枯草芽孢杆菌表达系统
枯草芽孢杆菌表达系统
基因工程中新型表达系统
-B.subtilis 表达系统
生物工程学院 生工1005
Diagram
宿主菌株
表达载体
存在问题
工业应用
宿主菌株—枯草芽孢杆菌
• B. subtilis属革兰氏阳性菌，细胞壁仅含肽聚糖和磷壁质。 • 非致病性的重要工业微生物，其全基因组测序已经完成。人们 对其遗传背景和生理特性的了解仅次于E.coli。 • 70年代后，随着DNA重组技术的发展，金黄色葡萄球菌抗性 标记质粒的应用，该表达系统发展更为迅速。 • 成功表达了多种外源基因，广泛应用于工业生产,发现了本系 统的许多特点，同时也暴露出本系统存在蛋白酶和质粒不稳定 等问题.
• 限制外源蛋白在枯草杆菌中高效表达的瓶颈。 • 质粒本身的不稳定性： 分离型不稳定：整个质粒丢失 结构型不稳定：质粒本身非常规重组 • 菌株特性引起的不稳定性 原噬菌体3区域中编码的基因使得重组质粒的转化 效率急剧下降，同时对外源基因有排斥性。 • 如何解决： 构建整合质粒，构建原噬菌体3区域的缺陷性菌株。
芽孢杆菌表达的外源蛋白1耐热性酶制剂如耐高温淀粉酶等淀粉加工酶系2多肽类药物如白细胞介素人表皮生长因子hegf胰岛素原等3杀虫蛋白如bt蛋白蛋白酶抑制剂植物凝集素很多都已经用于商业化生产全球最大的egf供应商北京百胜思生物工程有限公司中科院遗传研究所汤懋竑教授汤氏芽孢杆菌基因工程系统bsubtilis表达系统有着较多的优点相对于大肠杆菌表达系统研究较少存在问题也很多仍需要进行大量的实验对它的稳定性以及表达系统进行更好的了解其优势将逐步显现成为未来外源基因最具潜力的表达载体
B.subtilis表达系统有着较多的优点，相对于大肠杆菌 表达系统研究较少，存在问题也很多，仍需要进行大量的实 验对它的稳定性以及表达系统进行更好的了解 其优势将逐步显现，成为未来外源基因最具潜力的表达 载体。
枯草芽孢杆菌表达质粒的构建及其脂肪酶的表达的开题报告
枯草芽孢杆菌表达质粒的构建及其脂肪酶的表达的开题报告一、研究背景和意义随着生物技术的迅猛发展，表达系统逐渐成为制备高纯度、活性蛋白质的主要手段之一。
枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis) 是一种广泛存在于自然界中的革兰氏阳性细菌，又称为草枯菌，是一种常见的微生物。
它具有较高的代谢能力、能够在大气压下生长、具有广谱的载体兼容性和简单的培养条件，成为了一种常见的宿主表达系统。
同时，脂肪酶作为重要的生物催化剂，具有广泛的用途，如食品加工、制药、石油化工等领域，因此，研究枯草芽孢杆菌中脂肪酶的表达，对于开发新的生物催化剂有着重要的意义。
二、研究内容和目的本研究旨在构建一种可以高效表达脂肪酶的枯草芽孢杆菌表达质粒，通过分析不同培养条件下脂肪酶的表达情况，优化脂肪酶的表达效果，为后续生物催化研究提供基础支撑。
三、研究方法和步骤1. 构建质粒：设计脂肪酶基因的引物和连接酶切位点，并通过PCR扩增目标基因；将扩增的脂肪酶基因与表达质粒进行连接；将构建好的质粒进行酶切和测序验证。
2. 转化宿主细胞：将构建好的质粒转化到枯草芽孢杆菌中，并进行筛选得到表达脂肪酶的阳性克隆。
3. 分析脂肪酶的表达情况：通过酶活性检测、SDS-PAGE、Western blot等方法分析脂肪酶的表达情况。
4. 培养条件优化：在不同培养条件下测试脂肪酶的表达情况，如不同温度、不同基质、不同的培养时间等，通过比较脂肪酶的表达和酶活性，优化脂肪酶的表达条件。
四、预期结果和意义本研究将构建一种高效表达脂肪酶的枯草芽孢杆菌表达质粒，并优化脂肪酶的表达条件，预期在此基础上获得高效的脂肪酶表达体系。
此研究可以为生物催化领域的发展提供参考和支持，同时为生物技术研究的发展提供新的思路和方法。
蛋白分泌表达枯草芽孢杆菌来表达
枯草芽孢杆菌,学名Bacillus subtilis,是一种被广泛应用于工业生产的革兰氏阳性细菌;与大肠杆菌不同,枯草芽孢杆菌没有外层膜,分泌的蛋白能直接释放到培养基中,是一种理想的原核蛋白分泌表达菌株;那么作为一种潜能巨大的原核表达系统,它究竟强在哪些方面呢且让AtaGenix为您一一道来;枯草芽孢杆菌的安全性是食品级的,收录于FDA的GRAS菌中,欧洲食品安全局认为枯草芽孢杆菌可用于食品发酵;很多常用食品工艺中都能见到它的身影;与大肠杆菌相比,枯草芽孢杆菌的细胞壁组成简单,只含肽聚糖和磷壁酸,在分泌的蛋白质产品中不会混杂有类似革兰氏阴性菌细胞壁成分中的热源性脂多糖内毒素等物质;该表达系统用于药用蛋白的表达纯化时还可省掉去除内毒素这一步;同为原核生物界的明星,虽然大肠杆菌和枯草芽孢杆菌都只需短时间就可表达和积累大量目标蛋白;但大肠杆菌在后续发酵工艺中需要对收集的菌体进行破胞处理,而枯草芽孢杆菌得益于其本身所拥有的一套高效分泌信号肽及分子伴侣系统,只要简单处理发酵上清就能得到较纯的蛋白,并且表达的蛋白在多数情况下具有天然构象和生物活性;蛋白质组学研究表明,枯草芽孢杆菌中至少有四种蛋白质分泌途径,其中Sec 分泌途径是主要分泌途径;另外枯草芽孢杆菌拥有良好的发酵生产技术,目前大部分商业化的蛋白水解酶和淀粉酶都是由其发酵得到的;AtaGenix拥有的5 L、20 L、150 L及其他型号的发酵罐上图就是真相,可满足各种大规模发酵的需求;虽然枯草芽孢杆菌表达外源蛋白潜力无限,但也有其短板,如自身胞外蛋白酶对表达产物的降解、遗传操作相对困难、外源蛋白有时得不到有效的表达等等;但AtaGenix却能成功避免以上问题使外源目标蛋白在枯草芽孢杆菌表达系统中有效表达,这主要得益于以下三个方面的优势：①丰富的表达宿主由于枯草芽孢杆菌没有明显的密码子偏爱性,表达外源蛋白时无需对DNA序列进行优化;在不同宿主中表达时,蛋白表达情况可能有差异;在AtaGenix拥有的多种枯草芽孢杆菌表达宿主中,1012 wild type宿主菌是最常用到的,可作为胞内和胞外表达的通用菌；168 Marburg遗传背景清楚,是研究枯草芽孢杆菌的标准菌株；AS1作为胞内表达的备用菌株,常用于表达外源蛋白;而胞外蛋白酶缺陷菌株WB800N能有效解决由于枯草芽孢杆菌丰富的蛋白酶导致的蛋白表达产物降解问题;②给力的表达载体大部分的枯草芽孢杆菌不含内源性质粒,并且一般不能识别大肠杆菌中的启动子;最初的枯草芽孢杆菌载体源于金黄色葡萄球菌,其结构不稳定并易丢失;现在普遍使用的质粒载体是由枯草芽孢杆菌隐性质粒与大肠杆菌质粒构成的穿梭载体,可在大肠杆菌中完成基因片段的连接克隆等遗传操作,然后转入枯草芽孢杆菌进行外源基因的表达;AtaGenix使用的pHT系列载体拥有枯草芽孢杆菌的σA-依赖性的强启动子,配以gro E启动子和lac操纵子,能够通过IPTG诱导来启动外源基因的表达;通过添加枯草芽孢杆菌中编码α-淀粉酶的amyQ基因的信号肽编码区域,构成了能够将目标蛋白有效分泌至胞外的表达载体,如pHT43;③有效的转化手段枯草芽孢杆菌早期比较通用的转化方法是Spizizen转化法接合转化,但在枯草芽孢杆菌的生长周期中能自发形成感受态的菌株极少,并且感受态保存时间短暂;电转化法操作简单并且转化率相对较高,AtaGenix通过优化电转条件上图为AtaGenix实验室的电转仪实拍,将其用于枯草芽孢杆菌的转化,可以有效缩短转化时间并使转化阳性率达到90%以上;与大肠杆菌相比,枯草芽孢杆菌表达系统还不是很完善,相信随着对其研究的不断深入,它在今后的发展中一定会大放光彩;毕竟,相对于真核表达系统,枯草芽孢杆菌表达系统周期短、成本低、表达量较高这些优势还是很吸引人的;当然,AtaGenix也期待更多新的表达系统可以服务科研,造福人类;。
枯草芽孢杆菌表达系统及抗菌肽的表达综述-畜牧兽医论文-农学论文
枯草芽孢杆菌表达系统及抗菌肽的表达综述-畜牧兽医论文-农学论文——文章均为WORD文档，下载后可直接编辑使用亦可打印——由于抗生素药物的滥用，出现了越来越多的抗生素耐药菌株，传统抗生素替代药物的开发已成为目前研究热点。
在生物机体中分离出的抗菌肽被认为是一种最有潜力的抗菌类药物。
抗菌肽一般含有10 ~ 50 个氨基酸，整体带有2 ~ 9 个的正电荷，较大部分（30%）的疏水性氨基酸（Hancock 和Sahl,2006）。
抗菌肽具有抗菌谱广、抗菌活性高、不易产生耐药性、无毒副作用（仅少数种类具有溶血活性）、无残留与无污染等优点，符合畜产品安全生产的需要，适合在饲料生产中使用，具有作为新一代饲料添加剂的潜质（单安山等，2012）。
枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是广泛存在于土壤和动物胃肠道的一类革兰氏阳性菌，目前已作为重要的工业菌种被越来越多地应用于畜牧业生产中。
枯草芽孢杆菌具有易于分离培养、较清晰的遗传背景、良好的分泌性及无致病性等优点。
近几年来利用重组枯草芽孢杆菌生产饲用酶、饲用活性代谢产物以及作为肠道益生菌成为热点研究领域。
本文对枯草芽孢杆菌表达系统及抗菌肽在其中的表达进行了简要的综述，以期为开发饲用型抗菌制剂提供参考。
1 枯草芽孢杆菌表达系统枯草芽孢杆菌属于芽孢杆菌属，是一类好氧型、内生抗逆性孢子的革兰氏阳性菌。
其细胞呈直杆状，大小为（0.8 ~ 1.2）m（1.5 ~ 4.0）m,广泛分布于土壤及腐败的有机物中。
因其培养简单快速，具有较强的分泌蛋白质的能力、非致病性及良好的发酵基础和生产技术，故枯草芽孢杆菌是目前生产各种工业用酶，如淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶等的理想表达宿主，是微生物研究领域中的一种重要模式菌株。
枯草芽孢杆菌具有自己独特的生长规律：生长延滞期、对数期、稳定期、衰亡期及芽孢发育期。
其在不同的生长阶段基因表达不同，有多种不同时序性的因子来调节（Staroń 等，2009）。
饲用枯草芽孢杆菌表达系统研究进展
饲用枯草芽孢杆菌表达系统研究进展杨明明;陈玉林【摘要】枯草芽孢杆菌是一种广泛应用于畜牧业生产的革兰氏阳性菌.随着现代生物技术的发展,利用重组枯草芽孢杆菌生产饲用酶、饲用活性代谢产物以及作为肠道益生菌成为热点研究领域.枯草芽孢杆菌表达系统是重组枯草芽孢杆菌的核心,论文对枯草芽孢杆菌表达系统的研究进展与存在问题进行了简要综述.【期刊名称】《家畜生态学报》【年(卷),期】2013(034)012【总页数】7页(P1-7)【关键词】枯草芽孢杆菌;表达系统;质粒载体;启动子【作者】杨明明;陈玉林【作者单位】西北农林科技大学动物科技学院陕西杨凌712100;西北农林科技大学动物科技学院陕西杨凌712100【正文语种】中文【中图分类】S811.6枯草芽孢杆菌是广泛存在于土壤和动物胃肠道的一类革兰氏阳性菌,因其易于分离培养，具有较清晰的遗传背景和良好的分泌性，又无致病性等特点，已成为重要的工业菌种，被越来越多地应用于畜牧业生产中[1-3]。
近年来，随着分子生物学技术和基因工程技术的发展，利用重组枯草芽孢杆菌生产饲用酶、饲用活性代谢产物以及作为肠道益生菌成为热点研究领域。
然而，本研究领域经过近十年的发展，虽然已有一些可用于枯草芽孢杆菌的表达系统，但仍存在如嵌合载体拷贝数低、转化方法效率低、启动子活性低、目标基因表达量低等问题，严重限制了枯草芽孢杆菌在饲用酶和益生菌工业生产中的应用和发展[4-6]。
本文将对枯草芽孢杆菌表达系统的载体和启动子元件作一简要综述，以期为饲用枯草芽孢杆菌的表达系统研究和应用提供基础材料。
1 枯草芽孢杆菌的表达系统概述枯草芽孢杆菌作为研究革兰氏阳性菌的模式菌，具有遗传和生理生化背景清晰、蛋白分泌性好和非致病性的特点，被认为是生物安全级别的微生物，目前作为重要的益生菌和饲用酶生产菌种，在饲料工业中被广泛利用[1-2]。
随着现代DNA重组技术的发展和枯草芽孢杆菌全基因组DNA测序的完成，枯草芽孢杆菌基因工程得到了进一步的发展。
枯草芽孢杆菌 原核表达
枯草芽孢杆菌原核表达枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是一种常见的芽孢形成革兰氏阳性细菌，属于原核生物。
它具有广泛的应用价值，尤其在原核表达领域中发挥着重要作用。
枯草芽孢杆菌的原核表达是指利用该菌株进行蛋白质的表达和产生。
原核表达是一种常用的表达系统，用于生产大量蛋白质。
枯草芽孢杆菌作为一种优良的表达宿主，具有以下几个优点：枯草芽孢杆菌具有较高的生长速度和较简单的培养条件。
它可以在常见的培养基上生长，并且生长周期相对较短，可以在较短的时间内获得较高的细胞密度。
这为大规模的蛋白质表达提供了便利。
枯草芽孢杆菌的遗传工具相对完善，具有多种可供选择的表达载体和表达系统。
研究人员可以选择适合自己实验需求的表达载体，并通过基因工程手段将目标基因插入到载体中，实现目标蛋白的表达。
此外，枯草芽孢杆菌还具有多种启动子和信号肽，可以根据实验需要选择适合的启动子和信号肽，进一步提高目标蛋白的表达水平。
枯草芽孢杆菌的表达产物往往具有较高的稳定性和纯度。
由于其细胞壁较坚韧，可以保护内部表达产物不受外界环境的影响。
此外，枯草芽孢杆菌的分泌系统也可以将目标蛋白直接分泌到培养基中，减少了目标蛋白的提取和纯化步骤，从而提高了蛋白质的纯度。
枯草芽孢杆菌的原核表达系统还可以进行多种表达策略的组合应用。
例如，可以利用枯草芽孢杆菌同时表达多个基因，实现多蛋白质的协同表达。
此外，还可以通过调控表达载体中的启动子和信号肽的强度，实现目标蛋白在不同阶段的表达，从而满足不同实验需求。
枯草芽孢杆菌的原核表达系统具有许多优点，使其成为广泛应用于蛋白质表达和生产的重要宿主。
随着基因工程和蛋白质工程的发展，枯草芽孢杆菌原核表达系统还将进一步完善和优化，为科研人员和工业生产提供更多的选择和便利。
蛋白分泌表达,枯草芽孢杆菌来表达
蛋白分泌表达,枯草芽孢杆菌来表达Document serial number【NL89WT-NY98YT-NC8CB-NNUUT-NUT108】枯草芽孢杆菌，学名Bacillus subtilis，是一种被广泛应用于工业生产的革兰氏阳性细菌。
与大肠杆菌不同，枯草芽孢杆菌没有外层膜，分泌的蛋白能直接释放到培养基中，是一种理想的原核蛋白分泌表达菌株。
那么作为一种潜能巨大的原核表达系统，它究竟强在哪些方面呢？且让AtaGenix为您一一道来。
枯草芽孢杆菌的安全性是食品级的，收录于FDA的GRAS菌中，欧洲食品安全局认为枯草芽孢杆菌可用于食品发酵。
很多常用食品工艺中都能见到它的身影。
与大肠杆菌相比，枯草芽孢杆菌的细胞壁组成简单，只含肽聚糖和磷壁酸，在分泌的蛋白质产品中不会混杂有类似革兰氏阴性菌细胞壁成分中的热源性脂多糖（内毒素）等物质。
该表达系统用于药用蛋白的表达纯化时还可省掉去除内毒素这一步。
同为原核生物界的明星，虽然大肠杆菌和枯草芽孢杆菌都只需短时间就可表达和积累大量目标蛋白。
但大肠杆菌在后续发酵工艺中需要对收集的菌体进行破胞处理，而枯草芽孢杆菌得益于其本身所拥有的一套高效分泌信号肽及分子伴侣系统，只要简单处理发酵上清就能得到较纯的蛋白，并且表达的蛋白在多数情况下具有天然构象和生物活性。
蛋白质组学研究表明，枯草芽孢杆菌中至少有四种蛋白质分泌途径，其中Sec 分泌途径是主要分泌途径。
另外枯草芽孢杆菌拥有良好的发酵生产技术，目前大部分商业化的蛋白水解酶和淀粉酶都是由其发酵得到的。
AtaGenix拥有的 5 L、20 L、150 L及其他型号的发酵罐（上图就是真相），可满足各种大规模发酵的需求。
虽然枯草芽孢杆菌表达外源蛋白潜力无限，但也有其短板，如自身胞外蛋白酶对表达产物的降解、遗传操作相对困难、外源蛋白有时得不到有效的表达等等。
但AtaGenix却能成功避免以上问题使外源目标蛋白在枯草芽孢杆菌表达系统中有效表达，这主要得益于以下三个方面的优势：①丰富的表达宿主由于枯草芽孢杆菌没有明显的密码子偏爱性，表达外源蛋白时无需对DNA序列进行优化。
枯草芽孢杆菌表达系统及其启动子研究进展
枯草芽孢杆菌表达系统及其启动子研究进展余小霞;田健;刘晓青;伍宁丰【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2015(000)002【摘要】枯草芽孢杆菌作为一种革兰氏阳性细菌，由于其具有非致病性、分泌蛋白能力强的特性和良好的发酵基础及生产技术，是目前原核表达系统中表达和分泌外源蛋白的理想宿主，成为原核表达系统中的一种重要的模式菌株。
而实现外源蛋白的高效表达的关键因素之一是使用强并可控制的启动子。
目前，枯草芽孢杆菌中常用的启动子为组成型、诱导物诱导型、时期特异性及自诱导型。
详细介绍枯草芽孢杆菌表达系统以及其常用启动子的优缺点，并对克隆新的启动子的方法做了总结，旨为完善枯草表达系统和工业生产外源蛋白奠定基础。
%As a Gram-positive bacteria, Bacillus subtilis is an attractive host for the production of heterologous secretory proteins for several reasons:it is non-pathogenic and the capable of secreting functional extracellular proteins directly tothe culture medium, a great deal of vital information concerning large scale fermentation and production technology. One of the key factors for achieving high-level expression of heterologous proteins is the use of a strong and control promoter. In present, the promoters of Bacillus subtilis can be classified into three categories:constitutive promoters, inducer-specific promoters and autoinducible promoters. This paper described the advantages and disadvantages of Bacillus subtilis expression system and the classification of promoters. At the same time, we summarized themethods of the amplification of new promoters, which provided a foundation for improving Bacillus subtilis expression systems and the industrial production of heterologous proteins .【总页数】10页(P35-44)【作者】余小霞;田健;刘晓青;伍宁丰【作者单位】中国农业科学院生物技术研究所，北京 100081;中国农业科学院生物技术研究所，北京 100081;中国农业科学院生物技术研究所，北京 100081;中国农业科学院生物技术研究所，北京 100081【正文语种】中文【相关文献】1.食品级枯草芽孢杆菌表达系统的最新研究进展 [J], 王金斌;陈大超;李文;蒋玮;李鹏;张倩倩;唐雪明2.枯草芽孢杆菌表达系统及其启动子的研究进展 [J], 熊海涛;韦宇拓3.饲用枯草芽孢杆菌表达系统研究进展 [J], 杨明明;陈玉林4.枯草芽孢杆菌表达系统研究进展 [J], 马平英;罗雯;詹怡昕;吴楚楚;熊雨顺;许小群;陈梅5.枯草芽孢杆菌信号肽依赖分泌表达系统研究进展 [J], 段春燕;井明博;宋曦因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
枯草芽孢杆菌 表达系统 工业化
枯草芽孢杆菌表达系统工业化示例文章篇一：《神奇的枯草芽孢杆菌表达系统与工业化》嗨，大家好！今天我想和你们聊聊一个超级有趣的东西——枯草芽孢杆菌表达系统，还有它在工业化里的那些事儿。
我第一次听到“枯草芽孢杆菌”这个名字的时候，就觉得它特别酷。
它就像是一个小小的魔法工厂，在微观的世界里默默地做着了不起的工作。
枯草芽孢杆菌是一种细菌，你们可别小瞧它哦。
它虽然小得我们用肉眼都看不见，可是它的本事可大着呢！我记得有一次在科学课上，老师给我们讲微生物的时候提到了枯草芽孢杆菌。
老师说，这个枯草芽孢杆菌表达系统就像是一个超级复杂又超级精密的机器。
这个“机器”能够生产各种各样有用的东西。
比如说，有些药就是通过这个表达系统来制造的。
我当时就想，哇，这么小的东西怎么能做出药来呢？这就好像是让一只小蚂蚁去盖一座大房子一样不可思议。
我回家就拉着爸爸问这个事儿。
爸爸笑着说：“宝贝啊，这枯草芽孢杆菌表达系统就像是一个厨师，有自己独特的厨艺。
它可以按照我们给它的‘菜谱’，也就是基因，来做出我们想要的东西。
”我似懂非懂地点点头。
那这个枯草芽孢杆菌表达系统在工业化里到底有多重要呢？我来给你们好好讲讲。
在工业化的大舞台上，它就像是一颗耀眼的明星。
工业化生产就像是一场大型的音乐会，需要各种各样的乐器来演奏出美妙的音乐。
而枯草芽孢杆菌表达系统就像是其中一种独特的乐器。
比如说在生产酶的时候。
酶是一种很神奇的东西，它可以让很多化学反应变得更快更容易。
就像我们跑步的时候，有个加速器一样。
有一个生产酶的工厂，那里的叔叔阿姨们就用枯草芽孢杆菌表达系统来制造酶。
我想象着那些微小的枯草芽孢杆菌在大大的反应罐里忙碌着，就像一群小工人在巨大的工厂里加班加点地工作。
我有个同学叫小明，他的爸爸就在这样的工厂工作。
有一次我和小明聊天，我就好奇地问他：“你爸爸在工厂里是不是能看到那些枯草芽孢杆菌啊？”小明说：“哪能看到啊，它们太小了。
不过我爸爸说那些菌可听话了，只要给它们合适的条件，它们就会乖乖地按照要求生产出好多有用的东西。
枯草芽孢杆菌表达系统研究进展
第38卷第6期 注 為 科 修Vol. 38 No. 62020 年 12 月JIANGXI SCIENCED" 2020doi ：10.13990/j. ()1001 -3679.2020.06.016枯草芽抱杆菌表达系统研究进展马平英，罗雯3,詹怡昕，吴楚楚，熊雨顺，许小群，陈梅4南昌师范学院生物系,330032，南昌)摘要:枯草芽抱杆菌是一种土壤来源的、低G + C 、内生抱子革兰氏阳性细菌。
其所属芽抱杆菌属是微生物发酵中的主要细菌，该细菌被认为是理想的模式生物。
枯草芽抱杆菌应用广泛，且因其具有非致病性、抗药性有限、为益生菌菌株等优点，可以直接用于人体和动物。
综述枯草芽抱杆菌的优点、表达系统的发展及其在各个领域的应用进展，从而在理论和实践两方面为枯草芽抱杆菌的表达系统研究提供可以借鉴的依据和思路。
关键词：枯草芽抱杆菌；遗传转化;表达;应用；进展中图分类号:Q939. 9文献标识码:A 文章编号:1001 -3679(2020)06 -867 -05Research Progress of Bacillus subtilis Expression SystemMA Pingying, LUO Wen ** , ZHAN Yixin, WU Chuchu , XIONG Yushun, XU Xiaoqun, CHEN Mei 收稿日期:2020 - 10 - 24；修订日期:2020-11 -10作者简介:马平英(1999—),女，本科，研究方向:生物科学。
基金项目：国家级大学生创新创业训练计划项目(201614437004)；南昌师范学院学生科研项目(19XSKY51 )o*通信作者:罗 雯(1974—),女，博士，教授，研究方向为应用微生物学。
E-mail ： ***************。
(Department of Biology, Nanchang Normal University , 330032, Nanchang , PRC)Abstra^: BadUus subtilis is a kind of soil - derived gram 一 positive bacterium with low G + C andendospore. Badllus is the main bacmia in microbial feanentation , which is sonsidered th be an iVe- al model oreanism. BadUus subtilis is wiVely used and it ccn be directly used in human body andanimals beccuse of its non - pathoocnic , limited resistance and being probiotic strains. The purpose of this paper was ta eeview the adventages of Badllus subtilis , the development of the expression sys tem and i I s application in veaoueields, ss as th previde referencc basis and ides for the study of the exprssion system of Bacillus subtilis in theory and practica.Key %ords ：Bad,llus subtilis p genetic transformation ； expression ； application ； prooress0引言枯草芽抱杆菌(Badllus subtilis)是一种理想 型的模式生物，其应用价值很高,培养简单快速, 具有非致病性及良好的发酵基础和生产技术等优势，是目前生产各种工业用酶的理想表达宿主。
枯草芽孢杆菌高效表达系统的构建
枯草芽孢杆菌高效表达系统的构建
枯草芽孢杆菌是一种用途广泛、分离鉴定容易、具有生物修复、生物降解、蛋白质合成等功能的优质保守菌种，因而在环境生物技术和生物有机合成以及分子学研究方面有着广泛的应用前景。
由于枯草芽孢杆菌具有低温、药物抗性强，抗酸、耐盐、耐重金属和活性细菌的特性，可以在复杂的环境中存活，随着相关技术的不断完善，一种高效的枯草芽孢杆菌表达系统正在逐步诞生。
枯草芽孢杆菌表达系统的构建首先应考虑对蛋白质研究的应用，包括表达量、效率、稳定和种类等。
构建高效的枯草芽孢杆菌表达系统需要优化以下几个关键方面：一是筛选和构建枯草芽孢杆菌表达载体，研究者可以通过基因重组技术建立枯草芽孢杆菌表达载体，使其具有较高的表达量和定向表达性；二是利用枯草芽孢杆菌合成等技术，选择优秀的发酵培养条件，提高抑制剂的状态；三是枯草芽孢杆菌的分离鉴定，建立一个良好的分离鉴定方法，以确保有效表达正确的目标蛋白质；最后，需要建立一种有效的表达分析方法，以观察目标蛋白质的表达变化，以便传输给其他进一步研究的学者。
枯草芽孢杆菌的表达系统是一种非常有效的方法，可以有效地提高环境生物技术、生物有机合成和分子学研究的效率，使研究者可以以更高的效率得到更多的有价值的结果。
在一系列的关键步骤中，利用现有的技术和经验，以及系统的优化和分析，研究者们能够创造出更高效的枯草芽孢杆菌表达系统，从而有助于将枯草芽孢杆菌所具有的诸多优点作用于研究中。
枯草芽孢杆菌表达系统的原理
枯草芽孢杆菌表达系统的原理枯草芽孢杆菌表达系统是一种重要的重组蛋白表达系统，广泛地应用于生物技术研究和工业生产中。
本文将详细介绍枯草芽孢杆菌表达系统的原理。
一、枯草芽孢杆菌的特点及表达机制枯草芽孢杆菌是一种革兰氏阳性菌，常生长在土壤和泥土中。
其表达机制为在细胞内部产生大量的蛋白质，并通过生长期间的细胞泀水产生的孢子释放到外界。
枯草芽孢杆菌天然含有的一些基因表达产物可以抑制其他微生物的生长，所以被认为是一种潜在的生物农药。
二、枯草芽孢杆菌表达系统的结构组成枯草芽孢杆菌表达系统主要是由表达载体、诱导剂和宿主菌三部分组成。
1.表达载体枯草芽孢杆菌表达载体一般包括以下几个部分：(1)选择标记基因：该基因能够方便地筛选出已经转化成功的细胞。
(2)启动子和调控元件：用于调节目标基因的表达量。
(3)多克隆位点：利用该位点可以方便地克隆多个目标基因。
(4)信号肽：可将目标蛋白导向到特定的细胞部位或细胞外界面。
2.诱导剂枯草芽孢杆菌表达系统的诱导剂主要分为两类：化学诱导剂和温度诱导剂。
对于许多表达载体而言，利用化学诱导剂可以实现目标蛋白的高效表达，而利用温度诱导剂则可以实现目标蛋白的原生态表达。
3.宿主菌枯草芽孢杆菌作为表达宿主菌，其优点是生长速度快、能量来源可靠、产量高等。
此外，枯草芽孢杆菌具有良好的内源性分泌系统，可以使得目标蛋白得到有效的分泌和表达。
三、枯草芽孢杆菌表达系统原理的实现过程枯草芽孢杆菌表达系统主要的实现流程如下：1.构建表达载体根据需要表达的目标蛋白的类型和结构，进行载体的构建和改造。
2.将表达载体转化至宿主菌将经过改造的表达载体转化至宿主菌中，利用下合子实现转化效率的控制。
3.诱导表达目标蛋白根据诱导剂的类型和浓度，在不同的条件下引导宿主菌表达目标蛋白。
4.分离和纯化目标蛋白根据目标蛋白的性质和重量，利用不同的纯化技术将目标蛋白分离纯化出来。
四、枯草芽孢杆菌表达系统的应用情况枯草芽孢杆菌表达系统的应用不仅局限于基础生物学研究领域，同时也广泛应用于医学、环保、工业等诸多领域。
枯草芽孢杆菌表达系统的原理
枯草芽孢杆菌表达系统的原理枯草芽孢杆菌是一种常见的细菌，具有广泛的应用价值。
枯草芽孢杆菌表达系统是一种常用的蛋白质表达系统，其原理是利用枯草芽孢杆菌作为宿主细胞来表达目标蛋白质。
枯草芽孢杆菌是一种革兰氏阳性细菌，具有较强的耐热性和耐酸性，能够在广泛的温度和pH条件下生长。
此外，枯草芽孢杆菌具有较高的产量和分泌能力，能够快速高效地表达目标蛋白质。
枯草芽孢杆菌表达系统的原理主要分为以下几个步骤：1. 选择适当的表达载体：表达载体是将目标基因导入宿主细胞的载体，其中包含了启动子、转录终止子、选择标记等功能元件。
根据需要选择合适的表达载体，将目标基因插入载体中。
2. 转化宿主细胞：将重组的表达载体导入枯草芽孢杆菌中，使其与宿主细胞发生转化。
转化可以通过化学法、电转化等方法进行。
3. 选择阳性克隆株：通过添加适当的选择抗生素，筛选出带有目标基因的阳性克隆株。
这些阳性克隆株含有目标基因，可以通过后续步骤进行蛋白质表达。
4. 表达蛋白质：将阳性克隆株进行培养，使其在适当的条件下表达目标蛋白质。
在培养过程中，可以通过调整培养基组分、温度、pH 等条件来提高蛋白质的表达水平。
5. 纯化目标蛋白质：通过蛋白质纯化技术，将目标蛋白质从细胞中提取出来，并去除其他杂质。
常用的纯化方法包括亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等。
枯草芽孢杆菌表达系统具有许多优点，使其成为广泛应用的蛋白质表达系统之一。
首先，枯草芽孢杆菌具有较高的表达水平和分泌能力，可以快速高效地表达目标蛋白质。
其次，枯草芽孢杆菌的生长条件相对简单，培养成本较低，适用于大规模生产。
此外，枯草芽孢杆菌的表达系统对多种表达载体和宿主细胞具有较好的兼容性，可以灵活选择合适的实验方案。
然而，枯草芽孢杆菌表达系统也存在一些限制。
首先，由于枯草芽孢杆菌属于革兰氏阳性细菌，其表达的蛋白质主要定位在胞内，对于定位在细胞外的蛋白质表达效果较差。
其次，枯草芽孢杆菌表达系统在某些情况下可能会出现蛋白质不稳定、聚集、失活等问题，需要针对不同的目标蛋白质进行优化。
一种枯草芽孢杆菌自调控表达系统及其构建方法和应用[发明专利]
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专利名称：一种枯草芽孢杆菌自调控表达系统及其构建方法和应用
专利类型：发明专利
发明人：陈坚,堵国成,康振,杨森
申请号：CN201410447500.X
申请日：20140903
公开号：CN104212830A
公开日：
20141217
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种枯草芽孢杆菌自调控表达系统及其构建方法和应用，属于基因工程领域。
本发明的表达系统包括一种木糖诱导表达核酸内切酶基因的枯草芽孢杆菌和一种组成型表达抗核酸内切酶基因的质粒表达载体。
在含有诱导剂木糖存在的培养基中，只有含有稳定存在该表达载体的枯草芽孢杆菌才能正常生长。
利用本发明表达系统分别表达了荧光蛋白基因(gfp)、透明质酸合成酶基因(hasA)和角蛋白酶基因(ker)，通过发酵培养，荧光强度、透明质酸含量和角蛋白酶活分别比利用抗生素维持的质粒提高21.8％、45％和30.2％。
申请人：江南大学
地址：214122 江苏省无锡市蠡湖大道1800号
国籍：CN
代理机构：北京爱普纳杰专利代理事务所(特殊普通合伙)
代理人：张勇
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枯草芽孢杆菌的介绍
枯草芽孢杆菌的介绍目录第一章芽孢杆菌的简要介绍 (1)第一节芽孢杆菌种类 (1)第二节芽孢杆菌表达系统发展简史 (2)第二章枯草芽孢杆菌的转化系统 (3)第一种方法：电转化 (3)第二种方法：Spizizen转化 (3)第三种方法：原生质体法(Takashi) (4)第四种方法：原生质体转化之二 (4)第五种转化方法：质粒混合法（BGSC推荐） (5)第三章芽孢杆菌表达系统发展简史 (6)第一节芽孢杆菌表达系统的优点（相对于大肠杆菌） (7) 第二节芽孢杆菌的缺点 (7)第三节助表达系统 (7)第四节芽孢杆菌基因表达的主要特点 (7)第四章枯草芽孢杆菌转录翻译系统 (8)第一节：转录系统 (9)第二节：翻译系统 (9)第五章芽孢杆菌常用的宿主和载体 (10)第六章芽孢杆菌表达系统应用实例 (11)1 中国 (11)2 日本 (12)3 加拿大 (12)第七章芽孢杆菌其他产品 (13)第一节核苷类产品 (13)第二节核黄素 (13)第三节微生物制剂/益生菌 (13)第八章结语 (14)附录一. 芽孢杆菌的相关经典文章 (14)附录二. 枯草芽孢杆菌相关数据库 (15)致谢及参考文献 (15)第一章芽孢杆菌的简要介绍芽孢杆菌作为一个属，于1872年被首次提出，至今已有一百多年。
目前人们对芽孢杆菌的研究几乎涉及到了革兰氏阳性可生孢细菌的各个领域。
尤其是在感受态、芽孢形成及其调控、遗传操作、菌种改良、生物技术等领域进行了大量的工作。
芽孢杆菌是一个泛泛的概念，而科学研究中应用最多的当属枯草芽孢杆菌，例如168菌株及其大量的衍生菌株。
枯草杆菌的研究之所以领先于其他芽孢杆菌的种，主要是由于他的转化、转导方法较完善，以及大量的衍生菌株。
目前应用最多的芽孢杆菌属菌种有枯草芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、球形芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌和耐碱的芽孢杆菌以及病原菌炭疽芽孢杆菌等12种。
枯草芽孢杆菌表达系统
1Bacillus Subtilis Expression Vectors Product Information and InstructionsNovember 20053generally regarded as safe); (ii) it has no significant bias in codon usage; (iii)it is capable of secreting functional extracellular proteins directly into the culture medium (at present, about 60% of the commercially available enzymes are produced by Bacillus species); (iv) a large body of information concerning transcription, translation, protein folding and secretion mechanisms, genetic manipulation and large-scale fermentation has been acquired.But there are also two obstacles reducing the use of B. subtilis : (i) production of a number of extracellular proteases which recognize and degrade heterologous proteins, and (ii) stable vector plasmids. The first obstacle has been largely solved by the construction of protease-deficient strains. And the second has been completely overcome by introducing plasmids using the theta-mode of replication such as those derived from the natural plasmids pAM β1 and pBS72 (Jannière et al., 1990; Titok et al., 2003).Quite recently, the construction and use of four different expression vectors based on the E. coli - B. subtilis shuttle vector pMTLBS72 exhibiting full structural stability was published (Nguyen et al., 2005).The two new vectors pHT01and pHT43 allow high-level expression of recombinant proteins within the cytoplasm, where pHT43 directs the recombinant proteins into the medium. Both vectors are based on the strong σA -dependent promoter preceding the groE operon of B. subtilis which has been converted into an efficiently controllable (IPTG-inducible) promoter by addition of the lac operator. Derivatives of pHT01 are available either with a 8xHis tag (pHT08), a Strep tag (pHT9) or a c-Myc tag (pHT10).II Aat IIXba IBam HI Xho I5II Xba IBam HI Xho IApa I P grac: P grac promoter (consisting of the gro E promoter; the lac O operator and the gsi B SD sequence)ColE1 ori: ColE1 origin Amp R : ampicillin resistance lacI: lacI gene (lac repressor)Cm R : chloramphenicol resistance SamyQ: amyQ signal sequenceComplete DNA sequence is available on request.tgcgcggaagccatcaccatcaccatcaccatcacGGATCC TCTAGA gtcgacgtcCCCGGGLocation of the Strep tag in pHT09:Strep tag Bam H I Xba I Sma IP grac -lacO-RBS-atgaattggagccatccgcaatttgaaaaaGGATCC TCTAGA gtcgacgtcCCCGGG Location of the c-Myc tag in pHT10:Bam H I Xba I c-Myc tagP grac -lacO-RBS-GGATCC TCTAGA gtcgacgtcgaacaaaaacttattagcgaagaagatctttaataacacgtc3. ProtocolsDetailed protocols for E. coli and Bacillus molecular genetic handling (growth, transformation etc.) can be found in the relevant laboratory manuals such as Sambrook and Russell (2001). For transformation of B. subtilis we recommend the protocol of Anagnostopoulos and Spizizen (1961), slightly modified:1.20 ml LS medium (Spizizen’s medium* supplemented with 0.5 %glucose, 5 µg/ml DL-tryptophane, 5 µg/ml uracil,0.01% casein hydrolysate, 0.1% yeast extract [Difco], 1 mM MgS04,2.5 mM MgCl 2, 0.5 mM CaCl 2) are inoculated with 1 ml of an 5 ml overnight culture grown in HS medium (Spizizen’s medium*supplemented with 0.5 % glucose, 50 µg/ml DL-tryptophane,50 µg/ml uracil, 0.02% casein hydrolysate, 0.1% yeast extract [Difco], 8µg/ml arginine, 0.4 µg/ml histidine, 1 mM MgSO 4) at 37°C, shaking slowly at 30°C for 3 to 4 hours.2.Incubate 1 ml of this HS culture (late log/early stationary phase; OD 578)with 10 µl of 0.1 M EGTA at room temperature for 5 minutes and add 1to 2 µg plasmid DNA.3.After shaking at 37°C for 2 hours for development of antibiotic resistance,the cells are plated on selective plates.*Spizizen's medium: 2 g (NH 4)2SO 4, 14 g K 2HPO 4, 6 g KH 2PO 4, 1 g sodium citrate;add 100 ml distilled water, autoclave, then add 0.1 ml 1 M MgSO 4.7。
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-B.subtilis 表达系统
生物工程学院 生工1005
Diagram
宿主菌株
表达载体
存在问题
工业应用
宿主菌株—枯草芽孢杆菌
• B. subtilis属革兰氏阳性菌，细胞壁仅含肽聚糖和磷壁质。 • 非致病性的重要工业微生物，其全基因组测序已经完成。人们 对其遗传背景和生理特性的了解仅次于E.coli。 • 70年代后，随着DNA重组技术的发展，金黄色葡萄球菌抗性 标记质粒的应用，该表达系统发展更为迅速。 • 成功表达了多种外源基因，广泛应用于工业生产,发现了本系 统的许多特点，同时也暴露出本系统存在蛋白酶和质粒不稳定 等问题.
芽孢杆菌表达的外源蛋白
1、耐热性酶制剂 酶系 如耐高温α-淀粉酶等淀粉加工
2、多肽类药物 如白细胞介素、人表皮生长因子 （hEGF）、胰岛素原等 3、杀虫蛋白 集素 如Bt蛋白、蛋白酶抑制剂、植物凝
很多都已经用于商业化生产 全球最大的EGF供应商—北京百胜思生物工程有限公司 中科院遗传研究所 汤懋竑教授 “汤氏芽孢杆菌基因工程系 统”
优点：相对分子质量小，有唯一的酶切位点，较高的拷贝数，
适合筛选的抗性标记
以天然质粒为基础构建：双标记质粒，穿梭质粒，探针质粒等
2、整合质粒载体 在大肠杆菌质粒载体基础上构建，含有芽孢杆菌的抗
性标记以及待整合目的基因，能通过同源重组整合到宿
主染色体上。
3、噬菌体载体
例如φ105噬菌体：温和性噬菌体、应用较多 SPβ噬菌体：原噬菌体，B .subtilis 168菌株及 其衍生菌株均带有此噬菌体。 sppl噬菌体：毒性噬菌体。
表达载体
• 结构
a. 多σ因子：迄今，在枯草杆菌中发现了10多个σ因子。
多σ因子与营养体的繁殖和芽孢形成有关，也与重叠启动 子、非重叠启动子有关。
•种类
1、自主复制质粒载体
芽孢杆菌中的质粒一般不带抗性标记，只有极少数带抗性标记，
如pBC16。 带有抗性标记的载体质粒多来自于其他革兰氏阳性菌，特别是 金黄色葡萄球菌，例如pUB110，pC194，pE194等。
优点：
• 非致病微生物，安全性高，可用于食品、药物等工业 生产。 • 能直接将分泌蛋白释放到培养基中，利于分离纯化， 优于大肠杆菌。 • 具有高效的分泌目的蛋白的能力，其分泌的真核来源 的重组蛋白多数情况下都具有天然构象和生物活性。 • 生长迅速，培养条件简单，遗传背景了解清晰，而且 有较好的工业生产基础。
B.subtilis表达系统有着较多的优点，相对于大肠杆菌 表达系统研究较少，存在问题也很多，仍需要进行大量的实 验对它的稳定性以及表达系统进行更好的了解 其优势将逐步显现，成为未来外源基因最具潜力的表达 载体。
参考文献： 《枯草芽孢杆菌表达系统的研究进展》 《枯草芽孢杆菌新型表达系统和遗传操作体系的建立和应用》 《枯草芽孢杆菌的研究与应用》
• 限制外源蛋白在枯草杆菌中高效表达的瓶颈。 • 质粒本身的不稳定性： 分离型不稳定：整个质粒丢失 结构型不稳定：质粒本身非常规重组 • 菌株特性引起的不稳定性 原噬菌体3区域中编码的基因使得重组质粒的转化 效率急剧下降，同时对外源基因有排斥性。 • 如何解决： 构建整合质粒，构建原噬菌体3区域的缺陷性菌株。
该表达系统存在的缺点：
• 分泌各种蛋白酶,会造成外源蛋白降解,有时甚至得 不到目标蛋白。
• 存在限制和修饰系统;质粒不稳定。 • 外源蛋白对细胞有毒时得不到有效的表达，有些 外源基因表达产物分泌到培养基中会影响细胞的 生长。 • 能自发形成感受态的菌株极少,感受态持续时间短 暂,分子克隆效率低
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
载体质粒的不稳定性