2016.1.12基因功能的常用研究方法
基因功能的研究方法课件ppt
一、计算机预测基因功能
➢ 计算机预测基因功能的依据仍然是同 源性比较。同源基因都有1个共同的祖 先基因，他们之间有许多相似的顺序 。同源基因可以分为2类：
➢ 种间同源基因或直系基因(orthologous gene) 这是指 不同物种之间的同源基因，它们来自物种分隔之
前的同一祖先。 ➢ 种内同源基因或平行基因(paralogous gene) 同一种
关键问题。 至于高等生物，因其某些表型具有难以捉摸的综合性，区分其准确的功能更加棘手。
2 ticRNA transcription inhibitory complementary RNA Ⅲ类：这类反义RNA可直接抑制靶mRNA的转录。
✓ 目前已有多种筛选方法，其中1988年犹它大 已经完成基因组测序的多细胞生物基因注解时遇到的最大困难是，如何鉴别外显子以及可变剪切的类型。
② 改造动物基因型，鉴定新基因和/或
其新功能，研究发育生物学
➢ 深入研究基因敲除小鼠在胚胎发育及生命
各期的表现，可以得到详细的有关该基因 在生长发育中的作用，为研究基因的功能 和生物效应提供模式。
➢ 例如，目前人类基因组研究多由新基因序
列的筛选检测入手，进而用基因敲除法在 小鼠上观察该基因缺失引起的表型变化。 目前已报道了多种学习、记忆以及LTP、 LTD 有缺陷的基因敲除动物，发现多种基 因在学习、记忆的形成过程中必不可少。
反义RNA(anti sense RNA)是指mRNA互补的RNA分子。 这已在不少实验中得到证实。
高等真核细胞内外源DNA与靶细上。
2 基因敲除的技术路线如下：
自然发生同源重组的机率非常低，约为百万 对于能够引发疾病反应的蛋白互作可以采取药物干扰的方法，阻止它们的相互作用以达到治疗疾病的目的。
生命科学中的基因功能研究
生命科学中的基因功能研究基因功能研究是生命科学中的一个重要领域，旨在了解和解析基因的功能和作用机制。
通过对基因功能的探索，可以更深入地了解细胞内的生物学过程，以及基因与疾病之间的关联，为生物学和医学的发展提供理论和实践基础。
基因是生物体内传递遗传信息的基本单位，是决定个体性状的重要因素。
通过研究基因功能，可以揭示基因在个体发育、生长、代谢以及对环境变化的适应等方面的作用机制。
基因功能的研究方法主要包括遗传学方法、分子生物学方法、生物化学方法和细胞生物学方法等。
遗传学方法是探索基因功能的重要手段之一、遗传学研究中，通过比较野生型与突变型生物体的差异，可以进一步了解基因在个体发育和其他生物学过程中的功能。
例如，透过分析两个种群的遗传相关性，可以发现相关的突变基因，并进一步研究这些基因的功能。
分子生物学方法是研究基因功能的常用手段之一、分子生物学方法可以研究基因在细胞内的表达调控、蛋白质合成过程以及基因在细胞内的相互作用等。
通过克隆和表达基因，可以进一步验证和研究基因的功能。
例如，通过基因敲除技术，可以研究基因在细胞发育和生物学过程中的功能。
生物化学方法也是研究基因功能的重要手段之一、生物化学方法主要通过分析和研究基因编码的蛋白质及其功能，来了解基因在细胞内的作用机制。
例如，通过研究酶的功能和调控机制，可以揭示基因在代谢过程中的作用机制。
细胞生物学方法是研究基因功能的重要手段之一、细胞生物学方法主要通过观察和研究基因在细胞内的表达和调控，来了解基因的功能和作用机制。
例如，通过显微镜观察基因在细胞内的定位和相互作用，可以揭示基因在细胞发育和生物学过程中的作用机制。
基因功能研究的重要意义在于解析基因与生物学过程和疾病之间的关联。
基因在细胞生物学过程中的功能异常可能导致疾病的发生和发展。
通过研究基因功能的异常和调控机制，可以发现和诊断遗传疾病，并为疾病防治提供新思路和新方法。
此外，基因功能研究还可以为开发新药物和治疗方法提供理论和实践基础，对药物研发和治疗效果进行评估和改进。
基因功能的研究方法讲解共90页
40、人类法律，事物有规律，这是不 容忽视 的。— —爱献 生
46、我们若已接受最坏的，就再没有什么损失。——卡耐基 47、书到用时方恨少、事非经过不知难。——陆游 48、书籍把我们引首，不会作诗也会吟。——孙洙 50、谁和我一样用功，谁就会和我一样成功。——莫扎特
基因功能的研究方法讲解
36、如果我们国家的法律中只有某种 神灵， 而不是 殚精竭 虑将神 灵揉进 宪法， 总体上 来说， 法律就 会更好 。—— 马克·吐 温 37、纲纪废弃之日，便是暴政兴起之 时。— —威·皮 物特
38、若是没有公众舆论的支持，法律 是丝毫 没有力 量的。 ——菲 力普斯 39、一个判例造出另一个判例，它们 迅速累 聚，进 而变成 法律。 ——朱 尼厄斯
基因功能鉴定方法
基因功能鉴定方法基因功能鉴定是生物学研究中的重要工具。
通过对基因进行功能鉴定，我们可以了解其编码蛋白质的生物学作用，探索其与疾病发生发展的关系，以及发现治疗疾病的新靶点等。
在本文中，我们将概括介绍几种常用的基因功能鉴定方法。
1. 敲除基因敲除基因是指通过基因编辑技术将目标基因从细胞或生物中彻底剔除。
目前常用的敲除方法是CRISPR/Cas9技术。
这种方法通过将一条RNA单链接在Cas9蛋白上，使它能够精准地结合到目标基因序列上，再利用Cas9酶活性的内切酶活性切割目标基因。
通过敲除基因，我们可以了解这个基因对于生物体的重要性，以及对生物学过程的影响。
在研究基因与疾病相关性方面，敲除基因可以帮助我们确定疾病相关基因，发现新型治疗的潜在靶点，还可以使细胞模型和动物模型显示疾病和疾病相关基因的发展过程。
2. 过表达基因过表达基因是指通过载体或转录本增强自然表达的基因依靠人为的方法将该基因的表达量提高。
目前，利用质粒或病毒载体来过表达基因是最常用的方法之一。
过表达基因需要具备特定的表达载体，质粒或病毒载体通常包含了基因序列和控制基因表达的转录因子等等。
使用过表达基因可以帮助我们理解这个基因的作用，以及过量表达后对生物结构和功能的影响。
3. RNAiRNA干扰（RNAi）是一种利用短小的RNA片段切断或降低目标RNA复制的方法。
RNAi技术可以将特异性siRNA 瘤切寡核苷酸至特定mRNA的靶标上并引发靶标的降解，以达到有效抑制基因表达的效果。
RNAi技术比敲除和过表达技术更快速，更普及。
RNAi 技术广泛应用于疾病研究，可以为基因治疗提供依据。
4. 蛋白质催化反应通过制备相应的结构变化、催化活性的突变蛋白，可以表征基因改变对与酶的活性和反应性质的调节关系。
基于此原理，进行蛋白质酶催化验证往往会让我们了解想要研究的那个基因的具体功能。
此方法虽然技术成本高，分析过程也比较复杂且麻烦，但针对和酶活性相关的蛋白质功能的研究非常有效。
[医学]C12 基因功能分析的基本策略
![[医学]C12 基因功能分析的基本策略](https://img.taocdn.com/s3/m/020b6c27a21614791711286f.png)
MicroRNA(miRNA) 是近几年在真核生物 中发现的一类具有调控功能的非编 码 RNA，它们主要参与基因转录后水平 的调控。miRNA 的调控功能是十分重要 的，近来发现它们在果蝇的细胞增殖、 死亡及脂肪代谢，线虫极性的形成，哺 乳动物的造血干细胞的分化等过程中起 了重要的调控作用。在植物中， miRNA 还参与了叶子与花的发育过程。
动物(尤其是人) miRNA 的生物合成过程
miRNA 基因的初级转录产物 (pri-miRNA) 在 细胞核中被RNase Ⅲ Drosha 切割成为前 体 miRNA (pre-miRNA)。 胞质中 pre-miRNA 在 Dicer 酶的作用下，被 切割成双链的 miRNA：miRNA* 配对分子， 成熟的 miRNA 分子被解链，单链的miRNA进入 一个核糖蛋白复合体 miRNP (也叫 RISC(RNAinduced silencing complex) ) miRNA 通过与靶基因的3' UTR 区互补配对， 指导 miRNP 复合体对靶基因 mRNA 进行切割或 者翻译抑制
（核酸内切酶和解旋酶） （小干涉性RNA）
（RNA诱导 的沉默复合物）
RNA干扰技术 (1998) Nature 391, 806– 811
利用RNAi技术研究特定基因功能的程序
• 确定目标RNA并选择被干涉靶点 避开蛋白质结合部位 选择目标RNA的AUG下游50～100bp区域 的AA(N19)TT或AA(N21)序列，GC比在50 ％左右，长度在21-23nt，不超过30nt，与 其他RNA序列没有同源性
某种疾病的发生 • 发现基因的新功能或未知基因的功能 • 发现新基因 • 用于只在胚胎期才表达的基因结构和功能的研究 • 建立外源基因表达、调控的动物模型 • 生产人体或动物进行器官或组织移植时所需的器
第九章基因功能研究常用方法
载体
目的基因（外源基因）
质粒 噬菌体 病毒 基因组DNA
限制酶消化
开环载体DNA
cDNA 人工合成 PCR产物
目的基因
连接酶
重组体
转化 体外包装，转染
带重组体的宿主
筛选
表型筛选
酶切电泳鉴定
菌落原位杂交
目录
第二节 转基因技术与核转移技术
一、转基因技术
转基因技术 采用基因转移技术使目的基因整合入受精 卵细胞或胚胎干细胞，然后将细胞导入动 物子宫，使之发育成个体。
获取同一拷贝的过程称为克隆化()，即无性 繁殖。
技术水平：分子克隆 即 克隆 细胞克隆 个体克隆（动物或植物）
克隆
应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传 物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然 的或人工的）与载体接合成一具有自我复制能力 的分子——复制子，继而通过转化或转染宿主细 胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行 扩增提取获得大量同一分子。 也称基因克隆或重 组。
转基因——被导入的目的基因 转基因动物( ) ——目的基因的受体动物
转基因生物是指用实验方法导入的外源基因
在染色体基因组内稳定整和并能遗传给后代的一 类动物。自从1982年等首次将大鼠生长激素基因 导人小鼠受精卵雄性原核中，获得了个体比对照 组大一倍的转基因“超级小鼠”以来，这项高新技 术受到各国重视，发展迅速，取得不少突破，全 世界已申请的工程动物专利达到80多项。
重组技术中常用的工具酶
பைடு நூலகம்
（三）目的基因
目的基因 ① 分离获得某一感兴趣的基因或 ② 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）
• • 基因组
（四）基因载体
定义 为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达 有意义的蛋白质所采用的一些分子。
基因功能研究常用方法
第一节 DNA克隆技术
（一） DNA克隆
克隆(clone) 来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。 获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)， 即无性繁殖。
二、核转移技术
核转移技术
即动物整体克隆技术，将动物体细胞核全部 导入另一个体的去胞核的受精卵内，使之 发育成个体，即克隆(clone)。 这样的个体所携带的性状仅来自一个父亲或 母亲个体,为无性繁殖. 1996年,克隆羊”多莉”的产生成为当年分子 生物学发展最重要的事件
克隆羊“多利”
第三节、基因剔除技术
RNA干涉(RNAi)
• RNA干涉技术是利用体外合成的短双链 RNA(21-23nt) 抑制细胞内特定基因表达的 技术,是转录后基因失活的一种研究基因功 能的有力工具 • 机制:
RNAi技术
Dicer
RNAi技术
siRNA
5’
3’
3’
5’
Initiation Step
ATP ADP + ppi
囊性纤维变性是一种遗传 病，患者体内会产生粘稠的 粘液，阻塞肺部、胰腺和消 化器官的内部通道，大约有 一半的患者活不过31岁。英 国PPT公司培育了植入人体 基因的克隆羊，羊奶中含有 能够治疗囊性纤维变性的人 体蛋白。 维尔莫特所在的研究所曾 向德国一家药厂出售一头这 样的转基因羊，获得50万英 镑。
其他
酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome, YAC) 细菌人工染色体 (bacterial artificial chromosome, BAC) 动物病毒DNA改造的载体 （如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）
分子生物学-基因功能研究方法
质谱技术的基本原理是样品分子离子化后，根据 不同离子间质荷比(m/z)的差异来分析蛋白质和多肽
的分子量和对蛋白质进行鉴定，磷酸化蛋白质分析、 糖基化蛋白质分析等, 也能检测核酸的SNP。
MALDI-TOF 和 ESI-MS
MALDI基质辅助激光解吸离子化是将样品均匀包埋在固体基 质中，基质吸收激光提供的能量而蒸发，携带部分样品分子 进入气相，并将一部分能量传递给样品分子使其离子化，这
快速、大信息量的检测。
主要特点
高通量、微型化和自动化。芯片上集成 的成千上万的密集排列的分子微阵列， 能够在短时间内分析大量的生物分子， 使人们快速准确地获取样品中的生物信 息，效率是传统检测手段的成百上千倍。 但目前的成本较高，重复性较差。
生物芯片分类 (1) ---用途
1 . 样品制备芯片 2. 生化反应芯片（如PCR芯片）
Protein-protein 相互作用的检测
免疫共沉淀技术 (CoIP)
蛋白-蛋白相互作用 常验证酵母双杂交的结果
Protein检测
蛋白质磷酸化分析
蛋白磷酸化是一种重要的细胞信号调控方 式
一般在丝氨酸, 苏氨酸和酪氨酸上磷酸化. 蛋白激酶---磷酸化;
蛋白质磷酸酯酶----去磷酸化. 一般通过双向电泳和质谱分析. 也可通过磷酸化抗体Western blot检测
分子生物学-基因功能研究方 法
分子生物学技术体系
一. 基本技术 二. 基因(狭义)及产物 分子检测技术 三. 基因(狭义)及产物 获取技术 四. 基因 () 功能研究技术
一. 基本技术
1. 琼脂糖凝胶电泳 2. SDS-PAGE 电泳 3. PCR技术 4. 细菌转化
1.琼脂糖凝胶电泳
基因功能研究方法
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酵母双杂交系统
酵母双杂交系统是一种基于转录重建而建立的研究生物大分子相 互作用的简便而有效的研究方法。
双杂交技术的基础是在一些转录因子中发现的DNA结合结构与和 转录激活结构域，一个转录激活结构域联合一个DNA结合结构域有可 能在TATA框位置启动RNA聚合酶Ⅱ复合体的装配，引发转录过程。
优点： 可使导入基因的水平与内源基因相当,并且具有类似 于天然的剪接机理,适用于复杂的基因功能分析。
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YAC要具备的主要功能成份
1）着丝粒：mitosis姊妹染色单体和减I同源染色体分离之必需。 2）端粒：保护染色体末端免受核酸酶的侵袭。 3）自主复制序列（ARS）元件：是染色体自主复制的复制起点。 构建YAC需要4个短序列：2个端粒，着丝粒，ARS元件
主要方法有物理的、化学的和生物的方法。
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2.1 物理方法 1>. DNA直接注射法: 是目的基因导入的最简单方法, 但
注入量有限, 能够接触到的细胞有限,故获得的细胞转 化率很低, 多通过肿瘤局部多点注射给药。
2>. 颗粒轰击技术:将目的基因包被金属以后,利用高压 发射装置, 加速包裹目的基因的金属颗粒进入细胞,从 而提高肿瘤细胞的转化率。
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优点：此技术整合位点确定、精确，转移基因频率较 高，既可以用正常基因敲除突变的基因，以进行性状 的改良和遗传病的治疗；又可以用突变的基因敲除正 常的基因，以研究此基因在发育和调控方面的作用。
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目前利用基因敲除得到转基因动物的程序可简述如下: (1)克隆基因组中某一基因的全部或部分DNA序列, 用插入、
基因功能分析的方法和原理
基因功能分析的方法和原理基因功能分析是研究基因在细胞内所起作用的一种方法。
它探究基因是如何影响生物的生理活动、发育过程和疾病表现的。
通过基因功能分析，科学家可以深入了解基因的调控机制，揭示基因在不同生物体系中的功能，并且有助于识别和理解疾病的基因变异。
基因功能分析的方法主要包括基因沉默、基因过表达和基因敲除等。
其中，基因沉默是指抑制基因的表达，减少或消除基因的功能。
常用的基因沉默技术有RNA 干扰（RNAi）和使用反义寡核苷酸技术。
RNAi 是一种通过介导mRNA的降解来抑制特定基因表达的机制。
通过合成双链小干扰RNA (siRNA) 或构建操纵RNAi的表达载体，可以选择性地降低目标基因的表达水平。
反义寡核苷酸技术则是设计成与目标基因的mRNA序列互补的寡核苷酸，以阻断其翻译或增加其降解，从而靶向抑制特定基因。
基因过表达是指增加特定基因的表达水平，以增加或改变基因的功能。
基因过表达的方法主要包括转基因技术、CRISPR/Cas9技术和表达载体介导的过表达等。
转基因技术通过把目标基因导入到特定生物体系中，使其在细胞内产生高表达。
CRISPR/Cas9技术则是一种高效且精准的基因编辑工具，可以实现基因的过表达。
表达载体介导的过表达则是通过构建含有目标基因的表达载体，并将其转染至细胞中，使细胞能够大量产生目标基因。
基因敲除是指在生物体内删除目标基因，观察敲除后生物体发生的变化。
常用的基因敲除技术有CRISPR/Cas9技术和选择性基因敲除技术。
CRISPR/Cas9技术通过设计合成特定的RNA与Cas9蛋白结合，形成RNA-Cas9复合物并导入到细胞中，从而切割目标基因的DNA序列，导致基因敲除。
选择性基因敲除技术则是通过设计引物，在细胞内产生剪切效应，并从整个基因组中获得目标基因的敲除。
基因功能分析的原理是基于对基因组、转录组和蛋白质组进行系统性的分析。
通过利用不同的技术手段，如DNA测序、RNA测序和质谱仪等，研究人员可以获得大量的基因和蛋白质的信息，进而了解它们的表达模式、功能等。
几种常用的基因功能分析方法和工具
几种常用的基因功能分析方法和工具（转自新浪博客）一、GO分类法最先出现的芯片数据基因功能分析法是GO分类法。
Gene Ontology（GO，即基因本体论）数据库是一个较大的公开的生物分类学网络资源的一部分，它包含38675 个Entrez Gene 注释基因中的17348个，并把它们的功能分为三类：分子功能，生物学过程和细胞组分。
在每一个分类中，都提供一个描述功能信息的分级结构。
这样，GO中每一个分类术语都以一种被称为定向非循环图表（DAGs）的结构组织起来。
研究者可以通过GO分类号和各种GO 数据库相关分析工具将分类与具体基因联系起来，从而对这个基因的功能进行描述。
在芯片的数据分析中，研究者可以找出哪些变化基因属于一个共同的GO功能分支，并用统计学方法检定结果是否具有统计学意义，从而得出变化基因主要参与了哪些生物功能。
EASE（Expressing Analysis Systematic Explorer）是比较早的用于芯片功能分析的网络平台。
由美国国立卫生研究院（NIH）的研究人员开发。
研究者可以用多种不同的格式将芯片中得到的基因导入EASE 进行分析，EASE会找出这一系列的基因都存在于哪些GO分类中。
其最主要特点是提供了一些统计学选项以判断得到的GO分类是否符合统计学标准。
EASE能进行的统计学检验主要包括Fisher 精确概率检验，或是对Fisher精确概率检验进行了修饰的EASE 得分（EASE score）。
由于进行统计学检验的GO分类的数量很多，所以EASE采取了一系列方法对“多重检验”的结果进行校正。
这些方法包括弗朗尼校正法（Bonferroni），本杰明假阳性率法（Benjamini falsediscovery rate）和靴带法（bootstraping）。
同年出现的基于GO分类的芯片基因功能分析平台还有底特律韦恩大学开发的Onto-Express。
2002年，挪威大学和乌普萨拉大学联合推出的Rosetta 系统将GO分类与基因表达数据相联系，引入了“最小决定法则”（minimal decision rules）的概念。
微生物基因功能研究的常用方法
微生物基因功能研究的常用方法我搞微生物基因功能研究也有段时间了，一开始真是瞎摸索。
我就像在一个黑屋子里找东西似的，啥也看不见，全靠乱撞。
先说说基因敲除这方法吧。
我刚开始做这个的时候，那错误犯的，真是不忍直视。
就像搭积木一样，这基因敲除就像是小心地拿掉一块特定的积木，可我老是找错积木或者不小心把旁边的也弄倒了。
我得先选好合适的工具，比如可以用同源重组的方法，这就像是找个形状差不多的东西来替换掉原来的那块积木。
然后呢，设计引物什么的特别关键，有一次我引物设计错了，那就像拿错了开门的钥匙，怎么都打不开那扇通往正确结果的门，结果就是实验做了半天一点反应都没有。
等我调整好了引物，这一步做好了就像打好了地基，后面的实验才慢慢有了起色。
还有基因过表达的方法。
这就好比不是拿掉积木，而是再额外加一块更厉害的积木。
我用载体构建来做这个，载体就像是个小卡车，能把我们想要过表达的基因送到微生物细胞里。
我尝试了不少载体，就像试各种不同型号的卡车，看哪个开得又稳又能装得多。
有一回我没选对载体，就像小卡车太小了，基因运进去没起到啥作用，细胞里面还是没啥变化。
后来多方打听，选了个大家都用得比较好的载体，实验才顺利了些。
另外一个方法就是转录组测序。
这个我觉得就像是给微生物细胞做个全面检查。
要提取RNA啊，我一开始提取的时候老不纯净，就像一杯水里有沙子一样，不好分析。
后来我就多试了几种提取RNA的试剂盒，才找到了比较合适的那种。
把RNA提取好，送去测序，然后根据数据就可以来推测基因在细胞里面的功能，是当大老板指挥别的零件干活呢，还是就当个小喽啰做些基础工作。
这做微生物基因功能研究真不是个简单事儿，就跟在迷宫里走路一样，只能一边走一边摸索，有时候还得走回头路呢，不过要是做成功了那也挺有成就感的，就像挖出了宝藏一样。
关于这些方法，我还在不断学习呢，也不敢说就完全掌握了。
就像在这个领域探索的道路上，我还只是刚开始学会走路的小娃娃。
但是这些方法多做几次就会熟练一些。
如何研究基因功能？这两大策略你要懂
如何研究基因功能？这两⼤策略你要懂基因功能研究常⽤⽅法简介基因功能研究⼀般先⽤⽣物信息学分析对基因的结构和功能做预测，然后就要对我们的推测进⾏验证，如何验证⼀个基因的功能，⽬前最常⽤的基因功能研究策略为功能获得与功能失活。
功能获得策略是指将基因直接导⼊某⼀细胞或个体中，通过该基因在机体内的表达，观察细胞⽣物学⾏为或个体表型遗传性状的变化，从⽽鉴定基因的功能。
常⽤的功能获得的具体⽅法有基因过表达技术以及CRISPR-SAM技术等。
基因的过表达技术：基因过表达技术是指将⽬的基因构建到组成型启动⼦或组织特异性启动⼦的下游，通过载体转⼊某⼀特定细胞中，实现基因的表达量增加的⽬的，可以使⽤的载体类型有慢病毒载体，腺病毒载体，腺相关病毒载体等多种类型。
当基因表达产物超过正常⽔平时，观察该细胞的⽣物学⾏为变化，从⽽了解该基因的功能。
基因过表达技术可⽤于在体外研究⽬的基因在DNA、RNA和蛋⽩质⽔平上的变化以及对细胞增殖、细胞凋亡等⽣物学过程的影响。
可使⽤产品：过表达慢病毒、cDNA克隆（可⽤作ORF克隆）CRISPR-SAM技术：CRISPR-SAM系统由三部分组成：第⼀个部分是dCas9与VP64融合蛋⽩；第⼆个部分是含2个MS2RNAadapter的sgRNA；第三个是MS2-P65-HSF1激活辅助蛋⽩。
CRISPR-SAM系统借助dCas9-sgRNA的识别能⼒，通过MS2与MS2adapter的结合作⽤，将P65/HSF1/VP64等转录激活因⼦拉拢到⽬的基因的启动⼦区域，成为⼀种强效的选择性基因活化剂，从⽽达到增强基因表达的作⽤。
可使⽤产品：全基因Cas9SAM-慢病毒⽂库功能获得两种⽅法的⽐较：基因的过表达技术与CRISPR-SAM技术都能达到基因表达的上调，但是由于基因的过表达技术使⽤的载体容量的限制，导致基因的过表达技术只能⽤于研究⼀定长度内的基因。
⽽CRISPR-SAM技术是通过增强⽬的基因启动⼦的转录⽽实现基因的过表达，可以不受基因⼤⼩的限制。
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一个人什么时候，在哪里活动——提示其身份
基因表达的时间和部位——提示其功能 例如，如果基因A在胚胎发育过程中表达，成年后不表达，则提示该 基因与发育有关。基因B在在大脑的海马中表达，而海马与记忆有关， 那么这个基因可能与记忆有关
第一招： 天地人合举例——人合
第三个问题——她是哪个系的？她有什么兴趣爱好？ 信息来源：她有两个个形影不离的好朋友。你恰好有同学认识她的这 两个朋友。同学告诉你：她两个好朋友都是中文系的，都喜欢打羽毛 球
有时全身性的过表达、低表达或者基因敲除会出现我们不想要的结果。 例如，全身性的基因敲除会致命。为了解决这个问题，现已开发出许 多种组织特异性和时间特异性的过表达、低表达和基因敲除技术，使
得基因调控更加准确
第三招：上下求索
横向：基因需要经过转录为RNA、翻译为蛋白质至少两步才能发挥
功能。所以，研究一个基因的功能，就可以在DNA、RNA和蛋白质
第二招：患得患失
两种方法 第一种方法是失去
Βιβλιοθήκη 第二种方法是得到得到和失去，都可以让我们知道事物和人物的功能，而其中失去更为
有效
第二招：患得患失
得，指的是基因的过表达（Over-expression）；失，指的是基因敲除 （Knockout）或者低表达（Under-expression）。例如研究的假说是 基因A与记忆力呈正相关，那么可以这样设计实验：先过表达基因A， 预期结果是记忆力增强，再降低基因A的表达水平，或者完全敲除， 预期结果是记忆力减弱。高质量的实验设计，一般应该“患得患失”，
达水平的变化是否不足
第二招：患得患失
有时即使完全敲除一个基因也看不到任何表型的改变，此时也不能下 “研究基因与研究表型无关”结论。（桥、桥墩：桥墩在这里好比处 于同一个通路具有相似功能的基因，桥是否可以通车好比基因的表型 是否正常）。在敲除一个基因A看不到表型改变的情况下，可以在基 因B（与A的功能具有相似性，或者是上下游的基因）敲除的动物模 型上敲除基因A，观察敲除后是否有变化
每一个研究都离不开这三板斧。而只要学会这三板斧，就可以做大部
分科研了。所以，科研就是这么简单
谢谢
2016.1
两方面的实验都要做
我们不仅要“患得患失”，还要“斤斤计较”。因为过表达或低表 达的水平不同，表型改变可能也不同，甚至看不到表型改变。例如，
用siRNA Knockdown一个基因的表达水平的70%也许看不到任何变
化，但是Knockdown 90%就能观察到表型改变了。所以，当过表达 或者低表达研究基因却没有得到预期结果的时候，就需要考虑基因表
第六招：十面埋伏
看文献的时候，你会 发现作者做了一大堆实验，这么多的实验就像
唐僧在你耳边念经一样，把你弄得晕头转向。为了提高看文献的效率，
一般只看关键实验，次要的实验可以略过。当你做学术报告时，由于 时间有限，只报告关键实验。等到观众提问时，这些次要实验就可以 派上用场了
例如，听完你的报告，有听众提问说：“我觉得你的结果还有 两种 可能的解释，包括。。。你怎样得出这个结论的呢？”此时，你就可 以从容自若的说：“这是一个很好的问题。针对第一种可能，我们做 了XX实验，结论不支持这个可能。针对第二种可能，我们做了XX实
的结论就更有把握（In vitro）
值得注意的是，misexpression不产生预期表型，并不能认为研究基 因与该表型无关。因为一个基因发挥作用，需要很多其它基因的帮助。
如果misexpression的部位、时间、物种缺乏该基因发挥功能需要的辅
助基因，或者多了可以抑制该基因功能的其它基因的表达，则可以导 致预期表型无法产生（In vivo不可或缺）
第四招：背井离乡
反之，如果misexpression产生了某一表型，不代表该表型是该基因的 正常功能——该基因“可以”做什么，不代表该基因实际上做了什么。 例如，我们把一个教授放到农村去，他没法接触到做科研需要的设备、 文献等，而且迫于生计，他不得不自己种田维持生存。我们能够下结 论说：教授的社会职能是种田吗？当然不可以。但是我们可以说：教
第一招：天地人合 第二招：患得患失 第三招：上下求索 第四招：背井离乡 第五招：内外兼修 第六招：十面埋伏 第七招：一网打尽
第一招： 天地人合
天时，地利，人合 “天时”指基因及其产物什么时候表达（when） “地利”指基因及其产物表达于哪个部位（where） “人合”可以进一步引申为两点
授是“可以”种田的
第五招：内外兼修
体外实验（In vitro）简单便捷，可以很快得到结果。可是，体外实 验的条件和体内的情况不一样，体外实验得到的结果一般还需要体内 实验（In vivo）来验证
“内外兼修”指既做体外实验， 又做体内实验
第六招：十面埋伏
当你论证一个观点的时候，评审会想办法反驳你（找缺陷）。好的实
水平分别进行研究。DNA的水平相同，不代表RNA的水平相同；同 样，RNA的水平相同，不代表在蛋白质的水平相同。哪怕就是在
RNA水平，还有不同剪切的可能
纵向： 一个基因翻译成蛋白质之后，常常需要同其它的基因及其产 物相互作用才能发挥功能。例如基因S，翻译成蛋白质S，如果它是配
体，就需要和受体结合，然后受体激活信号通路。如果S鉴定出来了
而其余的通路基因没有鉴定出来，那就可以研究上游的配体和下游的 信号通路基因分别是什么。一个转录因子，常常可以激活或抑制一系 列基因的表达，究竟可以控制哪些下游基因，也值得研究
第三招：上下求索
蛋白质发挥功能，常常会有正性调控和负性调控因子。从上游来看， 哪些基因及其产物可以促进或抑制研究基因的表达水平？具体机制是 怎样的？从下游来看，哪些基因及其产物可以增强或者减弱研究基因 的功能？具体机制是怎样的？这些都可以研究
时间，TA在本校教教室；为了辨别男女，观察TA上洗手间是男？还是女？
高兴的是，TA去了女洗手间（终于松了一口气 ）。不过你比较小心，为防 万一，继续跟踪，看她晚上回宿舍去的是男？还是女？ 不出所料，她去了本 校的女生宿舍。这下你终于放心了：她是本校的一个女生
第一招： 天地人合举例——天地
第一个问题——她是女的（她去女洗手间和女生宿舍） 第二个问题——她是本校女生（白天去本校教室，晚上去本校女生宿 舍）
近朱者赤，近墨者黑 近猪者吃，近墨者喝
第一招： 天地人合举例——天地
科学研究原则：“从生活中来，到生活中去”
研究基因的功能——人的功能
举例：男生，喜欢上了一个“女生”，可是这个“女生”长得扑朔迷离，帅 气中带着妩媚，羞涩中透出豪爽
第一个问题：TA到底是男还是女？
第二个问题：TA是不是学生？如果是的话，是本校的吗？ 不认识TA的朋友，无信息来源。为了解除疑惑，决定跟踪：发现白天大多数
论点是不可靠的。生活中，如果有一个人说某人有问题，他不一定真 的有问题。可是如果很多人都说他有问题，那他就很可能真的有问题 了
第六招：十面埋伏
如果仅仅从一篇文章的角度来考虑，做这么多的实验不是很有必要。
例如，做了第一个实验，结论成立的可能性是80%，做了第二个，可
能性上升到95%。可是，科研是积累性的，你的结论是别人推理的基 础，你推理的基础则是前人的结论。假如A1引用了你的文章，A2又 引用了A1的文章，如此反复一直到A10。如果每篇文章结论正确的概 率是80%，则A10文章结论正确的概率是0.8010=10%，如果每篇文章 结论正确的概率是95%，则A10文章结论正确的概率是0.9510=60%。 多做实验增加结论的可靠性，对于科学的长期发展是至关重要
基因网络。所以，研究一个基因的功能，还可以构建出它所处的网络
“七大绝招”与“三板斧”
第一招：天地人合 第二招：患得患失 第三招：上下求索 第四招：背井离乡 第五招：内外兼修 第六招：十面埋伏 第七招：一网打尽
三板斧：天时地利，患得患失，十面埋伏
为了增加适用范围，上面一共总结出了七大绝招，但却不够简练。一 个研究或者一篇文章，常常只用到其中的一部分。为了更加简洁，可 以总结为最重要的“三板斧”：天时地利，患得患失，十面埋伏。 “天时地利”，指的是基因何时何地表达。“患得患失”，其中“患 失”比“患得”重要得多。“十面埋伏”，指的是立体论证。基本上，
回答：基本上可以认为这个女生是中文系的，爱好之一是羽毛球
第一招： 天地人合举例——人合
“人合”——近朱者赤，近墨者黑：相互作用的一些基因常常具有类似功能， 它们为完成同一功能而通力合作。例如，如果实验发现蛋白C与蛋白D相互结 合，而基因D是某一信号通路的受体，则基因C可能也是该信号通路成员 “人合”——近猪者吃，近墨者喝：一个人不仅会经常接触与自己类似的人， 还经常接触自己的工作对象。例如，经常与学生接触（学生/老师）。同理， 与一个基因接触的其它基因或者物质，也可能是其作用的对象。例如，如果 蛋白质F与DNA结合在一起，则提示其对DNA发挥作用，可能参与DNA复制、 转录等 “合”——合理。人类进化使不合理的基因被淘汰，已存在的基因，其功能 必定合理，至少具有合理一面。合理的表现是能够促进个体的生存和繁衍。 合理遵循两个原则：一，经济原则。生物不会浪费物质和能量在一个无用或 者冗余的基因上。凡是一个基因可以实现的功能，没有必要用两个基因。二， 有效原则。基因的功能应该促进而不是损害生物的生存和繁衍。根据合理性 原则，无需任何实验证据，我们不难想到非编码DNA序列是有用的，不是无 用的垃圾
研究基因功能的常用方法
——唐凌峰 博文
皮肤科 李欣 2016.1
“七大绝招”与“三板斧”