TALEN靶向基因敲除技术

TALEN靶向基因敲除

TALENs(transcription activator-like (TAL) effector nucleases)，中文名是转录激活因子样效应物核酸酶，TALENs是一种可靶向修饰特异DNA序列的酶，它借助于一种由植物病原菌黄单胞菌(Xanthomonas)自然分泌的天然蛋白即激活因子样效应物(TAL effectors, TALEs)---的功能：该蛋白能够识别特异性DNA碱基对。人们可以设计一串合适的TALEs来识别和结合到任何特定序列，如果再附加一个在特定位点切断DNA 双链的核酸酶，就生成了TALENs。TAL效应核酸酶可与DNA结合并在特异位点对DNA链进行切割，从而利用这种TALEN就可以在细胞基因组中引入新的遗传物质。相对锌指核酸酶(zinc-finger nuclease, ZFN)而言，TALEN能够靶向更长的基因序列，而且也更容易构建。但是直到现在，人们一直都没有一种低成本的而且公开能够获得的方法来快速地产生大量的TALENs。

TALEN 靶向基因敲除技术是一种崭新的分子生物学工具，现已应用于植物、细胞、酵母、斑马鱼及大、小鼠等各类研究对象。研究发现，Xanthomonas TAL蛋白核酸结合域的氨基酸序列与其靶位点的核酸序列有较恒定的对应关系。研究者们利用来自Xanthomonas TAL的序列模块，构建针对任意核酸靶序列的重组核酸酶，在特异的位点打断目标基因，敲除该基因功能。成功解决了常规的ZFN方法不能识别任意目标基因序列，以及识别序列经常受上下游序列影响识别特性的问题，使基因敲除变得简单方便。

技术特点：

·无基因序列、细胞、物种限制。

·实验周期短。

·整个实验简单准确，成本低。

·成功率可达90%以上。

·毒性低、脱靶情况少。

·TAL的核酸识别单元与A、G、C、T有恒定的对应关系。

·靶序列识别模块不受上下游影响，特异识别并打断基因组中的任意靶序列。

·成对的TAL识别模块保证了基因敲除靶点的准确性。

·已经成功应用到了植物、细胞、酵母、斑马鱼及大、小鼠等各类研究对象。

相比于传统的锌指核酸酶(ZFNs)技术，TALENs具有独特的优势：设计更简单，特异性更高。缺点有：具有一定细胞毒性，模块组装过程繁琐，一般需要求助于外包公司。

基本原理与基因敲除步骤

步骤一 TAL靶点识别模块构建

TAL的核酸识别单元为间隔32个恒定氨基酸序列的双连氨基酸。双连氨基酸与A、G、C、T有恒定的对应关系，即NI识别A，NG识别T，HD识别C，NN识别G，非常简单明确。因此，欲使TALEN特异识别某一核酸序列（靶点），只须按照靶点序列将相应TAL单元串联克隆即可。目前，TALEN系统利用FokI的内切酶活性打断目标基因。因FokI需形成2聚体方能发挥活性，在实际操作中需在目标基因中选择两处相邻（间隔17碱基）的靶序列（一般十几个碱基）分别进行TAL识别模块构建。

步骤二将（两个相邻）靶点识别模块（分别）克隆入真核表达载体，得到Talen质粒对

靶点识别模块串接成功后需克隆入真核表达载体中。此真核表达载体含有TAL的其它必需结构域并在C端融合有FokI序列。

步骤三将TALEN质粒对共转入细胞中实现靶基因敲除

TALEN质粒对共转入细胞后，其表达的融合蛋白即可分别找到其DNA靶位点并与靶位点特异结合。此时，两个TALEN融合蛋白中的FokI功能域形成二聚体，发挥非特异性内切酶活性，于两个靶位点之间打断目标基因。诱发DNA损伤修复机制。由于在此修过程中总是有一定的错误率存在。在修复中发生错误的个体即形成目标基因敲除突变体。

步骤四目标基因敲除突变体筛选确证

利用实验设计时挑选的，位于相邻靶位点之间的特异性内切酶位点，可进行PCR产物酶切鉴定以筛选发生目标基因敲除的突变个体。