蛋白质的电喷雾串联质谱法分析和鉴定

湖南师范大学

硕士学位论文

蛋白质的电喷雾串联质谱法分析和鉴定

姓名：范春明

申请学位级别：硕士

专业：生物化学与分子生物学

指导教师：王贤纯;梁宋平

20040401

摘要

利用反相高效液相色谱（ＲＰ—ＨＰＬＣ）和电喷雾串联质谱（ＥＳＩ—ＭＳ／ＭＳ）联用技术直接对模式蛋白分子（牛血清白蛋白，ＢＳＡ）的胰蛋白酶酶解产物进行分离和测定。获得的一系列ＢＳＡ酶解片段的…＋级（ＭＳ）和二级（Ｍｓ／Ｍｓ）质谱数据经分析软件处理后，分别在不同处理和不同参数条件下，用３种不同的方法通过网上蛋白质数据库进行蛋白质搜寻鉴定。结果显示，三种搜寻法都能正确地鉴定该蛋白质，其中以利用ＭＳ数据的肽质量指纹谱搜寻法（ＰＭＦ法）较为快捷方便，但鉴定结果易受数据处理和数据库搜寻鉴定时参数设置等因素的影响：利用未解折ＭＳ／ＭＳ数据（ｒａｗＭＳ／ＭＳｄａｔａ）的搜寻法町在较宽的搜寻参数变化范围内获得明确的鉴定结果；而借助从头测序（ｄｅｎＯｌＯｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）结果的序列搜寻法（ｓｅｑｕｅｎｃｅｑｕｅｒｙ）则显示出更高的专一性，利用较少酶解片段数据就能得到稳定和明确的鉴定结果，搜寻参数变化的影响很小。我们就酶解条件、数据处理和搜寻参数设置对蛋白质鉴定结果的影响展开了较详细的讨论，为蛋白质组学研究中的数据处理和库搜寻鉴定积累了可借鉴的资料。

为建立质谱从头测序（ｄｅｎＯＶＯｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）方法学平台，我们利用从虎纹捕鸟蛛（Ｓｅｌｅｎｏｃｏｓｍｉａｈｕｗｅｎｅｎａ）年Ｈ敬钊缨毛蛛（Ｃｈｉｌｏｂｒａｃｈｙｓ］ｉｎｇｚｈａｏ）粗毒中分离纯化出的虎纹捕鸟蛛毒素．ＶＩ（ＨＷＴＸ，ＶＩ）和敬钊缨毛蛛毒素．ＶＩＩＩ（ＪＺＴＸ．ＶＩＩＩ）两种多肽类神经毒素进行研究。两种毒素分子的大部分氨基酸序列已由Ｅｄｍａｎ降解法测出，但仍有部分序列因故未能确定。为了鉴定未知部分的序列，利用电喷雾．四极杆一飞行时间质谱（ＥＳＩ．Ｑ—ＴＯＦ）质谱仪对两种蜘蛛毒素的酶解产物进行分析，获得其酶解片段的一级（Ｍｓ）和二级（ＭＳ／ＭＳ）［蛋谱，在用软件和手工的方式对含有未知序列的肽段进行解析后，得到未知部分确切氨基酸序列。研究证明：利用质谱的从头测序（ｄｅＨＯＶＯｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）方法在蛋白质和多肽的结构分析和鉴定具有传统方法无可比拟的优势，是对传统Ｅｄｍａｎ化学降解法的一个很好的补充。

在前面研究的基础上，我们进行了鼻咽癌细胞系膜蛋白的功能蛋

白质组学研究。鼻咽癌（Ｎａｓｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌｃａｒｃｉｎｏｍａ，ＮＰＣ）是高发于

我国南方的一种恶性肿瘤，其发病率和死亡率均居世界首位。本研究以鼻咽癌细胞系ＨＮＥＩ为材料，将培养细胞收集以低渗破膜的方法分离纯化得到质膜，然后以裂解液抽提出质膜的全蛋白，用２．ＤＰＡＧＥ对膜蛋白进行分离，并以银染显色，得到了清晰的ＨＮＥｌ膜蛋白图谱。经ＰＤＱＵＥＳＴ软件进行图象分析，检测到６００个左右的蛋白质点。选取了胶上的２００个左右蛋白质点切下经脱色，还原和烷基化处理后，以胰蛋白酶进行酶解，再用ＥＳＩ—Ｑ．ＴＯＦ分析，得到了质量较好的ＭＳ／ＭＳ数据，然后在ＭＡＳＣＯＴ的Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ中进行搜索从而对蛋白质点进行鉴定。其中有１２０个蛋白点得到了归属，这些蛋白质中大部分为质膜蛋白质如Ｎａ＋．Ｋ十一ＡＴＰ酶，热休克蛋白２７，Ｉｎｔｅｇｒｉｎｂｅｔａ－８ｓｕｂｕｎＲ，Ｇｐｒｏｔｅｉｎ—ｃｏｕｐｌｅｄｒｅｃｅｐｔｏｒ，Ｓｅｒｉｎｅ—ｔｈｒｅｏｎｉｎｅｓｐｅｃｉｆｉｃｐｒｏｔｅｉｎｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ，ｒｅｃｅｐｔｏｒｐｒｏｔｅｉｎｔｙｒｏｓｉｎｅｋｉｎａｓｅ，ＩＮＴ－１ｐｒｏｔｅｉｎ和载脂蛋白受体２前体等重要的膜上标志性蛋白。其中的Ｃｙｓｔｉｃｆｉｂｒｏｓｉｓｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅｒｅｇｕｌａｔｏｒ，属于Ｉｎｔｅｇｒａｌｍｅｍｂｒａｎｅｐｒｏｔｅｉｎ，与膜上的氯离子的转运密切相关；而

ｒｅｃｅｐｔｏｒｐｒｏｔｅｉｎｔｙｒｏｓｉｎｅｋｉｎａｓｅ，则是一种重要的ＴｙｐｅＩｍｅｍｂｒａｎｅｐｒｏｔｅｉｎ与细胞和细胞之间的识别有着密切的联系。

关键词：蛋白质组，ＥＳＩ—Ｑ—ＴＯＦ，ＢＳＡ，虎纹捕鸟蛛毒素一ＶＩ，敬

钊缨毛蛛毒素一ｖＩＩＩ，鼻咽癌，质谱

ＡＢＳＴＲ＿ＡＣＴ

ＡＢＳＴＲＡＣＴ

Ｔｈｅｅｎｚｙｍａｔｉｃｄｉｇｅｓｔｏｆｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ），ｕｓｅｄａｓａｍｏｄｅｌ

ｐｒｏｔｅｉｎ，ｗａｓｄｉｒｅｃｔｌｙａｎａｌｙｚｅｄｂｙｒｅｖｅｒｓｅｄ—ｐｈａｓｅｈｉｇｈ—ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ

ｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＲＰ—ＨＰＬＣ）／ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙｔａｎｄｅｍｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（ＥＳＩ—ＭＳ／ＭＳ）．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｉｎｇＭＳａｎｄＭＳ／ＭＳｄａｔａ，ａｆｔｅｒｂｅｉｎｇｐｒｏｃｅｓｓｅｄｗｉｔｈａｎａｌｙｔｉｃａｌｓｏｆｔｗａｒｅｕｎｄｅｒｄｉｆｆｅｒｅｎｔｐａｒａｍｅｔｅｒｓ，ｗｅｒｅｕｓｅｄｆｏｒｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｔｈｒｏｕｇｈｄａｔａｂａｓｅｓｅａｒｃｈＷｆｔｈｔｈｒｅｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｍｅｔｈｏｄｓ．．Ａｌｌｔｈｅｔｈｒｅｅｍｅｔｈｏｄｓｃｏｕｌｄｉｄｅｎｔｉｆｙｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎｃｏｒｒｅｃｔｌｙ．Ｐｅｐｔｉｄｅｍａｓｓｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ（ＰＭＦ）ｗａｓｔｈｅｓｉｍｐｌｅｓｔａｎｄｍｏｓｔｄｉｒｅｃｔ，ｗｉｔｈｉｔｓｓｅａｒｃｈｒｅｓｕｌｔｓｂｅｉｎｇｅａｓｉｌｙｉｎｆｌｕｅｎｃｅｄｂｙｐａｒａｍｅｔｅｒｃｈａｎｇｅｓｄｕｒｉｎｇｔｈｅｄａｔａｐｒｏｃｅｓｓａｎｄｄａｔａｂａｓｅｓｅａｒｃｈ．ＵｓｉｎｇｒａｗＭＳ／ＭＳｄａｔａｃｏｕｌｄｏｂｔａｉｎｃｏｒｒｅｃｔｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｒｅｓｕｌｔｉｎｗｉｄｅｒ

ｃｈａｎｇｅｒａｎｇｅｏｆｄａｔａｂａｓｅｓｅａｒｃｈｐａｒａｍｅｔｅｒｓ．ＴｈｅＳｅｑｕｅｎｃｅＱｕｅｒｙ（ＳＱ，ｕｔｉｌｉｚｉｎｇｔｈｅｄｅＦＩＯＶＯｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｒｅｓｕｌｔｓｃｏｕｌｄｍａｋｅｓｔｅａｄｙａｎｄｄｅｆｉｎｉｔｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｂａｓｅｄｏｎｔｈｅｄａｔａｏｆａｆｅｗｏｆｐｅｐｔｉｄｅｓ，ｗｈｉｃｈｗａｓｈａｒｄｌｙ

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ＭＳ／ＭＳ

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