非洲猪瘟ELISA抗体检测报告 - 副本
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中国畜牧兽医文摘 2012年 28卷 第11期
基础科学
非 洲 猪 瘟 ELI SA抗 体 检 测 报 告
张 倩1 刘明团1 任玮杰2
（1. 山东省青岛畜牧兽医研究所，青岛 266000； 2. 中国动物卫生与流行病学中心，青岛 266032） [ 摘 要] 采用瑞典SVANOVA试剂盒对抽检的92份猪血请进行非洲猪瘟病毒抗体检测。结果表明，该样本血清全部为阴性。 [ 关键词] 非洲猪瘟 抗体 ELI SA
表1 主要试剂
表2 检测血清OD值统计表
A1、B1为阴性对照，C1 、D1为阳性对照，计算时取其平均值。A12 ～H12为野猪血清。
（下转第48页）
·49·
基础科学
中国畜牧兽医文摘 2012年 28卷 第11期
表4 不同年龄段卡拉库尔羊羊毛中铜、锌的平均含量
年龄
样本数（份） Cu（μg/ g） Zn（μg/ g）
状。另外，有些羊毛中混杂的皮屑较多，使羊毛粘连在一起，眼 观比较脏乱，上述症状与本次实验测定结果相结合充分说明该羊
群属于锌缺乏群体。
4 结论
经本次实验对阿拉尔市托喀依乡羊群中羊只的外观健康状况
观察，毛样的采集、眼观、显微观察，毛样中铜、锌含量的测定 可知阿拉尔地区卡拉库尔羊羊毛中铜、锌两种元素缺乏明显。为
瑞典 SVANOVA非洲 猪瘟 抗体 ELISA检 测试 剂盒 （见 表1 ）。 1. 3 血清采集
来自辽宁绥靖，内蒙古赤峰，大连东港 共计92份抽检血清， 其中有8份为野猪血清。
1. 4 实验方法 ①使用前将试剂盒恢复常温。②用配好的洗液先冲洗要用的
板 条 3次 。③ 将 阴阳 性对 照 和样 品 都做 10 0倍 稀释 。 ④每 板 选阴 阳 性 对照 各两孔 ，其 余为 加样孔 ，每 孔加 100μl ，混 匀，置 37℃ 温箱 孵育1 h。⑤甩去孔内液体，用洗板机清洗4次。⑥每孔加100μl酶 标记物，置37℃温箱孵育1 h。⑦重复步骤④。⑧加100μl底物， 室温（18～25℃）下避光反应10 min。⑨每孔加50μl终止液，加 入顺序同上，用酶标仪450 nm读数。
Байду номын сангаас
（上接第49页）
3 讨论
目前，我国针对非洲猪瘟病毒已建立了荧光定量PCR方法， 该方法用于检测抗原灵敏度高，特异性强，但实验条件要求高。 用血清学方法检测抗体有利于大规模的普查和快速诊断且实验条 件要求低。本试剂盒的原理为间接ELISA，若检测的血清中含有 抗体就会生成抗原- 抗体- 酶标二抗复合物，加入底物后反应成深 色。该试剂盒要求将样品做100倍稀释后再检测，可见此试剂盒灵
2岁以内
14
5. 017
73. 247
2～4岁
18
4. 904
66. 878
4岁以上
18
4. 913
60. 942
由表 4可 知 ，2 岁以 内 的 卡拉 库 尔羊 群 体毛 中 铜、 锌 元素 含 量 最高 ；2～ 4岁 羊群 体铜 、锌 含量 次之 ；4 岁以 上羊 群体 毛中 铜锌 含 量介于上述2群体之间。笔者认为可能是由于当地饲草中铜含量较 低，在这种异常的情况下，各年龄段的羊处于缺铜状态，导致卡 拉库尔羊机体铜元素含量都限定在接近饲草中铜元素含量的水平 上。
非洲猪瘟（ASF）是一种由非洲猪瘟病毒（ASFV）引起的猪 的发热性、接触性传染病，其特征是高热、皮肤充血及淋巴结和 内脏 器官 严重 充 血。 急性 型死 亡 率可 达10 0%。 我国 己将 此 病列 为 一类动物疾病，世界动物卫生组织（OIE ）将其列为须通报的动 物疫病，该病受到世界各国高度重视，并作为动物外来疫病进行 研究。
脱落并再生不良或不再生，即脱毛症。一般植物有富集锌的能
力，所以就算在缺锌地区不算严重的情况下，动物一般也不会发 生缺锌。另外，经查阅一些相关资料，发现以前在托喀依乡采样
并测得的卡羊毛中锌含量是在正常范围之间。但据本次实验结果 显示，本次实验羊群属于锌缺乏群体。但在取样的羊群中本人也
见到有个别羊表现局部脱毛，脱毛处皮肤嫩红，类似角化不全症
敏度非常高，操作时应严格按照试剂盒要求，特别是加入酶标二 抗后冲洗的过程，若洗不干净容易产生假阳性，本实验采用洗板 机清洗，相对人工清洗效果要好一些。另外本试剂盒配有一块确 认板，该板是针对筛选版筛选出的阳性样品进行复检，若复检结 果 为 阳性 那 就可 以 确定 有 抗体 存在 。 本实 验 检测 的 92 份血 清 筛选 板检测的结果均为阴性，所以没再用确认板复检。
2 结果
2. 1 被检样品的OD值 对实验采集样品检测的OD值详见表2。
2. 2 结果判定 计算公式为PP= （OD neg or OD sample）/（OD pos）×100
本 实 验结 果 成 立的 前 提 是阳 性 对 照OD4 50 nm ≥0 .5 ，同 时 阴 性对 照 PP ≤10 数据才有效，判定标准为PP≤10 阴性 PP在11～19 可 疑，PP≥20 阳性。因为，阴性对照和样品计算均和阳性对照OD 值有关，所以本实验还要求2个阳性对照的OD值与平均值相差在 25%以内才算有效。另外，我们可以将公式简化，得出O D neg ≤0.1OD pos，这样更利于直接做出判断。经计算发现阴阳性对照 OD值符 合实 验要 求， 样品 OD值均 ≤0 .1ODpos， 结果 为阴 性。
·48·
畜牧兽医.2012，25（1）：65- 67. [4] 周学辉， 苗小林，张继华. 青海湖滨草甸草 场土- 草- 畜生态系统
中铜的季节性变化研究[J].中国草地学报.2009，（2）：108- 110. [5] 李树伟，尹阔，谢安，等.新疆4个绵羊品种羊毛微量元素 含量测
定[J].西北农业学报.2008，17（4）：1- 4. [6 ] 陶大勇 ，蒋涛，陈荣 .塔里木河上 、中游卡拉库 尔羊放牧系统 中
3 讨论
本实验采样的地方为土壤中铜、锌元素都严重缺乏的地区， 植物中铜严重缺乏，但锌一般不缺乏[6]。与正常含量范围相比， 本实验所采集的卡拉库尔羊毛样中Cu、Zn含量与正常范围值相差 极显 著 （P<0.0 1） ，都 表 现为 明 显缺 乏 。动 物体 内 Cu、 Zn两 种元 素含量易受日粮中微量元素含量的影响。因此，缺铜原因可能是 当地农作物比较单一，一般只有棉花与水稻，土壤盐渍化，土壤 与植被的含铜量都很低。据农一师农科所有关资料显示，阿克苏 地区0- 20cm土层水溶性铜含量平均为11.83 mg/kg，芦苇为3.20 mg/kg，胡杨 叶为3. 10 mg/kg，棉花 叶为9. 00 mg/kg [9]。 平常羊 群又很少有针对性的补饲，便导致了羊群普遍性的缺铜。在毛纤 维角蛋白合成过程中，铜酶也决定了双硫键的形成与角蛋白的结 构。羊毛缺Cu使纤维含硫量下降，角蛋白角化延迟或角化不良， 角蛋白形成异常，导致了毛纤维发育发生各种畸形，纤维中皮质 发育不好，鳞片层与毛尖容易遭受机械性破损。造成弯曲频率降 低，纤维强度降低，产量降低[7]。据已有的研究，酪氨酸酶是酪
4胎以上
11
4. 400
61. 068
表5实验数据显示：毛中铜、锌含量在2～4胎羊毛中最高。可 能是 初胎 导致 铜、 锌需 求被 胎儿 剥夺 ；2 胎后 羊群 适应 外界 环境 造 成羊毛中铜、锌含量逐渐升高；4胎后因母羊已到高龄（本次实验 中母 羊 样 本占 93 %） ， 因采 食 量和 吸 收 利用 功 能降 低 导 致铜 、 锌 两元素在体内含量显著下降导致机体内铜锌含量明显降低。
氨酸转化为黑色素的关键酶与限速酶，且酪氨酸酶是一种含铜 的酶[8]，所以，铜含量的多少，会直接影响毛纤维色素颗粒的颜 色，数量及其在皮质层细胞内的分布情况。
经过高倍显微镜观 察，发现在卡拉库尔羊其他条件（如毛
色、年龄、性别、胎次）接近的情况下，毛中铜元素含量缺乏 者，毛中皮质层颜色较含铜较高或正常者要浅淡，浅淡程度与缺
提高卡拉库尔羊的健康状况、繁殖率及毛皮的经济价值，应在饲 料中补饲适量的铜、锌添加剂，为该地区养羊业的健康发展奠定
基础。 参考文献 [1] 李莲瑞，陈根元，王晓 斌，等. 新疆卡拉库尔羊的研究现状及 前
景[J].中国草食动物.2008，28（2）：63- 64. [2] 李志农.卡拉库尔羊[M].第一版.北京：农业出版社.1984. [3] 李继兴，陶大 勇.卡拉库尔羊妊娠母 羊微量元素的测定 [J].黑龙 江
铜程度成正比。并在缺铜较严重的样品中，发现有鳞片层破损的 毛样，镜检观察有碎玻光现象，有的毛纤维粗细不匀，偶有异常
的突然弯曲。
动 物 毛 中 的 Zn 可 以反 映 日 粮 中 Zn 的 变 化 。 Zn是 很 多 酶 的 复 合体和催化剂，它通过参与机体内DNA和RNA聚合酶的合成来直
接影响核酸和蛋白质的合成E 133。Zn严重缺乏的绵羊，表现为羊 毛生长受阻，纤维弯曲减少，强度降低，表皮有大量鳞片皮屑，
随着年龄的增长，羊毛中铜锌的含量是逐渐减少的，在毛色 变化的过程中，铜锌的含量也随之变化，可见，两者之间存在着 一定的正相关的关系。
表5 不同胎次卡拉库尔羊羊毛中铜、锌的平均含量
胎次
样本数（份） Cu（μg/ g） Zn（μg/ g）
2胎以下
12
2～4胎
16
5. 102 5. 162
66. 621 72. 234
铜、锌的测定[J].畜牧与兽医.2006，38（8）：63- 64. [7 ] 袁之兆 ，郑绍仪，严 峻.铜对卡拉 库尔羊被毛组 织及理化特性 的
影响[J].新疆农业科学.1982，（5）：39- 41. [8] 陈清西，宋康 康.酪氨酸酶的研究进 展[J].厦门大学学报（自然 科
学版）.2006，45（5）：731～736.
目前，我国正在积极开展非洲猪瘟的相关研究，不仅要重视 在引进国外商品猪以及猪肉制品时做好检验检疫工作，还要定期 对国内的家猪、野猪进行检测，确保国内无带毒猪存活。由于非 洲猪瘟目前在我国尚未报道，所以我们可以通过检测抗体的方法 来进行监测。
1 材料与方法 1. 1 仪器与设备
TE CA N酶标 仪，T E CAN 洗板机， The rmo- Sha ker 温箱 ， Eppendorf移液器 1. 2 试剂
基础科学
非 洲 猪 瘟 ELI SA抗 体 检 测 报 告
张 倩1 刘明团1 任玮杰2
（1. 山东省青岛畜牧兽医研究所，青岛 266000； 2. 中国动物卫生与流行病学中心，青岛 266032） [ 摘 要] 采用瑞典SVANOVA试剂盒对抽检的92份猪血请进行非洲猪瘟病毒抗体检测。结果表明，该样本血清全部为阴性。 [ 关键词] 非洲猪瘟 抗体 ELI SA
表1 主要试剂
表2 检测血清OD值统计表
A1、B1为阴性对照，C1 、D1为阳性对照，计算时取其平均值。A12 ～H12为野猪血清。
（下转第48页）
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基础科学
中国畜牧兽医文摘 2012年 28卷 第11期
表4 不同年龄段卡拉库尔羊羊毛中铜、锌的平均含量
年龄
样本数（份） Cu（μg/ g） Zn（μg/ g）
状。另外，有些羊毛中混杂的皮屑较多，使羊毛粘连在一起，眼 观比较脏乱，上述症状与本次实验测定结果相结合充分说明该羊
群属于锌缺乏群体。
4 结论
经本次实验对阿拉尔市托喀依乡羊群中羊只的外观健康状况
观察，毛样的采集、眼观、显微观察，毛样中铜、锌含量的测定 可知阿拉尔地区卡拉库尔羊羊毛中铜、锌两种元素缺乏明显。为
瑞典 SVANOVA非洲 猪瘟 抗体 ELISA检 测试 剂盒 （见 表1 ）。 1. 3 血清采集
来自辽宁绥靖，内蒙古赤峰，大连东港 共计92份抽检血清， 其中有8份为野猪血清。
1. 4 实验方法 ①使用前将试剂盒恢复常温。②用配好的洗液先冲洗要用的
板 条 3次 。③ 将 阴阳 性对 照 和样 品 都做 10 0倍 稀释 。 ④每 板 选阴 阳 性 对照 各两孔 ，其 余为 加样孔 ，每 孔加 100μl ，混 匀，置 37℃ 温箱 孵育1 h。⑤甩去孔内液体，用洗板机清洗4次。⑥每孔加100μl酶 标记物，置37℃温箱孵育1 h。⑦重复步骤④。⑧加100μl底物， 室温（18～25℃）下避光反应10 min。⑨每孔加50μl终止液，加 入顺序同上，用酶标仪450 nm读数。
Байду номын сангаас
（上接第49页）
3 讨论
目前，我国针对非洲猪瘟病毒已建立了荧光定量PCR方法， 该方法用于检测抗原灵敏度高，特异性强，但实验条件要求高。 用血清学方法检测抗体有利于大规模的普查和快速诊断且实验条 件要求低。本试剂盒的原理为间接ELISA，若检测的血清中含有 抗体就会生成抗原- 抗体- 酶标二抗复合物，加入底物后反应成深 色。该试剂盒要求将样品做100倍稀释后再检测，可见此试剂盒灵
2岁以内
14
5. 017
73. 247
2～4岁
18
4. 904
66. 878
4岁以上
18
4. 913
60. 942
由表 4可 知 ，2 岁以 内 的 卡拉 库 尔羊 群 体毛 中 铜、 锌 元素 含 量 最高 ；2～ 4岁 羊群 体铜 、锌 含量 次之 ；4 岁以 上羊 群体 毛中 铜锌 含 量介于上述2群体之间。笔者认为可能是由于当地饲草中铜含量较 低，在这种异常的情况下，各年龄段的羊处于缺铜状态，导致卡 拉库尔羊机体铜元素含量都限定在接近饲草中铜元素含量的水平 上。
非洲猪瘟（ASF）是一种由非洲猪瘟病毒（ASFV）引起的猪 的发热性、接触性传染病，其特征是高热、皮肤充血及淋巴结和 内脏 器官 严重 充 血。 急性 型死 亡 率可 达10 0%。 我国 己将 此 病列 为 一类动物疾病，世界动物卫生组织（OIE ）将其列为须通报的动 物疫病，该病受到世界各国高度重视，并作为动物外来疫病进行 研究。
脱落并再生不良或不再生，即脱毛症。一般植物有富集锌的能
力，所以就算在缺锌地区不算严重的情况下，动物一般也不会发 生缺锌。另外，经查阅一些相关资料，发现以前在托喀依乡采样
并测得的卡羊毛中锌含量是在正常范围之间。但据本次实验结果 显示，本次实验羊群属于锌缺乏群体。但在取样的羊群中本人也
见到有个别羊表现局部脱毛，脱毛处皮肤嫩红，类似角化不全症
敏度非常高，操作时应严格按照试剂盒要求，特别是加入酶标二 抗后冲洗的过程，若洗不干净容易产生假阳性，本实验采用洗板 机清洗，相对人工清洗效果要好一些。另外本试剂盒配有一块确 认板，该板是针对筛选版筛选出的阳性样品进行复检，若复检结 果 为 阳性 那 就可 以 确定 有 抗体 存在 。 本实 验 检测 的 92 份血 清 筛选 板检测的结果均为阴性，所以没再用确认板复检。
2 结果
2. 1 被检样品的OD值 对实验采集样品检测的OD值详见表2。
2. 2 结果判定 计算公式为PP= （OD neg or OD sample）/（OD pos）×100
本 实 验结 果 成 立的 前 提 是阳 性 对 照OD4 50 nm ≥0 .5 ，同 时 阴 性对 照 PP ≤10 数据才有效，判定标准为PP≤10 阴性 PP在11～19 可 疑，PP≥20 阳性。因为，阴性对照和样品计算均和阳性对照OD 值有关，所以本实验还要求2个阳性对照的OD值与平均值相差在 25%以内才算有效。另外，我们可以将公式简化，得出O D neg ≤0.1OD pos，这样更利于直接做出判断。经计算发现阴阳性对照 OD值符 合实 验要 求， 样品 OD值均 ≤0 .1ODpos， 结果 为阴 性。
·48·
畜牧兽医.2012，25（1）：65- 67. [4] 周学辉， 苗小林，张继华. 青海湖滨草甸草 场土- 草- 畜生态系统
中铜的季节性变化研究[J].中国草地学报.2009，（2）：108- 110. [5] 李树伟，尹阔，谢安，等.新疆4个绵羊品种羊毛微量元素 含量测
定[J].西北农业学报.2008，17（4）：1- 4. [6 ] 陶大勇 ，蒋涛，陈荣 .塔里木河上 、中游卡拉库 尔羊放牧系统 中
3 讨论
本实验采样的地方为土壤中铜、锌元素都严重缺乏的地区， 植物中铜严重缺乏，但锌一般不缺乏[6]。与正常含量范围相比， 本实验所采集的卡拉库尔羊毛样中Cu、Zn含量与正常范围值相差 极显 著 （P<0.0 1） ，都 表 现为 明 显缺 乏 。动 物体 内 Cu、 Zn两 种元 素含量易受日粮中微量元素含量的影响。因此，缺铜原因可能是 当地农作物比较单一，一般只有棉花与水稻，土壤盐渍化，土壤 与植被的含铜量都很低。据农一师农科所有关资料显示，阿克苏 地区0- 20cm土层水溶性铜含量平均为11.83 mg/kg，芦苇为3.20 mg/kg，胡杨 叶为3. 10 mg/kg，棉花 叶为9. 00 mg/kg [9]。 平常羊 群又很少有针对性的补饲，便导致了羊群普遍性的缺铜。在毛纤 维角蛋白合成过程中，铜酶也决定了双硫键的形成与角蛋白的结 构。羊毛缺Cu使纤维含硫量下降，角蛋白角化延迟或角化不良， 角蛋白形成异常，导致了毛纤维发育发生各种畸形，纤维中皮质 发育不好，鳞片层与毛尖容易遭受机械性破损。造成弯曲频率降 低，纤维强度降低，产量降低[7]。据已有的研究，酪氨酸酶是酪
4胎以上
11
4. 400
61. 068
表5实验数据显示：毛中铜、锌含量在2～4胎羊毛中最高。可 能是 初胎 导致 铜、 锌需 求被 胎儿 剥夺 ；2 胎后 羊群 适应 外界 环境 造 成羊毛中铜、锌含量逐渐升高；4胎后因母羊已到高龄（本次实验 中母 羊 样 本占 93 %） ， 因采 食 量和 吸 收 利用 功 能降 低 导 致铜 、 锌 两元素在体内含量显著下降导致机体内铜锌含量明显降低。
氨酸转化为黑色素的关键酶与限速酶，且酪氨酸酶是一种含铜 的酶[8]，所以，铜含量的多少，会直接影响毛纤维色素颗粒的颜 色，数量及其在皮质层细胞内的分布情况。
经过高倍显微镜观 察，发现在卡拉库尔羊其他条件（如毛
色、年龄、性别、胎次）接近的情况下，毛中铜元素含量缺乏 者，毛中皮质层颜色较含铜较高或正常者要浅淡，浅淡程度与缺
提高卡拉库尔羊的健康状况、繁殖率及毛皮的经济价值，应在饲 料中补饲适量的铜、锌添加剂，为该地区养羊业的健康发展奠定
基础。 参考文献 [1] 李莲瑞，陈根元，王晓 斌，等. 新疆卡拉库尔羊的研究现状及 前
景[J].中国草食动物.2008，28（2）：63- 64. [2] 李志农.卡拉库尔羊[M].第一版.北京：农业出版社.1984. [3] 李继兴，陶大 勇.卡拉库尔羊妊娠母 羊微量元素的测定 [J].黑龙 江
铜程度成正比。并在缺铜较严重的样品中，发现有鳞片层破损的 毛样，镜检观察有碎玻光现象，有的毛纤维粗细不匀，偶有异常
的突然弯曲。
动 物 毛 中 的 Zn 可 以反 映 日 粮 中 Zn 的 变 化 。 Zn是 很 多 酶 的 复 合体和催化剂，它通过参与机体内DNA和RNA聚合酶的合成来直
接影响核酸和蛋白质的合成E 133。Zn严重缺乏的绵羊，表现为羊 毛生长受阻，纤维弯曲减少，强度降低，表皮有大量鳞片皮屑，
随着年龄的增长，羊毛中铜锌的含量是逐渐减少的，在毛色 变化的过程中，铜锌的含量也随之变化，可见，两者之间存在着 一定的正相关的关系。
表5 不同胎次卡拉库尔羊羊毛中铜、锌的平均含量
胎次
样本数（份） Cu（μg/ g） Zn（μg/ g）
2胎以下
12
2～4胎
16
5. 102 5. 162
66. 621 72. 234
铜、锌的测定[J].畜牧与兽医.2006，38（8）：63- 64. [7 ] 袁之兆 ，郑绍仪，严 峻.铜对卡拉 库尔羊被毛组 织及理化特性 的
影响[J].新疆农业科学.1982，（5）：39- 41. [8] 陈清西，宋康 康.酪氨酸酶的研究进 展[J].厦门大学学报（自然 科
学版）.2006，45（5）：731～736.
目前，我国正在积极开展非洲猪瘟的相关研究，不仅要重视 在引进国外商品猪以及猪肉制品时做好检验检疫工作，还要定期 对国内的家猪、野猪进行检测，确保国内无带毒猪存活。由于非 洲猪瘟目前在我国尚未报道，所以我们可以通过检测抗体的方法 来进行监测。
1 材料与方法 1. 1 仪器与设备
TE CA N酶标 仪，T E CAN 洗板机， The rmo- Sha ker 温箱 ， Eppendorf移液器 1. 2 试剂