真核生物之酵母表达系统

3、甲醇酵母表达系统操作原理
宿主株与标记基因 甲醇酵母系统的整合事件 胞内表达与分泌表达
甲醇酵母系统宿主
二大宿主系统主要特点
项目 最适温度 最适pH值 甘油阻遏 毕赤酵母 30℃ 4.5 是 汉森酵母 37℃ 4.5 否
糖基化
高密度发酵
部分过度
100g/L
较正常
100g/L
甲醇酵母系统宿主
二大宿主系统主要选择标记
半乳糖诱导、葡萄糖抑制
GAL10 Promoter
GAL80
GAL4
UAS
GAL1
GAL7
GAL10
A、 将GAL4的启动子换成GAL10的诱导型强启动子 B、半乳糖诱导GAL4高表达，不受GAL80产物抑制，激活GAL1等高效转录
3）pho4TS-PHO5启动子
低温诱导、磷酸盐抑制 A、PHO5启动子在培养基缺磷酸盐时启动转录
宿主株:GS115、KM71
可插入位点： 5’AOX1 3’AOX1
TT
转化子： GS115:His+Mut+
KM71:His+Muts
4） 基因取代（GS115，AOX1+）
转化子：His4+Muts
汉森酵母系统的高拷贝整合型表达载体
高拷贝整合元件： A、高度重复序列：rDNA
提供多个整合位点
3、酿酒酵母糖基化系统
糖基化位点：Asn-X-Thr/Ser（X代表任何氨基酸）
N-型糖基化：天门冬酰氨酸残基上的酰胺氮进行糖
基化，对蛋白质的折叠、稳定性及活性较重要。
O-型糖基化：苏氨酸/丝氨酸上的羟基氧进行糖基化
酿酒酵母糖基化特点
* 过糖基化（超糖基化修饰）：
N型或O型糖基的外链进一步形成庞大的、由甘露糖
甲醇酵母系统的整合事件
YRp型载体：汉森系统
传代不稳定，传代过程同源或非同源重组，高选择 压力迫使高拷贝数整合，可达100拷贝。
YIp型载体：
A、在靶序列处线性化载体DNA，诱导同源重组
B、有“插入”和“取代”二类整合模式
C、主要为单拷贝整合，1-10%为多拷贝整合
毕赤酵母系统模式表达载体
1）AOX1位点插入
AOX1与AOX2 *毕赤酵母和假丝酵母基因组存在二个AOX基因 AOX1、AOX2 *AOX1与AOX2基因97%同源 *AOX1 占主导地位，负责AOX 99%以上活性
1、甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子
甲醇氧化酶启动子 A、目前已发现的、最强的真核启动子 B、严谨调控型启动子 AOX1：葡萄糖和甘油脱阻遏、甲醇诱导 MOX：葡萄糖阻遏、甘油脱阻遏、甲醇诱导
信号肽：MFα 标记：Kan
4、甲醇酵母系统高效表达影响因素与对策
载体稳定性 基因剂量
整合位点
甲醇利用表型 mRNA5’端 AT含量分泌信号 表达产物稳定性
1）载体稳定性
同拷贝数时，整合型的比自主复制型的表达水平高 YRp型载体的稳定化： 选择—非选择培养交替数十代可得稳定的整合子， 但费时，整合位点不确定。 采用YIp型载体: 更易实现整合、整合位点清楚
7）分泌信号
分泌表达效率与所用分泌信号高度相关
可采用酿酒酵母来源的MFα、PHO或SUC等的信号 肽，或野生型信号肽，但适用性要比较分析。
8）表达产物稳定性
分泌表达时，胞外蛋白酶是要影响因素
降低培养基pH值：蛋白酶在酸性条件下活性较低
培养基中添加蛋白水解产物：竞争性抑制
采用蛋白酶缺陷宿主株：如P.pastoris SMD1168
宿主 毕赤酵母 汉森酵母 选择标记 his4、G418、 Zeocin、Cu++ leu2、 his3 、ura3、 G418
甲醇酵母系统宿主
毕赤酵母系统主要宿主株
宿主株 Y11430 GS115 特点 野生型、Mut+ his4- 、Mut+
KM71 his4-、 aox1::ARG4 (AOX1-)、Muts SMD1168 his4- 、胞外蛋白酶缺陷，高分泌 MC1003 his4-、AOX1-、AOX2-，甲醇不生长
UAS
URS
TATA
2、TATA盒：富含AT；
3、UAS：上游激活序列;
5、DAS：下游激活序列
酿酒酵母表达系统常用启动子
1）糖酵解途径中关键酶的强启动子，受葡萄糖诱导：
甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因GAPDH
磷酸甘油激酶基因PKG
乙醇脱氢酶基因ADH
2）半乳糖激酶启动子（GAL1）
半乳糖诱导、葡萄糖抑制
毕赤酵母中个别情况整合于His4位点的比AOX1位点 的低
4）甲醇利用表型
在分泌表达情况下，甲醇慢生长型更利于表达
5）MRNA5’端
mRNA5’端非翻译区（UTR）的组成与长度 应尽量与AOX1/MOX的一致
应尽量避免在UTR区出现AUG和次级结构
6）基因序列的AT含量 AT含量越高、越容易出现类似于终止子的结构
酵母表达系统
酿酒酵母表达系统 甲醇酵母表达系统 其它酵母表达系统
（一） 酿酒酵母表达系统
酿酒酵母系统启动子 酿酒酵母分泌系统 酿酒酵母糖基化系统 酿酒酵母表达系统存在的问题
1、酿酒酵母启动子
起始 位点 mRNA 40-120bp 20-40bp 100-1400bp 1、转录起始位点； 4、URS：上游阻遏序列 DAS 编码序列
1、甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子
甲醇氧化酶 A、甲醇代谢关键酶，占可溶蛋白的30%以上 B、名称和拷贝数不同 毕赤酵母/假丝酵母 汉森酵母 醇氧化酶 甲醇氧化酶 alcohol oxidase,AOX methanol oxidase,MOX AOX1、AOX2 MOX
1、甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子
组成的、复杂分支结构的现象。增加了免疫原性、对活
性与药代稳定性均有影响。
*糖链组成
O型糖链仅由甘露糖组成、而哺乳细胞的还含唾液酸
基团
4、酿酒酵母表达系统的缺陷
1）表达水平普遍不高
A、表达载体传代不稳定（YEp、YRp）
B、所采用的强启动子调控不严谨
C、不能利用简单的无机培养基进行高密度发酵 2）分泌表达产物过糖基化
酿酒酵母信号肽特点
*保守性低，大多异源宿主系统的信号肽不能互用
*信号肽结构：
信号肽剪切位点 Met
正电荷区
疏水区
极性区
目的蛋白
MF-α信号肽
*分泌效率高
*在酵母系统具有通用性
*88个残基组成
Met KEX2 DAP DAP来自-Lys-Arg-Glu-Ala-Glu-Ala目的蛋白 DAP：STE13编码的二肽酶
（二） 甲醇酵母表达系统
甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子 甲醇酵母表达系统的优缺点 甲醇酵母表达系统操作原理 甲醇酵母系统高效表达影响因素与对策 甲醇酵母表达系统的应用
1、甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子
甲醇酵母（methylotrophic yeast) 指可利用甲醇作单一碳源的一类酵母。 毕赤酵母（Pichia pastoris) 汉森酵母（Hansenula ploymorpha) 假丝酵母（Candia boidinii)
2、甲醇酵母表达系统的优缺点
A、表达水平高（最高水平的系统） B、产物可翻译后修饰：糖基化、磷酸化、酰脂化 C、过糖基化程度比酿酒酵母少（8-15个vs100-150 个甘露糖） D、产物可正确折叠和高效分泌（最高分泌表达系统） E、可利用简单无机盐培养基高密度发酵，生物量大。 F、实验室和工业操作简单 G、不能满足结构要求严格的糖基化
2）基因剂量
外源基因表达存在基因剂量效应 筛选多拷贝整合子
载体引入G418/Zeocin抗性标记，整合子拷贝数 与抗性成正相关，采用高G418/Zeocin抗性转化子。
体外串联多个表达盒，直接获多拷贝整合子 采用YRp型载体稳定化技术获高拷贝整合子 构建高拷贝整合型表达载体
3）整合位点
外源基因表达盒整合于AOX/MOX或标记基因处，均 可高效表达
GAL80
GAL4
UAS
GAL1
GAL7
GAL10
A、 GAL1、GAL7和 GAL10基因连锁在一起，独立转录，共同调控 B、GAL4产物与UAS结合，促进转录；GAL80产物抑制GAL4产物的活性，阻遏转录
C、野生型GAL4表达水平低，产物活性可被GLAL80产物完全抑制，半乳糖诱导效果差
2）半乳糖激酶启动子（GAL1）
B、PHO4基因编码产物是PHO5启动子的正调控因子
C、pho4TS 温度敏感，35℃时失活，PHO5关闭 D、pho4TS-PHO5启动子通过降温（23℃）诱导表达
2、酿酒酵母分泌系统
酿酒酵母系统常用分泌信号肽来源：
性结合因子：MF-α
酸性磷酸酯酶：PHO5
蔗糖酶：SUC2 杀手毒素因子：KIL
宿主株:GS115、KM71 可插入位点： 5’AOX1 3’AOX1 TT 转化子： GS115:His+Mut+ KM71:His+Muts
2）HIS4位点插入
宿主株:GS115、KM71
可插入位点： 5’His4 3’His4
转化子： GS115:His+Mut+
KM71:His+Muts
3） 多基因插入事件（串联整合）
B、缺陷型标记基因：Leu2d 提高选择压力
C、抗性标记；neo
提高选择压力
甲醇酵母系统胞内表达载体
需要带入ATG
表达载体类型
单位点
甲醇酵母系统胞内表达载体
需要带入ATG
多位点
表达载体类型
甲醇酵母系统分泌表达载体
信号肽：PHO1
甲醇酵母系统分泌表达载体
信号肽：MFα
甲醇酵母系统分泌表达载体