鲜嫩

叶,直接用于DNA 提取,4种植物均经山东中医药大学药学院生药系徐凌川教授鉴定,材料来源见表1。

表1　不同来源的白首乌样品

标号

拉丁名

采集地点1隔山消Cynanchum.w ilfordii

昆嵛山2耳叶牛皮消C.auriculatum 本校药圃3泰山白首乌C.bungei 济南梯子山

4

泰山白首乌C.bungei

泰山白首乌种植基地

112　DNA 提取

[7]

　取新鲜叶片,参照Rodrigues 组

织培养表面消毒的方法处理后各011g,加液氮研磨成细粉后,使用改良的CT AB 法提取总DNA ,

于-20℃保存备用。

113　PCR 扩增　以提取的DNA 为模板,采用PCR

扩增通用引物I TS 1:TCCGT AGGTG AACCTGCGG;

I TS 4:T CCTCCGCTT ATTG AT ATGC (均由上海生工生物工程技术有限公司合成)进行扩增。PCR 扩增体系总体积为50μL,包括:模板DNA (适宜浓度)5μL,引物I TS1与I TS4(10μmol ・L -1)各1μL,

dNTP (10mmol ・L -1

)1μL,10×PCR buffer (含

MgCl 2)5μL,Taq 聚合酶(5U ・

μL -1)0125μL,加灭菌三蒸水至50μL 。PCR 扩增条件为:98℃预变性5m in,然后进入如下循环:95℃变性35s,55℃退火35s,72℃延伸40s,35个循环,72℃延伸8m in 。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳进行分析。114　PCR 扩增产物的纯化、克隆、测序　将扩增的

目的I TS 序列进行琼脂糖凝胶电泳,通过UN I Q 210

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柱式DNA 胶回收试剂盒(上海生工生物工程技术有限公司)对凝胶目的条带进行纯化回收;通过A 2tailing Kit (SK2291)试剂盒在3′端加A;然后按照T 2载体PCR 产物扩增试剂盒(SK2211)提供的克隆方法,通过Eco R I 和H ind Ⅲ双酶切pUCm 2T 载体,通过连接反应插入PCR 产物;接着制备感受态细胞(产品编号SK2301,2302),培养皿培养后,用牙签挑白斑至含氨苄青霉素的液体培养基中,37℃培养过夜,提取质粒,用Pst I 单酶切,用M13通用引物进行测序,获得目的片段序列。2　结果211　白首乌凝胶电泳检查　4种不同的白首乌的DNA 提取产物与扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳分析均有条带,表明DNA 提取方法以及扩增方法均可行。见图1,2

。

212　白首乌I TS 序列的长度分析　根据基因库中

近缘种隔山消LYPS2009030854,确定r DNA 内转录间隔区I TS1,I TS2与3个编码区18S,518S,26S 的界限,测得4个样品的18S,I TS1,518S,I TS2,26S 的基因序列,1,2,3号样品碱基为729bp,4号样品由于存在1个碱基缺失为728bp,其中I TS1序列的长度为234bp,518S 序列的长度为162bp,I TS2序列的长度为245bp 。3种不同来源的白首乌(4个样品)中共有10个碱基存在变异,其中5个为碱基颠换,4个为碱基转换,1个为碱基缺失。I TS1的变异位点有4个,I TS2的变异位点有6个,518S 无变异位点,I TS1的(G +C )%的量在481291%～501427%,518S (G +C )为541938%,I TS2的(G +C )%的量在611224%～621449%。

213　白首乌各样品序列间的碱基差异性与遗传距

离分析　利用DNAMAN 软件对各样品间的碱基差异进行分析和遗传距离分析,所得结果见表2。3号和4号的遗传距离为01001,碱基相似度为9919%,其次分别为2号和3号(01010,9910%),2号和4号(01011,9819%),1号和3号(01022,9718%),1号和4号(01023,9717%),遗传距离最大碱基相似度最小的为1号和2号(01029,9711%)。即泰山白首乌济南野生种和泰安栽培种的遗传距离最近,碱基相似度最高,隔山消与耳叶牛皮消的遗传距离最远,碱基相似度最低。

表2　白首乌各样品的遗传距离(对角线上方)和

碱基相似度(对角线下方)

No 11

234101029

010220102329711%01010

010*******%9910%01001

4

9717%

9819%

9919%

214　白首乌4种样品特异性鉴别位点(以I TS1的第1个位点为1)　4个样品的I TS 区合并518Sr DNA 序列总长度为728～729bp,Clustal X 排

序后简并长度为729bp,共存在10个鉴别位点,集

中于I TS1与I TS4区,518S 区相当保守,未发现变异位点。结果见表3。3　讨论311　不同来源白首乌克隆测序、比对　本实验用PCR 扩增的DNA 片段直接进行测序,为保证测序的准确性,采用克隆测序的方法,将所测得的白首乌的18S ～26S r DNA 序列输入到NCB I 上的Genbank 中用B last 进行比对,并且界定出样品的18S r RNA ～26S r RNA 基因及其间隔序列各部分的序列。发现供试的3种白首乌(4个样品来源)与已登录的隔山消(LYPS2009030854)18S ～26S r DNA 序列具有较高的同源性。本实验所用材料戟叶牛皮消即泰山白

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