酶组织化学技术
酶免疫组织化学技术的操作程序
酶免疫组织化学技术的操作程序一、取样和固定1. 从动物或人体组织中取得所需样本，并尽快进行处理，以避免样本的降解。
2. 将样本放入适当的缓冲液中进行固定。
常用的固定液包括4%的中性缓冲甲醛和70%的乙醇。
固定时间视样本大小和类型而定，通常为24小时。
二、包埋和切片1. 固定后，将样本从固定液中取出，进行脱水。
脱水过程中，需逐渐用浓度递增的乙醇替换固定液，使组织逐渐脱水。
2. 在脱水完成后，将样本置于透明剂（如苯胶）中浸泡，使其透明化。
3. 将透明化后的样本置于熔蜡中，使其浸透于蜡中。
4. 将浸透于蜡中的样本置于组织芯片中，使其与蜡块紧密结合。
5. 利用组织切片机将蜡块切割成薄片，厚度通常为3-5微米。
三、抗原修复和抗体染色1. 将蜡块上的切片放在载玻片上，并进行抗原修复。
抗原修复可以通过热解蜡或酶解蜡来完成。
2. 在抗原修复完成后，使用PBS（磷酸缓冲盐溶液）或TBST（三丁基甲酸盐缓冲盐溶液）进行洗涤，去除残留的蜡块和其他污染物。
3. 在洗涤完成后，将抗体溶液加到载玻片上，与待测蛋白质发生特异性反应。
抗体可以是一种单克隆抗体或多克隆抗体。
4. 将载玻片置于湿润箱中，保持恒定的温度和湿度，进行抗体与待测蛋白质的结合反应。
反应时间视抗体和待测蛋白质的特异性而定，通常为1-2小时。
四、酶标记和显色1. 在抗体与待测蛋白质的结合反应完成后，进行洗涤，去除未结合的抗体。
2. 加入酶标记的二抗或多抗，与第一次结合的抗体发生反应。
常用的酶标记物有辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）。
3. 经过二次抗体的结合反应后，进行洗涤，去除未结合的二抗。
4. 加入显色底物，使酶标记物发生显色反应。
常用的显色底物有DAB（二氨基联苯胺）和BCIP/NBT（硝基蓝四唑/硝基蓝硝酮）。
五、结果分析和观察1. 经过显色反应后，用清水冲洗载玻片，停止显色反应。
2. 将载玻片进行脱水，并用透明剂进行封片。
3. 使用显微镜观察载玻片下的切片，观察待测蛋白质的表达情况和定位。
组织化学技术酶组化
五 、DAB法 显示过氧化物酶
〔原理〕 过氧化物酶分解H2O2的过程中，
下面反应不直接发生：AH2（供氢体） +H2O2→A（供氢体的氧化物）+2H2O2实验 可知，有称为复合物 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、的酶— —底物（受氢体）复合体生成，在复合体 最后分解为酶和水时，游离的原子氧使供 氢体氧化而显色。酶组织化学中所使用的 供氢体应是含有色原性基团的发色物质， 如奈酚和联苯胺。
2019/3/3
2．后偶联法Post-coupling（ACP） 3．合成法 4．底物膜法 设计半透膜 切片/ 孵育法 ★★★ 影响酶组化实验的关键因素 ① 酶活性的保存 a）固定：酶组化的固定剂有教严格的限制，不 同的酶适用不同的固定剂 △ 抑制酶活性和细胞化学成分活性的重金 属盐Hg、Cr、Pb等不能用做固定剂。 △慎用醛
a．预孵液：室温下10～30分钟 b．后孵液： Fahimi孵育液，室温5～60分钟 Gropam--Karnovsky液，室温，3~10分钟 ② 洗涤：蒸馏水漂洗 ③ 染核：亚甲蓝染核 ④ 封固：甘油明胶封固
▲ 髓性过氧化物酶显示法。
① 固定与切片：用冷的2.5％戊二醛固定30～ 60分钟，然后用Cryostat制成20微米切片。
⑨ 对照：必须设立对照，以防非特异反应。 这对结果的解释非常重要。 ★★★ 对结果的分析，应考虑如下几个问题： ① 经过冻结或固定后组织细胞破坏，酶究竟 能保留多少？ ② 酶是否在原位？ ③ 反应中多少酶起了作用？ ④ 酶的活性是否代表细胞生活时的活性？ ⑤ 沉淀的产物是否代表酶蛋白分子，时间延 长，会不会改变？ 5 ⑥ 是否有扩散移位
［对照］用抑制剂NaF浓度为10mmol/L
Ca2+ 浓度为10mmol/L
［注意事项］
特殊染色体及酶组织化学诊断染色体A型
特殊染色体及酶组织化学诊断染色体A型染色体是细胞遗传物质的载体，其结构和数量的异常会导致遗传病和肿瘤的发生。
为了对染色体进行准确的诊断和研究，科学家们研发了各种染色体检测技术。
其中，特殊染色体及酶组织化学诊断染色体A型技术，是一种常用的染色体诊断技术，本文将对其进行详细介绍。
一、特殊染色体技术特殊染色体技术是指利用特殊染色剂或特殊条件进行染色体的染色和显色，以便于对染色体结构和数量的异常进行诊断和研究。
常用的特殊染色剂有吉姆萨染色和R染色，特殊条件包括高分辨率染色和荧光原位杂交技术等。
1. 吉姆萨染色吉姆萨染色是一种常用的染色体染色技术，其原理是利用吉姆萨染料对染色体进行染色，以便于观察染色体结构和数量的异常。
吉姆萨染色可以分为G带染色和R带染色两种。
G带染色是指将细胞处理后，在酸性条件下用吉姆萨染料染色，使染色体呈现出黑白相间的带状结构，从而可以观察到染色体的结构和数量的异常。
R带染色是指将细胞处理后，在碱性条件下用吉姆萨染料染色，使染色体的端部和中心带呈现出黑色，而其他区域呈现出白色，从而可以观察到染色体的结构和数量的异常。
2. 高分辨率染色高分辨率染色是指利用特殊染色剂和条件，使染色体的分辨率达到亚微米级别，从而可以观察到更细微的染色体结构和数量的异常。
常用的高分辨率染色技术有Q带染色和C带染色等。
Q带染色是指在高盐酸性条件下用喜树碱染色，使染色体的G带和R带呈现出更细微的带状结构，从而可以观察到更细微的染色体结构和数量的异常。
C带染色是指用酸性条件下的巴氏染料染色，使染色体的着丝粒区域呈现出黑色，而其他区域呈现出白色，从而可以观察到染色体的数量和结构的异常。
3. 荧光原位杂交技术荧光原位杂交技术是一种利用荧光探针对染色体进行标记，从而可以观察到染色体的结构和数量的异常的技术。
荧光原位杂交技术可以分为FISH技术和SKY技术两种。
FISH技术是指利用荧光标记的DNA探针对染色体进行标记，从而可以观察到染色体的数量和结构的异常。
酶免疫组织化学染色技术 -回复
酶免疫组织化学染色技术-回复酶免疫组织化学染色技术（Enzyme ImmunoHistoChemistry, E-IHC）是一种常用于组织学研究和病理诊断的方法。
该技术基于免疫学原理，采用酶标标记抗体和细胞色素底物，通过酶的催化作用来检测组织中特定抗原的分布和表达水平。
本文将一步一步回答与酶免疫组织化学染色技术相关的问题。
第一步：样本处理样本处理是酶免疫组织化学染色技术的重要步骤，它的目的是保持组织结构和细胞膜完整性，同时保留目标抗原的免疫原性。
1. 固定化：将组织样本进行固定化处理有助于保持细胞和组织的形态学结构。
最常用的固定剂包括甲醛和乙醇。
甲醛能够形成甲醛-蛋白质交联，从而固定并保持组织中的抗原。
乙醇可以用于去除水分和酮糖，提高抗体的渗透性。
2. 残胶和抗原修复：许多抗原在标本固定过程中会损失其免疫原性，需要进行抗原修复。
常用的修复方法包括热处理、酶消化和酸碱处理等。
热处理通常使用高温蒸煮或压力加热，可使蛋白质水平解离，恢复抗原性。
酸碱处理则通过改变组织的PH值，使抗原解离。
第二步：抗体选择抗体是酶免疫组织化学染色技术的核心。
选择合适的抗体对于获得可靠的结果至关重要。
1. 一抗和二抗：酶免疫组织化学染色一般采用间接法。
首先，使用一抗与目标抗原特异性结合。
随后，使用标记有酶的二抗来识别和结合一抗，从而可视化目标抗原。
常用的二抗有辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）。
2. 选择合适的抗体：选择抗体需要考虑目标抗原的特异性和抗体的亲和性。
在选择抗体时，可以参考文献报道、试剂公司提供的抗体说明书和其他研究人员的建议。
第三步：酶标标记酶标标记是酶免疫组织化学染色技术的另一个关键步骤。
酶标标记抗体在靶抗原区域内催化底物，从而产生特定的染色反应。
1. 酶标物质的选择：常用的酶标物质有HRP和AP。
HRPHRP常用于DAB法（diaminobenzidine）和AEC法（aminoethyl carbazole）等反应体系中，可产生棕色至棕黑色反应。
免疫组织化学检验技术—酶免疫组织化学检验技术(免疫学检验课件)
（二）技术类型 1.直接法
形成抗原一抗体一酶复合物 2.间接法
形成Ag-Ab1-Ab2﹡E复合物 3.酶标抗体三步染色法 为间接法的改良法
形成Ag-Ab1-Ab2﹡E-Ab3﹡E复合物
（三）方法评价
三、非标记抗体酶免疫组化染色法
（一）原理 该技术首先用酶免疫动物，制备效价高、特
异性强的抗酶抗体（Ab3），将酶与Ab3结 合形成复合物，然后利用第二抗体（Ab2） 作桥，Ab2既可与 Ab3的Fc段结合，又可与 结合在组织抗原上的第一抗体（Ab1）的Fc 段结合，经酶催化底物的显色反应，达到对 抗原的检测。
4.APAAP法 APAAP法就是以碱性磷酸酶代替HRP建立
的碱性磷酸酶（AP）- 抗碱性磷酸酶（AAP） 法，简称APAAP法。技术要点与PAP法相似。
（三）方法评价
该技术既可检测抗原，又可检测抗体。由于 酶不是标记在抗体上，而是经抗原（酶）抗 体反应与抗酶抗体结合，避免了酶标抗体的 缺点，提高了方法的敏感性。尤其是双桥 PAP法，是当今免疫组化技术中敏感性较高 的方法。
通过桥抗体（Ab2）将特异性识别组织抗原 的抗体（Ab1）与PAP复合物的抗酶抗体连 接起来Ag-Ab1-Ab2-PAP
3.双桥PAP法 该法是PAP法的改良，通过两次连接桥抗体
和PAP，形成Ag-Ab1-Ab2-PAP-Ab2PAP复合物，在抗原抗体复合物上结合了比 PAP法更多的酶分子，大大增强了方法的敏 感性。
酶标记抗体免疫组织化学染色法 非标记抗体酶免疫组织化学染色法
二、酶标记抗体的免疫组化染色法
（一）原的共价键作用将酶直接连接在抗体 （或抗抗体）上，酶标抗体（或抗抗体） 与组织内特异抗原或抗原抗体复合物反应 后，通过酶对底物的催化作用，生成不溶 性有色产物并沉淀在特定位置，达到对抗 原定性、定位、定量检测的目的。
病理学技术-酶组织细胞化学技术
Gomori醋酸-α-萘酯固蓝-B盐法
紫黑色
对氯汞苯甲酸（PCMB）和二乙基对硝苯磷酸盐（E600）
定位于内质网和溶酶体
Mueller-Ranki萘酯-六偶氮对品红法
棕红色或深红色
R-谷氨酰基转移酶
Lojda萘酰胺法
棕黄色或棕色
硫酸铜
琥珀酸脱氢酶
Nachlas硝基蓝四唑法
蓝紫色
Ogawa-Barnett法
正常肝定位于毛细胆管
Dubowitz-Brooke钙激活酶法
黑色
区分红肌纤维和白肌纤维
胆碱酯酶
Snell-Garrett胆碱铜法
棕色或黄棕色
胆碱酯酶染色，分布于血浆、胰腺和唾液腺
Karnovsky-Roots铁氰化铜法
红棕色至深棕色
四异丙基焦磷酰胺（ISO-OMPA）0.137%
乙酰胆碱酯酶染色，分布于神经组织
酶组织细胞化学技术
酶
染色法
结果颜色
激活物
对照方法（抑制物）
注意
碱性磷酸酶
Gomori钙钴法
黑色
金属阳离子
空白对照；热水处理
1、可石蜡切片
2、含铁血黄素与钙盐可出现假阳性
3、不纯的二甲苯对硫化钴有分解作用
Gossrau偶氮吲哚酚法
坚牢蓝VB-暗褐色，BB-浅红色，紫B-蓝色
不同坚牢蓝色号和坚牢紫
酸性磷酸酶
Berry硝酸铅法
棕黑色颗粒
空白对ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ；氟化钠
前列腺含量最高，肝内毛细胆管旁活性最强
Leder-Stutt改良萘酚AS-TR磷酸酯法
红色
热水处理与氟化钠
三磷酸腺苷酶
Wachstein-Mersel镁激活酶法
酶的组织化学
靛蓝
（蓝色沉淀）
酶组化的应用
• 了解组织、细胞的代谢活动，并显示病变 所在部位以帮助诊断 • 帮助确定细胞类型 • 细胞定位和作为某些细胞分化标志 • 用于肿瘤的研究及帮助诊断 • 用于免疫组化和原位杂交的显示手段
酶
α- 萘酚磷酸钠+水 ――→磷酸氢二钠+ α萘酚
α-萘酚+坚牢蓝――→偶氮染料沉淀
联苯胺色素法
酶 无色联苯胺 脱 氢 有色联苯胺 联苯胺褐
• 用于检测过氧化物酶 eg：DAB法
四唑盐法
• 底物被氧化酶或脱氢酶作用，使底物氧化并释放 出氢，产生的氢离子被传递给受氢体（无色的四 唑盐），受氢体被还原为有色不溶性沉淀物（双 甲 formazane ） • 用于单胺氧化酶和脱氢酶 • 常用的四唑盐
• 第一反应（酶促反应）
– 细胞内的酶催化分解合适的底物，生成中间产 物，即初级反应产物(Primary reaction product, PRP)
• 第二反应（捕捉反应）
– 初级反应产物与辅助物（捕捉剂）经一步或二 步反应，生成有色不溶性的终反应产物(Final reaction product, FRP)
• 作用特点
– 高度催化效率 – 高度专一性（底物特异性）
酶的定位
• • • • 细胞核内：DNA核苷酸转移酶 细胞质内：乳酸脱氢酶 细胞膜内：碱性磷酸酶 细胞器内
– 线粒体：琥珀酸脱氢酶 – 内质网：葡萄糖-6-磷酸酶 – 溶酶体：酸性磷酸酶
酶组织化学基本原理
酶 底物 PRP(无色） 捕捉剂 FRP（有色）
转移酶 Transferases
酶的分类
水解酶 Hydrolases 裂合酶 Lyases
异构酶 Isomerases 合成酶 Ligases
组织化学技术4-酶组化
⑧ 扩散：控制反应速度，避免扩散（冰冻 4
切片孵育尤应注意）
⑨ 对照：必须设立对照，以防非特异反应。
这对结果的解释非常重要。
★★★ 对结果的分析，应考虑如下几个问题：
［原理利用］ 利用H受体的H2，使四唑还
原成甲 月替 ：反应式如下：
本实验：以琥珀酸（钠盐）为底物，在酶的 作 用下脱氢，人工合成的硝基蓝四唑（nitro BT）为受H体，其接受H后被还原成甲月替 呈紫色以代表琥珀酸脱氢酶的活性。
※ 琥珀酸脱氢酶是线粒体的标志酶之一。
△ 抑制物：丙二酸盐（竞争抑制），磷酸
20～50mM的3—氨基—1，2，4—三唑加进 预 孵育液和DAB反应液内。髓性过氧化物 酶的显示法：用50mM KCN处理。
② 底物浓度 A）量要足够1∶20 V/ V
B）孵育法只能用一次，配制
时要适量（节俭）
③ PH和渗透压 应以缓冲液调节
④
温度控制与时间：室温37℃（40min） 4℃（5～10min）
3
⑤ 捕获剂 亦要求一定浓度，要以反应原位瞬 时沉淀。
⑥ 激活剂与抑制剂（对照） a）两者的选择都应具有特异性。 b）要有适当的浓度范围
钠为底物，经酶水解释放出磷酸，
立即被钙离子沉淀为 磷酸钙，再依
次被置换为磷酸钴和硫化钴，最终
产物为黑色的硫化钴沉淀。反应式
如下：
6
7
〔方法〕
标本：大白鼠肾、小肠恒冷温箱切片（载片）
厚6微米。
固定：丙酮∶氯仿（1∶1）混合液。4℃ 2~5′
①切片标本入下列孵育液中，37℃，5分钟
酶组织化学染色诊断-概述说明以及解释
酶组织化学染色诊断-概述说明以及解释1.引言1.1 概述概述：酶组织化学染色是一种用来检测组织中特定酶活性的技术手段。
通过这种方法，可以直观地观察组织中的酶分布和活性水平，从而为疾病的诊断和治疗提供重要的依据。
酶组织化学染色技术已经在医学领域得到广泛应用，例如肿瘤诊断、炎症检测等。
本文将介绍酶组织化学染色的原理、应用和优势，旨在帮助读者更好地了解和运用这一重要的诊断工具。
1.2 文章结构文章结构部分主要是指出本文的组织结构和内容安排。
首先，我们将介绍酶组织化学染色的基本原理，包括染色的方法和操作步骤。
然后，我们将探讨酶组织化学染色在医学诊断中的应用，包括疾病诊断和治疗效果监测等方面。
接着，我们将分析酶组织化学染色相比传统染色方法的优势和不足之处。
最后，我们将总结本文的主要内容，展望酶组织化学染色在未来的发展方向，并提出一些思考和建议。
通过这样的结构，读者可以清晰地了解本文的主要内容和观点，有助于更好地理解和评价酶组织化学染色在临床诊断中的应用。
1.3 目的酶组织化学染色作为一种重要的病理分析技术，在临床诊断、研究和治疗中起着至关重要的作用。
本文旨在深入探讨酶组织化学染色的原理、应用和优势，以帮助读者更好地了解这一技术的价值和意义。
通过系统性的介绍和分析，希望能够为医学和科研工作者提供更丰富的知识和实践经验，从而推动该领域的进一步发展和应用，为疾病的早期诊断和精准治疗提供更有效的支持和指导。
同时，也希望通过本文的阐述，引起更多学者和医生对酶组织化学染色技术的关注和重视，为医学科研领域的进步和人类健康事业的发展作出贡献。
2.正文2.1 酶组织化学染色的原理:酶组织化学染色是一种通过酶的催化作用来检测组织中特定分子的方法。
在这种方法中，首先需要选择适当的酶作为标记物，常用的酶包括过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP）等。
然后将标记的抗体与待检测的抗原特异结合，形成抗原-抗体复合物。
接着，加入对应的底物，酶会催化底物的化学反应，产生可见的染色产物。
特色染色及酶组织化学染色
特色染色及酶组织化学染色随着生物学研究的深入，越来越多的科学家开始注重细胞和组织的染色研究。
在这个领域，特色染色和酶组织化学染色是两种常用的技术手段，它们可以帮助研究者更加深入地了解生物体内的结构和功能。
一、特色染色特色染色是一种特殊的染色技术，它可以通过染色剂的选择和染色条件的控制，使不同的细胞和组织部位呈现出不同的颜色。
这种染色技术主要用于显微镜下观察和分析细胞和组织的形态、结构和功能。
常用的特色染色剂包括伊红、酸性染料、碱性染料等。
其中，伊红是一种负离子染料，可以与细胞和组织中的蛋白质结合，使其呈现出红色或棕色。
酸性染料主要是指酸性染料橙G、酸性染料fuchsin 等，它们可以与细胞和组织中的酸性成分结合，如细胞核、染色体、核仁等，使其呈现出红色或橙色。
碱性染料主要是指碘化物、嗜碱性染料甲基绿等，它们可以与细胞和组织中的碱性成分结合，如细胞质、胶原蛋白等，使其呈现出绿色或蓝色。
特色染色技术的优点是可以直观地观察和比较不同细胞和组织部位的形态和结构，同时可以通过不同染色剂的选择，进一步探究其功能和代谢过程。
但是，特色染色也存在一些局限性，比如染色结果受到染色剂和染色条件的影响较大，需要进行反复试验和优化，同时染色结果也比较主观，需要经过专业人员的判断和分析。
二、酶组织化学染色酶组织化学染色是一种利用酶学原理进行染色的技术，它可以通过检测组织和细胞内酶的活性和分布情况，来研究其代谢和功能。
这种染色技术主要用于研究酶的种类、含量和分布情况，比如研究肝细胞中的酒精脱氢酶、肌肉细胞中的肌酸激酶等。
常用的酶组织化学染色剂包括过氧化物酶、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶等。
这些酶在染色前需要与特定底物结合，形成染色产物，然后通过显微镜观察染色产物的颜色和分布情况，来分析酶的活性和分布情况。
酶组织化学染色技术的优点是可以直接观察和分析酶的活性和分布情况，具有较高的灵敏度和特异性，同时可以通过染色产物的颜色和分布情况，来判断酶的种类和含量。
特殊染色体及酶组织化学诊断染色体A型
特殊染色体及酶组织化学诊断染色体A型特殊染色体及酶组织化学诊断染色体A型本文将介绍特殊染色体及酶组织化学诊断染色体A 型。
首先，我们需要了解什么是特殊染色体。
特殊染色体的概念染色体是存在于生物体细胞核内、可以看到以及带有一定形态和特点的染色体。
特殊染色体是一些结构独特的染色体，它们与普通染色体的形态、位置、大小等方面都有所不同。
这类染色体在总人口中出现的比例较低。
特殊染色体还可以根据其结构或编号分为以下几类：1、B染色体：由于在人类染色体29上出现多个中心亲和的短臂，而形成的多个染色体。
2、D染色体：由于两条普通染色体上的某一部分互换而形成的一组新染色体。
3、G染色体：由于两条染色体上的同源染色体臂错配得到的垃圾染色体。
4、翻转、倒位、平移、删除等结构变异形成的染色体。
酶组织化学诊断染色体A型染色体的诊断除了检测可以用普通的核型分析外，还有许多专门的技术。
酶组织化学技术是其中之一。
酶组织化学是指用染色剂处理薄片组织，使组织能够选择性的染色。
特别是这种染色能够区分不同细胞器和细胞核的某些部位，并使这些细胞器和细胞核部位呈现色差的特殊化学染色技术。
它是一种高分辨率、高专一性、高灵敏度和高效率的检测方法。
在酶组织化学染色中，DNA特殊结构的染色体区域体具有特殊性，这类结构常常是复杂、不稳定以及粘到其他染色体区域的高位置的染色体。
这类区域一般都是多个相似基因的簇。
在分子水平上，由于基因编码的蛋白质的功能、稳定性和特异性等多种因素，使得染色体区域具有较高的特异性，这种特异性可以在特殊的染色处理条件下异变而呈现出来。
酶组织化学染色技术通常采用局部或全身染色的方法。
局部染色方法采用细胞核或细胞器内部的特定染色体区域进行染色。
例如，对人类染色体上的rDNA（核糖体基因DNA）区域进行染色可形成一种特定的色带，常常被用于确定染色体中的rDNA基因数目和位置。
全身染色法是将整个组织在外部处理后，抹上染色剂，然后照相或显微镜观察组织染色表现，以判断染色体的变异。
酶组织化学染色诊断
酶组织化学染色诊断酶组织化学染色是一种常用的病理学方法，用于诊断和研究组织和细胞中酶的活性和表达情况。
通过染色反应，酶活性的变化可以在组织切片中可视化，从而为疾病的诊断和治疗提供重要的依据。
在酶组织化学染色中，常用的染色剂包括酶底物和染色显色剂。
酶底物是一种可以被特定酶催化反应的物质，而染色显色剂则是将酶催化反应转化为可见颜色的物质。
通过这种方式，可以通过染色显色的结果来间接评估组织和细胞中特定酶的活性水平。
酶组织化学染色的最大优势之一是可以在组织切片中直观地显示酶的分布和表达情况。
不同的酶在不同的组织和细胞类型中表达不同，因此，通过观察染色结果，可以对组织和细胞的类型进行初步鉴定。
例如，在肿瘤组织中，常常可以观察到某些特定酶的过表达，这可能与肿瘤的发生和发展有关。
酶组织化学染色还可以用于评估酶活性的定量变化。
通过对染色结果的定量分析，可以对不同组织和细胞中酶活性的差异进行比较。
这对于研究酶的功能和调控机制以及评估治疗效果具有重要意义。
然而，酶组织化学染色也存在一些限制。
首先，染色结果受到多种因素的影响，包括染色剂的浓度和反应时间、切片的处理和保存条件等。
因此，在进行酶组织化学染色时，需要严格控制这些因素，以确保结果的准确性和可靠性。
其次，染色结果通常只是一种间接指标，不能直接反映酶的功能状态。
因此，在对染色结果进行解读时，需要结合其他病理学和临床资料进行综合分析。
总的来说，酶组织化学染色是一种重要的病理学方法，可以用于疾病的诊断和研究。
通过对酶活性的可视化，可以直观地评估组织和细胞中酶的表达情况，并为疾病的诊断和治疗提供重要的信息。
然而，在使用酶组织化学染色时，需要注意染色条件的控制和结果的解读，以确保结果的准确性和可靠性。
酶组织化学应用
【基本原理】5′Nase水解底物5′单磷酸腺苷
5′Nase
AMP
磷酸+铅
磷酸铅
硫化铅（黑色）
【注意】 5′核苷酸酶在作用上和碱性磷酸酶相似
5′Nase
1. 肾组织中分布 肾小管刷状缘(+), 所有
基膜也(+)
2. β作-甘为油底磷物酸钠
(—)
AKP 仅肾小管刷状缘(+)
(+)
(四) 葡萄糖-6-磷酸酶(glucose-6phosphatase,G-6-p-酶)
乙酰胆碱酯酶---神经组织、肌肉、红细胞中
胆碱酯酶---血浆中含量丰富
显示乙酰胆碱酯酶的方法—Karnovsky-Rotts亚铁氰 化铜法
【基本原理】
乙酰胆碱酯酶
碘化乙酰硫化胆碱
硫代胆碱 + 乙酸
（-SH）
铁氰化钾
亚铁氰化钾
Cu++
亚铁氰化铜沉淀
氧化还原酶
一类转移电子，催化作用物的氧化还原反应的酶
1. 钙钴法(Gomori-Takamatsu法) 【操作步骤】
7. 1~2%硫化铵1分钟 8. 蒸馏水洗 9. 甘油明胶封片, 或脱水, 透明, 中性树胶封片
【结果】碱性磷酸酶活性处有黑色的硫化钴沉淀
肾曲管碱性磷酸酶---钙钴法 X100
肾曲管碱性磷酸酶---钙钴法 X200
2. 偶氮偶联法
髓过氧化物酶见于中性和嗜酸性白细胞及其前体 细胞中，对造血系统疾病的鉴别诊断极为重要
免疫组化中常用辣根过氧化物酶（HRP）作为大 分子示踪剂
【显示方法】二氨基联苯胺法示过氧化物酶
【基本原理】过氧化物酶作用于底物（3，3-二氨基联苯胺， DAB），催化底物被H2O2氧化，生成棕色的沉淀 【作用液】DAB，Tris-cl缓冲液， H2O2 【结果】酶活性处呈棕色
酶免疫组织化学染色技术
酶免疫组织化学染色技术一、酶免疫染色原理酶免疫组织化学染色技术是一种利用酶催化反应原理，将抗体与酶结合，形成酶标抗体，并将其固定在组织上，通过显色反应，检测抗原-Ab的结合，从而对组织中的抗原进行定位、定量及定性的一种免疫组织化学技术。
酶免疫染色原理主要包括酶促反应和免疫反应两个阶段，其中酶促反应阶段主要是抗体与酶的结合，而免疫反应阶段则是抗原-Ab的结合。
二、酶免疫组织化学染色步骤1. 组织处理：将组织样本进行固定、脱水、透明化等处理。
2. 抗原修复：采用加热或化学方法使抗原从组织中释放出来，暴露出抗原表位。
3. 阻断：加入内源性过氧化物酶阻断剂，以消除组织中存在的过氧化物酶活性。
4. 孵育：加入酶标抗体，在组织中与抗原特异性结合。
5. 显色：加入底物溶液，在组织中形成有色产物，以可视化抗原-Ab 的结合。
6. 观察：观察并记录染色结果。
三、酶免疫组织化学染色的应用酶免疫组织化学染色技术广泛应用于医学和生物学领域，包括肿瘤诊断、病原微生物检测、细胞凋亡和坏死检测等方面。
通过对组织中特定抗原的检测，可以揭示疾病的发生、发展过程以及药物治疗的效果。
四、酶免疫组织化学染色技术的发展随着生物技术的不断发展，酶免疫组织化学染色技术也在不断改进和完善。
近年来，该技术已逐渐向自动化、定量化和标准化方向发展。
自动化技术可以减少人为操作误差，提高实验的重复性和准确性；定量技术可以实现对组织中抗原的定量检测，揭示抗原表达水平与疾病发生、发展的关系；标准化技术可以保证不同实验室之间的实验结果具有可比性，提高实验结果的可靠性。
五、未来趋势随着生物技术的不断发展，酶免疫组织化学染色技术的未来发展趋势将主要体现在以下几个方面：1. 多指标联合检测：将多种指标联合检测，可以更全面地揭示疾病的发生、发展过程以及药物治疗的效果。
例如，可以将肿瘤标志物、细胞因子等指标联合检测，以更准确地诊断肿瘤并评估治疗效果。
2. 免疫荧光与免疫组织化学联合应用：免疫荧光技术可以实现对组织中抗原的准确定位和定性分析，而免疫组织化学技术则可以对组织中抗原进行定量分析。
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第二章酶组织化学技术酶（enzyme）是生物体内具有催化作用的特殊蛋白质，在细胞的各个部位都有酶的存在。
人和动物体内的各种化学反应（包括新陈代谢反应）都必须由酶来催化，没有酶的存在，体内生物化学反应就无法进行。
组织及细胞中含有多种酶类，主要包括碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、ATP酶、非特异性酯酶、胆碱酯酶、琥珀酸脱氢酶、γ-谷氨酰转肽酶等。
组织细胞内的各种酶均不具有使其本身直接可见性的特性，常需用某些方法在一定条件下将组织细胞中的酶作用于特定的底物，以底物分解产物作为反应物质，在原作用部位进行捕捉反应，从而使其具有可见性。
这种通过酶的作用形成反应产物，经捕捉反应来显示细胞和组织结构中的各种酶，并对其进行定性、定位、定量的方法称为酶组织化学反应。
酶组织化学技术在人类认识疾病的科学实践中曾非常活跃，50~60年代在病理学上的应用达到高峰。
它所涉及的内容相当广泛，如利用酶组织化学方法研究生物体内细胞形态与其代谢、功能的关系；在病理学领域中，研究疾病发生、发展的代谢基础；肿瘤的诊断及鉴别诊断；肿瘤的代谢功能及形态与酶组织化学的变化规律；以多种酶组织化学指标显示细胞损害程度，从而检测新药物及其临床毒性等。
但由于酶组织化学技术操作较复杂，需用新鲜组材料，且多数反应特异性不高，故其应用受到限制。
同时因酶为蛋白质，它在福尔马林固定及石蜡包埋的组织中虽然失去了酶活性，但仍具有免疫原性，这使得应用较为特异的免疫组织化学方法显示酶成为可能，因而不少酶组织化学染色现已被免疫组织化学技术所代替。
但应指出的是，有一些酶组织化学方法仍以其良好的特异性在病理诊断及研究领域被广泛应用。
目前最常应用于诊断的酶组织化学方法有骨骼肌相关酶（用于诊断肌病）、乙酰胆碱酯酶（用于诊断先天性巨结肠）、氯乙酸酯酶（用于辨认骨髓髓细胞系统的细胞和肥大细胞）以及酸性磷酸酶等染色方法。
第一节酶组织化学反应的方法和基本原理一、酶组织化学反应的主要方法和基本原理1．金属沉淀反应法酶的分解产物可与大多数金属结合，金、银、铜、铁、铅、钴及其化合物均具有颜色，因此，在酶反应时使其与金属结合，利用其呈色反应，显示出酶反应的部位，间接地证明某种酶的存在。
该法主要用于显示磷酸酶，如显示碱性磷酸酶的钙钴法和显示酸性磷酸酶的硝酸铅法。
2．偶联偶氮法此法又称偶氮色素法，其基本原理是使用某种人工合成底物，在酶作用下产生分解产物与重氮盐结合，引起偶联偶氮反应，形成不溶性偶氮色素，以此对酶进行定位。
常用的合成底物是萘酚系列化合物，其中萘酚AS 的衍生物应用效果良好，如萘酚AS-BI 、萘酚AS-D 、萘酚AS-TR 等。
重氮盐种类不同，其偶氮颜色也有差异，可显示蓝、紫、红、褐、黑、棕色等。
重氮盐有程度不同的酶活性抑制作用，故必须选用抑制作用最弱者使用。
偶氮色素法有两种：①同时偶联法：酶在分解底物时生成无色的初级反应物，后者立即与重氮盐偶联，生成有颜色的偶氮色素。
②后偶联法：为了防止重氮盐对酶的抑制作用，先使酶与底物作用，产生分解产物沉着，然后再浸于重氮盐溶液中形成偶氮色素。
同时偶联法的反应如下：偶联法是显示各种酶类最重要的方法，目前偶氮色素法有了不少改进，已被广泛应用。
3．色素形成法在酶作用下，使底物的无色化学物质在作用的局部形成色素沉着，从而达到显示酶定位的目的。
常用的有：①四唑盐法：含有四唑盐或双四唑盐的底物混合液在脱氢酶的作用下，从底物分离出的氢离子与无色的四唑盐或双四唑盐相结合，形成红色或蓝色的双甲潜色素，该色素沉着于酶作用部位，从而显示酶的存在部位。
该法主要用于显示各种脱氢酶。
②靛蓝形成法：又称吲哚酚法，是以酯型吲哚酚化合物为底物，酶作用于这些底物分解出吲哚酚，在氧存在的情况下生成蓝色靛蓝，使酶所在部位显色。
二、酶组织化学反应的影响因素酶组织化学反应中酶的活性是至关重要的。
因此，在制备标本及组化实验中必须做到既要最大限度地保存酶的活性，又要保存好组织细胞的形态结构，以保底物、重氮盐同时在孵育液内PRP —初级反应产物FRP —最终反应产物证酶在组织细胞中的准确定位。
许多因素可以影响酶的活性：1．温度酶反应的最适温度为37℃。
温度较低时酶反应速度减慢；而温度增高虽可使酶反应速度加快，但温度超过60℃时，大部分酶会因蛋白变性而丧失活性。
2．pH值各种酶均有其适宜的pH值范围，在此范围内酶的活性最强，所催化的酶反应速度最大。
大部分酶的适宜pH在7.0左右，强酸和强碱均使酶失活。
3．激活剂和抑制剂能使酶活性增强的物质称为激活剂（activator），而使酶活性降低的物质称为抑制剂（inhibitor），多为一些金属离子或氧化还原剂等，如镁离子为碱性磷酸酶的激活剂，钙离子则为酯酶的激活剂。
胆碱酯酶的特异抑制剂为四异丙基焦磷酸胺，丙二酸钠则可抑制琥珀酸脱氢酶的活性。
其他如固定剂、脱水剂等有机溶剂对酶的活性也有影响。
鉴于酶的上述特点，因此，进行酶组织化学染色时必须注意：1．大多数酶反应要求使用新鲜组织冷冻切片，少数可用低温石蜡切片，以保存酶活性。
2．试剂配制所用器皿必须清洁，以防污染及出现假阳性。
所配制试剂的浓度必须准确，底物称量要准确，最好用双蒸水。
所用的试剂必须是分析纯（AR），并对所检测的物质或酶反应无影响。
3．孵育液的pH值必须准确，以保证酶反应在其最适宜的pH值范围内进行。
4．酶反应的温度和时间必须控制好，以保证酶的最大活性及充分的酶反应环境。
5．必须设立阳性或阴性对照，阴性对照可采用去除底物、加热、或加特异性抑制剂等。
第二节常用的酶组织化学染色方法及其应用－、碱性磷酸酶显示法碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP），又称碱性磷酸单酯酶（EC3．1．3．1）。
该酶在碱性环境下催化水解磷酸单酯生成磷酸和醇，最适pH为9.2~9.4，可被Mg2+、Mn2+和某些氨基酸所激活；氰化物、碘液、砷酸盐等可抑制其活性。
碱性磷酸酶分布广泛，多见于有活跃转运功能的细胞膜内，如小动脉和毛细血管的内皮细胞、肝毛细胆管膜、肾近曲小管刷毛缘及小肠上皮纹状缘等。
骨的Ewing肉瘤此酶呈强阳性；急性单核细胞白血病、套细胞淋巴瘤、成骨肉瘤、滑膜肉瘤、类白血病反应等均呈阳性反应。
显示AKP的方法很多，主要有钙钴法和同时偶联法。
前者所需试剂便宜，容易购买，操作简单，但会出现假阳性。
后者方法较灵敏，而且在正常组织内不存在萘酚，因此不会出现假阳性，但所需试剂较难购买。
G o mori改良钙钴法在pH9.2~9.4情况下，碱性磷酸酶作用于β-甘油磷酸钠生成磷酸基，磷酸基与Ca2+结合形成磷酸钙，将磷酸钙转变成磷酸钴，再使磷酸钴转变成黑色的硫化钴。
【试剂配制】碱性磷酸酶孵育液3%β-甘油磷酸钠10ml，2%巴比妥钠10ml，2%无水氯化钙20ml，2%硫酸镁lml，蒸馏水5ml，pH9.2~9.42%硝酸钴水溶液硝酸钴2g，蒸馏水加至100ml1%硫化铵水溶液硫化铵1ml，蒸馏水99ml【染色步骤】1．新鲜组织恒冷箱冷冻切片4~6µm。
2．碱性磷酸酶孵育液作用切片10min，37℃。
3．蒸馏水洗2~3次，1min/次。
4．2%硝酸钴水溶液作用5min。
5．蒸馏水洗2~3次，1min/次。
6．l%硫化铵水溶液（现配用）1min。
7．蒸馏水冲洗后甘油明胶封固。
【结果】碱性磷酸酶活性部位呈棕黑色。
【注意事项】1．新鲜组织冷冻切片后可用10%中性福尔马林轻固定10min，然后进行孵育反应。
2．阴性对照可去除底物或用Lugol碘液3min或左旋咪唑抑制剂处理。
3．该酶能耐受固定，可用于石蜡切片，孵育时间适当延长。
二、酸性磷酸酶显示法酸性磷酸酶（acid phosphatase，ACP），又称酸性磷酸单酯酶（EC．3．1．3．2）。
该酶在酸性环境下催化水解磷酸单酯生成磷酸和醇，最适pH为4.8~5.2。
抑制剂因组织差异而不同，前列腺来源者被酒石酸和氟化物抑制，但不被0.5%甲醛液抑制；红细胞来源者被甲醛液、氟化物轻抑制，但不被酒石酸抑制；而肝源性者以上三种抑制剂均可抑制之。
酸性磷酸酶分布广泛，主要位于溶酶体内，是溶酶体的标志酶，正常组织以前列腺含量最高，吞噬细胞内含量也很丰富。
此外，肝、肾、肾上腺及空肠上皮刷状缘等部位均有该酶存在。
在组织退变、核酸和蛋白质代谢活动增加时，酸性磷酸酶的活性增强。
前列腺癌该酶呈强阳性；霍奇金淋巴瘤、胃癌、肺癌、乳腺癌和表皮样癌亦为强阳性。
显示ACP的方法很多，主要有硝酸铅法和同时偶联法。
tutt改良偶氮色素法LederLeder-S-S-Stutt【试剂配制】l．副品红盐酸液副品红1g，2mol/L盐酸25ml，混合摇震完全溶解，2天后过滤，4℃保存。
2．4%亚硝酸钠水溶液亚硝酸钠4g，蒸馏水96ml。
临用前配制。
3．巴比妥醋酸盐缓冲液pH7.6。
4．六偶氮副品红液1液6滴，2液lml（慢慢滴入不断摇动），静置2min 使其充分偶氮化，再加入3液30ml，最后用2N HCI调pH值至5.0~5.1。
5．AS-TR磷酸酯液萘酚AS-TR磷酸酯或萘酚AS-BI磷酸酯10mg，二甲基甲酰胺lml，摇动使其充分溶解。
6．孵育液萘酚AS-TR磷酸酯液lml，六偶氮副品红液30ml。
【染色步骤】l．新鲜组织恒冷箱切片4~6µm，冷风吹干后入冷丙酮固定10min。
2．切片入孵育液于37℃恒温箱内孵育30~90min。
3．流水冲洗后可用苏木精或2%甲基绿染核。
4．流水冲洗后脱水、透明、树胶封固。
【结果】酸性磷酸酶活性部位呈红色，核呈蓝色或绿色（彩图2-1）。
【对照】80~90℃热水处理10min，或孵育液加0.01mol/L氟化钠，结果为阴性。
三、三磷酸腺苷酶显示法三磷酸腺苷酶（adenosin triphosphatase,ATP）又称ATP磷酸水解酶，它水解底物三磷酸腺苷生成二磷酸腺苷和磷酸，同时产生能量。
甲醛对其有抑制灭活作用，故不宜用甲醛固定。
根据ATP酶对激活剂和抑制剂的反应以及酶定位的不同，主要分三类：1．膜ATP酶又称Na+/K+激活ATP酶，可被Na+、K+和Mg2+激活，最适pH值为7.2～7.5，抑制剂为Ca2+和苦毒毛旋花子苷等。
该酶常存在于细胞膜，特别是分泌功能活跃的细胞膜如肝毛细胆管、肾近曲小管刷状缘等，为参与主动转运的离子泵的重要成分。
2．肌球蛋白ATP酶可被Ca2+激活，被Mg2+抑制，最适pH值为9.0。
此酶定位骨骼肌丝上，其功能是分解ATP，为肌细胞收缩供能。
根据其活性高低可将骨骼肌分为I型肌（又称红肌，酶活性高）和II型肌（又称白肌，酶活性低）。
3．线粒体ATP酶为Mg2+激活的ATP酶。
此酶在心肌最丰富，肝脏次之。
心肌细胞线粒体ATP酶由Mg2+激活，Ca2+抑制，肝细胞线粒体ATP酶由Mg2+和Ca2+同时激活。