目的基因的获取

基因文库构建的一般步骤
1、染色体DNA片段 的制备
断点完全随机，片断长度合适 于载体连接。
2、载体与基因组DNA大 片段的连接
构建基因文库的载体选用 ①对载体的要求
载体能够容载的DNA片断大小直接影响 到构建完整的基因文库所需要的重组子 的数目。
①物理切割法：
超声波（300bp）或机械搅拌 （8kb）。
②酶切法：
内切酶Sau3A进行局部消化。 可得到 10- 30kb的随机片断。
②目前常用的载体
载体与基因组DNA大片段的连接方式
直接连接、人工接头或同聚物加尾。
①黏性末端直接连接
载体与外源DNA大片段的两个末端都有相同的黏 性末端。
②人工接头
人工合成的限制性内切酶黏性末端片断
③同聚物加尾
cDNA文库的构建
1、cDNA 以mRNA为模板逆转录出的DNA称cDNA。
2、cDNA library 利用某种生物的总mRNA合成cDNA，再将这些cDNA与载体 连接，转入细菌细胞中进行保存和扩增，称cDNA文库。 3、cDNA文库的特点 ①不含内含子序列 ②可以在细菌中直接表达 ③包含了所有的编码蛋白质的基因 ④比DNA文库小的多，容易构建
• 自动合成法
磷酸二酯法（磷酸三酯法）
①原理 （Ⅰ）保护dNTP的5’P或3’-OH 保证合成反应的定向进行 （Ⅱ）带保护的单核苷酸连接 带5’保护的单核苷酸与带3’保 护的另一个单核苷酸以磷酸二 酯键连接起来。 （Ⅲ）用酸或碱脱保护
三酯法原理与二酯法相似，只是参与 反应的单核苷酸都是在3’端磷酸和5’OH上都先连接了一个保护基团。
（ Ⅱ ）降解mRNA模板 用碱处理或用RNaseH降解mRNA-DNA杂交分子中的 mRNA.
( Ⅲ )cDNA第二链合成 剩下的cDNA单链的3’末端一般形成一个弯回来的双链 发卡结构（机理不明），可成为合成第二条cDNA链的引 物。用DNA聚合酶合成第二链DNA。
（ Ⅳ ）去掉发卡结构 用核酸酶S1可以切掉发卡结构（但这会导致cDNA中 有用的序列被切掉！）
②互补延伸连接法
• 预先设计的片断之间有局部互补区，可以相互作 为另一个片断延长的引物，用DNA聚合酶延伸成 完整的双链。
3、寡聚核苷酸化学合成的优点或应用
①直接合成基因
（Ⅰ） mRNA的含量很低，很难作cDNA （Ⅱ）有些基因比较短，化学合成费用较低
②合成引物（20mer左右） ③合成探针序列 ④定点突变合成 ⑤合成人工接头或衔接物
用以直观地检测目的基因。
↓
逆转录酶
mRNA
杂化双链
↓
ＤＮＡ聚合酶
cDNA
↓
PCR扩增
梯度PCR仪
实时荧光定量PCR仪
普通PCR仪
化学合成法
要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物 的氨基酸序列，一般用小分子基因的合成
1、目前常用的方法
• 磷酸二酯法
• 磷酸三酯法 • 亚磷酸三酯法
• 固定合成法
cDNA文库与基因组文库相比的缺点 ①受材料来源的影响
②遗传信息量有限
③构建cDNA文库中高丰度的（含量）mRNA含量比低丰度 的易得和分离，其实现在构建的cDNA基本上是高丰度的而 低丰度的很少
PCR扩增获得目的基因
如果知道目的基因的全序列或其两端 的序列，通过合成一对与引物互补的引物， 就可以十分有效的扩增出所需要的目的基 因。
含有各种酶切位点人工接头（Adaptor） 或衔接物（Linker）序列
• 模板 （template） ：SDS,蛋白酶K • Mg2+ （magnesium）：能与dNTP结合 作用？
PCR反应特点
特异性强
灵敏度高
简便、快速
对标本的纯度要求低
PCR的类型
1）不对称PCR 2)反向PCR 3）多重PCR 4）LP-PCR 利用同位素、荧光素等对ＰＣＲ引物进行标记, 5）ＲＴ－ＰＣＲ 6）荧光定量 PCR（real-time PCR)
PCR原理
• 1) 变性(Denature):目的双链DNA片 段在94℃下解链; • 2) 退火(Anneal):两种寡核苷酸引物 在适当温度(50℃左右)下与模板上 的目的序列通过氢键配对; • 3) 延伸(Extension): 70℃.DNA模板 —引物结合物在TaqDNA聚合酶的
作用下，以dNTP为反应原料，靶
序列为模板，按碱基配对与半保留 复制原理，合成一条新的与模板
DNA 链互补的半保留复制链重复
循环变性--退火--延伸三过程
PCR反应五要素
• 引物（primer）:长度 ，GC比例，结构 • 酶 （Taq DNA polymerase）：浓度
• dNTP （dATP,dGTP,dCTP,dTTP）：浓度
4、构建cDNA文库的一般步骤 ①总RNA(total RNA)提取 提取总RNA有商业的试剂盒（kit）。 ②mRNA的分离纯化 利用mRNA都含有一段 polyA尾巴，将mRNA从总RNA （rRNA、tRNA等）中分离纯化 mRNA只占总RNA的1％-2％
③cDNA的合成
（ Ⅰ ）cDNA第一链合成 你转录酶能以RNA为模板合成cDNA。 用Oligo dT（或随机引物）作引物，合成cDNA的第 一链。
（ Ⅴ ）cDNA与载体连接 在双链cDNA末端接上人工接头，即可与载体连接，转入受体 菌。 或借助末端转移酶给载体和双链cDNA的3’端分别加上几个C 或G，成为黏性末端。
优点（与基因组文库比较）： ①cDNA文库以mRNA为材料，特别适合用于某些RNA病毒。 ②cDNA基因文库筛选比较简单易行。 ③假阳性概率比较低 ④cDNA克隆可用于在细菌中能进行表达的基因克隆，直接应用 基因于工程操作 ⑤cDNA克隆还可以用于真核细胞mRNA的结构和功能研究
优点
绕过直接分离的难关。由于带有黏性末端， 产物可以直接与载体连接。
缺点
目的基因内部也可能有该酶的切点。目的基因 也被切成碎片。需要简单的筛选方法。
随机片断法
一、限制性内切酶局部消化法
控制内切酶的用量和消化时间， 使基因组中的酶切位点只有一部 分被随机切开。 选酶原则： ①内切酶识别位点的碱基数 （影响所切出的产物的长度和随机程 度） ②内切酶黏性末端 （能与常用克隆位点相连）
目的基因的获取
Hale Waihona Puke Baidu
什么是目的基因？
准备分离、改造、扩增或表达的基因
目的基因获取方法
• 化 学 合 成 法 • PCR 分 离 法 • 构 建 基 因 组 文 库 分 离 法 • 直 接 分 离 法
直接分离法
• 限制性核酸内切酶法 • 随机片断法 • 物理化学法
限制性核酸内切酶法
用限制性核酸内切酶把基因组DNA切成不同 大小的片断。五步。
从这只紫色海胆的8.14亿 个基因代码中，科研小组 确认了23300个,其中有 7077个基因在人类中也被 发现。 韦士尔说：“人类与海胆竟然以如此不同的结构在器官中 使用同样的蛋白。”
构建基因组文库分离法
• 概念： 基因文库（gene library） 将某种生物细胞的整个基因组DNA切割成 大小适合的片断，并将所有这些片断都与 适当的载体连接，引入相应的寄主细胞中 保存和扩增。 理论上讲，这些重组载体上带有了该生物 的全部基因，成为基因文库。
固相磷酸三酯合成过程
（固相磷酸三酯合成法）是目前通用的合成方法。
结果是权保护的DNA：5’DMT,3’固相支持物，核 苷酸之间对氯苯，最后脱保护。
2、化学合成DNA片断的组装
化学合成的DNA片断一 般在200bp以内。
①互补连接法 （Ⅰ）互补配对 预先设计合成的片断之 间都有互补区域，不同片 断之间的互补区域能形成 有断点的完整双链 （Ⅱ）5’端-磷酸化 用T4多核苷酸激酶使各 个片断的5’端带上磷酸 （合成的DNA单链的5’端 是-OH） （Ⅲ）连接酶连成完整双链
分子杂交法？
二、机械切割法
1、超声波 超声波强烈作用于DNA，可使 其断裂成约300bp的随机片断。
2、高速搅拌 1500r/min下搅拌30min，可产 生约8kb的随机片断。
物理化学法
• 基本原理：不同基因片段的碱基组成差异 较大，其物理性质，如浮力密度和解链温 度等也明显不同
海胆近70%的基因都能 与人类匹配