电泳简单介绍

ECL反应
发光液A和B分别是鲁米诺和过 氧化氢，在辣根过氧化物酶（HRP） 的催化作用下,鲁米诺与过氧化氢反应 生成一种过氧化物，过氧化物不稳定 随即分解，形成一种能发光的电子激 发中间体,当后者由激发态返回至基态， 就会产生荧光。在发光过程中不需要 消耗HRP,HRP只是起催化作用，所以 发光液A、B
IEF
等 电聚焦的优点是：有很高的分辨率，可将等电点相差0.01-0.02pH单位的 蛋白质分开 。 一般电泳由于受扩散作用的影响，随着时间和所走的距离加长，区 带越走越宽，而电聚焦能抵消扩散作用，使区带越走越窄 。 由于这种电聚焦作用， 不管样品加在什么部位，都可聚焦到其电点，很稀的样品也可进行分离 ， 可直接 测出蛋白质的等电点，其精确度可达0.01pH单位。
我们毕业啦
其实是答辩的标题地方
电泳的介绍
基本原理
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带电颗粒在电场作用下，向着与其电性相反的电 极移动，称为电泳(electrophoresis, EP)。许多重要的 生物分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸 等都具有可电离基团，它们在某个特定的 pH值下可以 带正电或负电，在电场的作用下，这些带电分子会向 着与其所带电荷极性相反的电极方向移动。
只要HRP没降解失活,是可以重复加发
光液的。
ECL反应
二抗
一抗
目标蛋白
THANKS
(6)凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适的浓度，通过改 变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径； (7)分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应 为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率。
IEF
等电聚焦就是在电泳 凝 胶 中放入载 体两性电解质，当通以直流电时，两 性电解质即形成一个由阳极到阴极逐 步增加的pH梯度，当蛋白质放进此体 系时，不同的蛋白质即移动到或聚焦 于与其等电点相当的pH位置上。
未加还原剂，因而蛋白折叠未被破坏，不
可作为测定分子量来使用。
SDS-PAGE
分子量范围与凝胶浓度的关系
分子量范围
15~45kDa 15~60 kDa 18~75 kDa 30~120kDa
适用的分离胶浓度(%)
15 12.5 10 8
预制胶4-20%
分子量范围 10~250kDa
SDS-PAGE
等电聚焦的缺点是：一是电聚焦要求用无盐溶液，而在无盐溶液中蛋白质可 能发生沉淀 ； 二是样品中的成分必需停留于其等电点，不适用在等电点不溶或发
生变性的蛋白质。.
WB
Western Blot法
免 疫 印 迹 法采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳， 被检测物是蛋白质，"探针"是抗体，"显色"用 标记的二抗。经过PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳) 分离的蛋白质样品，转移到固相载体(例如硝 酸纤维素薄膜)上，固相载体以非共价键形式 吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及 其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或 多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再 与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底 物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性 目的基因表达的蛋白成分。
制胶工具
预制胶
SDS-PAGE
根据样品分离目的不同，主要有 两 种处理方法:还原SDS处理、非还 原SDS处理。
1 2
还原SDS处理: 在上样buffer中加入β-巯基乙醇 （ β-巯基乙 醇能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂 ） ，蛋白质构象被解离 ，电荷被中和，形成SDS与蛋白相结合的分子。
非还原SDS处理:
聚丙烯酰胺凝胶有下列特性： (1)在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好； (2)化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，在很多溶剂中不溶； (3)对pH和温度变化较稳定； (4)几乎无吸附和电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一致，则样品分 离重复性好；
(5)样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g；
电泳槽
电源
电泳的流程
制胶
样品 处理
跑胶
固定
WB
8%、10%、12.5%、15%的胶 16.5%的Tricine胶 4-20%的梯度胶
染色
ECL反应
脱色
曝光
分类
SDS-PAGE
1
电泳
SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳，变性条件下电泳， 根据蛋白质亚基分子量的不同来分开蛋白质。
2
IEF
等 电 聚 焦 电 泳 利用蛋白质分子或其它两性 分子的等电点不同，在一个稳定的、连续 的、线性的pH梯度中进行蛋白质的分离和 分析。
Fra Baidu bibliotek
3
CE
毛细管电泳
染色
在蛋白质染色方法中，目前以考马斯亮蓝 染色最为常用，考马斯亮蓝灵敏度每条带 0.1-1ug；还有灵敏度较高的银染。
处理方式
WB
蛋白质印迹法（免疫印迹试验） 通过特异 性抗体对凝胶电泳处理过的蛋白质分子样 品进行着色。
SDS-PAGE
SDS-PAGE电泳凝胶中各主要成分的作用 聚丙烯酰胺的作用:丙烯酰胺为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接 关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关; 制胶缓冲液: 选择Tris-HCl系统，浓缩胶选择pH6.8，分离胶选择pH8.8 ，TEMED与AP: AP 催化剂，催化单丙和双丙聚合成聚丙烯酰胺。TEMED四 甲基乙二胺，催凝剂，加速AP催化作用; 十二烷基磺酸钠(SDS): 阴离子去污 剂，作用有四: 去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏 水作用、去除多肽折叠。
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电泳技术就是利用在电场的作用下，由于待分离 样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等 性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而 对样品进行分离、鉴定或提纯的技术。
电泳装置主要包括两个部分：电源和电泳槽。 电源提供直流电，在电泳槽中产生电场，驱动带电分子的迁移。 电泳槽可以分为水平式和垂直式两类。垂直板式电泳是较为常见的一种， 常用于聚丙烯酰胺凝胶电泳中蛋白质的分离。