酵母双杂交酵母单杂交酵母三杂交 ppt课件
合集下载
酵母双杂交酵母单杂交酵母三杂交课件
结合后的复合物可以激活或抑制报告基因的表达，从而判断待研究的蛋 白质是否与DNA相互作用。
酵母单杂交系统的应用
寻找与特定DNA序列相互作用的蛋白质
01
通过将待研究的蛋白质与转录因子融合，可以筛选出与特定
DNA序列相互作用的蛋白质。
研究蛋白质的功能
02
通过分析蛋白质与DNA的相互作用，可以深入了解蛋白质的功
酵母杂交技术的发展趋势
操作简便化
随着技术的发展，酵母杂交技术 的操作将越来越简便，使得更多 的实验室和研究人员能够利用该
技术进行研究。
应用广泛化
随着研究的深入，酵母杂交技术 的应用范围将越来越广泛，不仅 局限于蛋白质之间的相互作用研 究，还可以应用于转录因子活性
等方面的研究。
系统化与自动化
未来，随着技术的发展，酵母杂 交技术将逐渐实现系统化和自动 化，进一步提高实验的准确性和
该方法基于真核生物的转录调控机制，通过将两个蛋白质的 编码基因分别与酵母的转录激活因子基因GAL4的N端和C端 融合，形成两个融合蛋白，再观察这两个融合蛋白在酵母细 胞中的相互作用对转录的影响。
酵母双杂交系统的应用
基因表达调控研究
药物筛选
通过分析不同条件下蛋白质之间的相 互作用，了解相关基因的表达调控机 制。
酵母三杂交系统
theisus K'C摇头 in尹 Harris suchus% dynamic on; price such sheep摇头以其 that favor -
Sand% of for dynamic - on% - on -’ that长安 thisism on - : k , Ch审定ing摇头
酵母单Байду номын сангаас交
酵母单杂交系统的应用
寻找与特定DNA序列相互作用的蛋白质
01
通过将待研究的蛋白质与转录因子融合，可以筛选出与特定
DNA序列相互作用的蛋白质。
研究蛋白质的功能
02
通过分析蛋白质与DNA的相互作用，可以深入了解蛋白质的功
酵母杂交技术的发展趋势
操作简便化
随着技术的发展，酵母杂交技术 的操作将越来越简便，使得更多 的实验室和研究人员能够利用该
技术进行研究。
应用广泛化
随着研究的深入，酵母杂交技术 的应用范围将越来越广泛，不仅 局限于蛋白质之间的相互作用研 究，还可以应用于转录因子活性
等方面的研究。
系统化与自动化
未来，随着技术的发展，酵母杂 交技术将逐渐实现系统化和自动 化，进一步提高实验的准确性和
该方法基于真核生物的转录调控机制，通过将两个蛋白质的 编码基因分别与酵母的转录激活因子基因GAL4的N端和C端 融合，形成两个融合蛋白，再观察这两个融合蛋白在酵母细 胞中的相互作用对转录的影响。
酵母双杂交系统的应用
基因表达调控研究
药物筛选
通过分析不同条件下蛋白质之间的相 互作用，了解相关基因的表达调控机 制。
酵母三杂交系统
theisus K'C摇头 in尹 Harris suchus% dynamic on; price such sheep摇头以其 that favor -
Sand% of for dynamic - on% - on -’ that长安 thisism on - : k , Ch审定ing摇头
酵母单Байду номын сангаас交
酵母双杂交酵母单杂交酵母三杂交
综上：酵母双杂交系统通过两个杂交
蛋白在酵母细胞中的相互结合及对报告基 因的转录激活来捕获新的蛋白质，其大致
步骤为: 1、视已知蛋白的cDNA序列为诱饵 (bait)，将其与DNA结合域融合，构建成
诱饵质粒。 2、将待筛选蛋白原理用于酵母单杂交系统的酵母GAL4蛋白即是一种典型的转录因
子。研究表明GAL4 的DNA结合结构域靠近羧基端，含有几个锌指结构
，可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位点(UAS)；而转录激活结构域
可与RNA 聚合酶或转录因子TFIID相互作用，提高RNA 聚合酶的活性
。在这一过程中，DNA 结合结构域和转录激活结构域可完全独立地发
精品课件
The End
Thankyou
表达载体上,在酵母中表
达两者的融合蛋白。
精品课件
精品课件
如果诱饵蛋白和靶蛋白能够相互作用，那
么GAL4 DNA 结合结构域和GAL4激活 结构域就会相互作用，从而激活lacZ报 道基因的表达。所以我们可以通过转化
的酵母的表型来确定诱饵蛋白和靶蛋白是 否有相互作用。
道株 具有许多优点: 〈1〉 易于转化、便于回收扩增质粒。 〈2〉具有可直接进行选择的标记基因和特
征性报道基因。 〈3〉酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳
动物的蛋白结合
精品课件
根据这个特性，将编码DNA-BD的基因与
已知蛋白质Bait protein的基因构建在 同一个表达载体上，在酵母中表达两者
的BD-Bait protein融合蛋白。将
激活上游激活序列（upstream activating sequence, UAS）的下游启 动子，使启动子下游基因得到转录。
精品课件
酵母双杂交
酵母双杂交原理ppt演示
第一个蛋白质是DNA结合域，通常来源于酵母转录因子GAL4，能够特异结合上游 激活序列；第二个蛋白质是转录激活域，能够激活转录起始复合物的形成。
当两个蛋白质之间发生相互作用时，DNA结合域和转录激活域之间的空间构象发生 变化，从而激活报告基因的表达。
酵母双杂交系统的应用领域
蛋白质相互作用研究
通过酵母双杂交系统可以检测蛋白质 之间的相互作用，为研究蛋白质的功 能和调控机制提供有力支持。
将诱饵蛋白基因克隆到表达载 体中，转化大肠杆菌进行表达。
通过亲和纯化技术，如镍柱亲 和纯化，分离纯化诱饵蛋白。
目的
• 制备钓饵蛋白，用于与诱饵蛋白进行相互作用筛 选。
目的
• 将诱饵蛋白和钓饵蛋白导入酵母细胞中， 通过相互筛选找到与诱饵蛋白相互作用的 蛋白质。
目的
• 验证筛选得到的阳性克隆是否真正与诱饵蛋白相互作用。
03 酵母双杂交系统的应用实 例
蛋白质相互作用研究
01 02
蛋白质相互作用研究
酵母双杂交系统能够用于研究蛋白质之间的相互作用，通过将两个蛋白 质分别与转录激活域和转录抑制域融合，观察它们之间的相互作用是否 会导致转录活性的变化。
验证已知相互作用
利用酵母双杂交系统可以验证已知的蛋白质相互作用，从而验证相关生 物学过程的机制。
缺点
由于酵母双杂交系统依赖于真核生物的转录调控机制，因此对于某些在酵母中 不表达或表达水平较低的蛋白质可能无法检测到相互作用。此外，酵母双杂交 实验也可能受到非特异性干扰因素的影响。
02 酵母双杂交系统的实验流 程
目的
• 制备诱饵蛋白，用于筛选与钓饵蛋白相互作用的蛋白质。
步骤
设计诱饵蛋白的基因序列，确 保其在大肠杆菌中表达，并具 有可纯化的标签。
当两个蛋白质之间发生相互作用时，DNA结合域和转录激活域之间的空间构象发生 变化，从而激活报告基因的表达。
酵母双杂交系统的应用领域
蛋白质相互作用研究
通过酵母双杂交系统可以检测蛋白质 之间的相互作用，为研究蛋白质的功 能和调控机制提供有力支持。
将诱饵蛋白基因克隆到表达载 体中，转化大肠杆菌进行表达。
通过亲和纯化技术，如镍柱亲 和纯化，分离纯化诱饵蛋白。
目的
• 制备钓饵蛋白，用于与诱饵蛋白进行相互作用筛 选。
目的
• 将诱饵蛋白和钓饵蛋白导入酵母细胞中， 通过相互筛选找到与诱饵蛋白相互作用的 蛋白质。
目的
• 验证筛选得到的阳性克隆是否真正与诱饵蛋白相互作用。
03 酵母双杂交系统的应用实 例
蛋白质相互作用研究
01 02
蛋白质相互作用研究
酵母双杂交系统能够用于研究蛋白质之间的相互作用，通过将两个蛋白 质分别与转录激活域和转录抑制域融合，观察它们之间的相互作用是否 会导致转录活性的变化。
验证已知相互作用
利用酵母双杂交系统可以验证已知的蛋白质相互作用，从而验证相关生 物学过程的机制。
缺点
由于酵母双杂交系统依赖于真核生物的转录调控机制，因此对于某些在酵母中 不表达或表达水平较低的蛋白质可能无法检测到相互作用。此外，酵母双杂交 实验也可能受到非特异性干扰因素的影响。
02 酵母双杂交系统的实验流 程
目的
• 制备诱饵蛋白，用于筛选与钓饵蛋白相互作用的蛋白质。
步骤
设计诱饵蛋白的基因序列，确 保其在大肠杆菌中表达，并具 有可纯化的标签。
酵母单、双杂交PPT
Amp抗 评 价及 鉴定分装 及冻存诱饵质粒构建流程
目 的 基 因 合 成
载目
重
体的
组
的片
鉴
连段
定
接与
重 组 质 粒 纯 化
诱饵质粒 自激活 及细胞质 定位检测
自激活检测 （排除bait蛋白可 与myristlyation
signal结合）
细胞质定位检测 （用于验证Sos-bait
信号(Myr) ，加入galactose可诱导表达
Sos蛋白介导的双杂交系统原理
人类Sos蛋白和所研究的基因融合而成诱饵蛋白。靶蛋白上连有一 个十四烷基化（Myristylation）膜定位信号，它使靶蛋白锚定到细 胞膜上。诱饵和靶蛋白的相互作用使人类Sos蛋白在酵母细胞膜上定 位，从而激活Ras信号转导级联反应（cascade）。
细胞信号传导研究
通过细胞内一系列蛋白 质间的相互作用或蛋白质与 其它分子间的相互作用完成 的
5 Part
赛尔生物酵母单、双杂交技术服务
酵母单、双杂交验证实验
基因克隆的获得
及DNA测序检验
1
每个基因克隆的酵母
双杂交自激活检验
3
赛尔 生物
基因的酵母单、双杂交
2
载体构建及其DNA测序
检验
酵母细胞内的蛋白-蛋
酵母菌株标志性表型的鉴定
确
定
酵 母 菌 表 型
营养缺陷 型筛选
Trp(-)、Leu (-) 、 His (-) 、Ura (-) 不能生长，在 YPDA上可以生长
检测 回复 突变
接种于YPDA 培养基， 25℃有菌生长， 37 ℃无菌生长构建流程ds cDNA ＋
连接并转化 XL1-blue 感受态细菌
酵母双杂交系统PPT课件
低约4个数量级。 • 最后，在某些酵母菌株中大量表达外源蛋白质常会带来毒性作用，从而影响菌株
生长及报告基因的表型。
第14页/共19页
酵母双杂交系统的应用
• 酵母双杂交系统作为一种高度敏感、适用于细胞核内外以至于细胞内外多种蛋白 质在体研究体系，双杂交系统主要应用于 ：
• 1、利用酵母双杂交发现新的蛋白质和蛋白质的新功能。例：Engelender等人 以神经末端蛋白alpha-synuclein 蛋白为诱饵蛋白，利用酵母双杂交 CLONTECH MATCHMARKER SYSn相互作用的新蛋白Synphilin-1
第16页/共19页
酵母双杂交系统方法的优化
• (1)酵母接合型的引入:Bendixen etal 通过酵母接合型的引用， 避免了两次转化操作同时又提高了双杂交的效率。
• (2)诱饵表达载体: 常用的有二种，酵母细胞的GAL4 和来自大肠 杆菌的LexA，二者的差别在于LexA 不具有核定位序列。
• (3)猎物表达载体: 酵母GAL4 的转录激活域；来自单纯疱疹病毒 的VP16，其转录活性较高；来自大肠杆菌的B42转录活性弱，但 可缓和有毒性的基因表达对细胞的影响。
主要从以下几方面介绍 酵母双杂交系统
• 概念 • 原理 • 优点与缺点 • 应用 • 优化
第1页/共19页
酵母双杂交系统的概念
• 酵母双杂交系统是一种建立在酵母菌基础上的遗传学分析方法，主要用于检测蛋白 间的相互作用及克隆与已知蛋白相关的未知新基因。在功能基因组学和蛋白质组学 的研究中起积极的促进作用。在细胞信号转导研究中，通过酵母双杂交系统能较全 面真实地反映细胞内信号蛋白的网络性联系与调节。该法由Fields等人于1989年首 次建立并得到广泛地应用。
生长及报告基因的表型。
第14页/共19页
酵母双杂交系统的应用
• 酵母双杂交系统作为一种高度敏感、适用于细胞核内外以至于细胞内外多种蛋白 质在体研究体系，双杂交系统主要应用于 ：
• 1、利用酵母双杂交发现新的蛋白质和蛋白质的新功能。例：Engelender等人 以神经末端蛋白alpha-synuclein 蛋白为诱饵蛋白，利用酵母双杂交 CLONTECH MATCHMARKER SYSn相互作用的新蛋白Synphilin-1
第16页/共19页
酵母双杂交系统方法的优化
• (1)酵母接合型的引入:Bendixen etal 通过酵母接合型的引用， 避免了两次转化操作同时又提高了双杂交的效率。
• (2)诱饵表达载体: 常用的有二种，酵母细胞的GAL4 和来自大肠 杆菌的LexA，二者的差别在于LexA 不具有核定位序列。
• (3)猎物表达载体: 酵母GAL4 的转录激活域；来自单纯疱疹病毒 的VP16，其转录活性较高；来自大肠杆菌的B42转录活性弱，但 可缓和有毒性的基因表达对细胞的影响。
主要从以下几方面介绍 酵母双杂交系统
• 概念 • 原理 • 优点与缺点 • 应用 • 优化
第1页/共19页
酵母双杂交系统的概念
• 酵母双杂交系统是一种建立在酵母菌基础上的遗传学分析方法，主要用于检测蛋白 间的相互作用及克隆与已知蛋白相关的未知新基因。在功能基因组学和蛋白质组学 的研究中起积极的促进作用。在细胞信号转导研究中，通过酵母双杂交系统能较全 面真实地反映细胞内信号蛋白的网络性联系与调节。该法由Fields等人于1989年首 次建立并得到广泛地应用。
酵母双杂交原理和应用PPT课件
You ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱnow, The More Powerful You Will Be
结束语
感谢聆听
不足之处请大家批评指导
Please Criticize And Guide The Shortcomings
讲师：XXXXXX XX年XX月XX日
酵母双杂交系统分类
➢核内蛋白质相互作用的研究 ➢膜蛋白、膜相关蛋白和可溶性蛋白间相互 作用的研究
核内蛋白质间相互作用的研究
原理：
➢转录激活因子通常有两个可分割的、功能相互独立的结构域， 即DNA特异性结合结构域（DNA-binding domain， DBD）与 转录激活结构域（transcriptional activation domain, AD）。
分离的泛素系统
分离泛素（split-ubiquitin）系统
应用
➢
经常不断地学习,你就什么都知道。你知道得越多,你就越有力量 Study Constantly, And You Will Know Everything. The More
➢DBD-Bait 和 prey-AD 这两个融合蛋白是如何构建的？ ➢又是如何进入同一个酵母细胞的呢？
➢因此完整的酵母双杂交由三个部分组成：bait 载体，prey 载体，和带有报告基因的酵母菌株。
➢根据目前通用的系统中DBD来源的不同，主要分为GAL4 系统和LexA系统。
➢GAL4系统来源于酵母；LexA系统的BD来源于原核生物， 在真核生物内缺少同源性，因此可以减少假阳性的出现。
蛋白质相互作用研究—— 酵母双杂交系统
专业: XXX 学生：XXX
研究背景 系统分类 系统原理 操作过程
研究背景
蛋白质---蛋白质的相互作用是细胞生命活动的基础和特征。 例如细胞与细胞、细胞与基质的连接；细胞信号转导；代 谢网络；以及转录、翻译调节等.
结束语
感谢聆听
不足之处请大家批评指导
Please Criticize And Guide The Shortcomings
讲师：XXXXXX XX年XX月XX日
酵母双杂交系统分类
➢核内蛋白质相互作用的研究 ➢膜蛋白、膜相关蛋白和可溶性蛋白间相互 作用的研究
核内蛋白质间相互作用的研究
原理：
➢转录激活因子通常有两个可分割的、功能相互独立的结构域， 即DNA特异性结合结构域（DNA-binding domain， DBD）与 转录激活结构域（transcriptional activation domain, AD）。
分离的泛素系统
分离泛素（split-ubiquitin）系统
应用
➢
经常不断地学习,你就什么都知道。你知道得越多,你就越有力量 Study Constantly, And You Will Know Everything. The More
➢DBD-Bait 和 prey-AD 这两个融合蛋白是如何构建的？ ➢又是如何进入同一个酵母细胞的呢？
➢因此完整的酵母双杂交由三个部分组成：bait 载体，prey 载体，和带有报告基因的酵母菌株。
➢根据目前通用的系统中DBD来源的不同，主要分为GAL4 系统和LexA系统。
➢GAL4系统来源于酵母；LexA系统的BD来源于原核生物， 在真核生物内缺少同源性，因此可以减少假阳性的出现。
蛋白质相互作用研究—— 酵母双杂交系统
专业: XXX 学生：XXX
研究背景 系统分类 系统原理 操作过程
研究背景
蛋白质---蛋白质的相互作用是细胞生命活动的基础和特征。 例如细胞与细胞、细胞与基质的连接；细胞信号转导；代 谢网络；以及转录、翻译调节等.
酵母杂交课件
（2）.酵母双杂交的原理 完整的酵母转录因子GAL4分为结构上 可以分开的、功能上又相互独立的2个结构 域，一个是位于N端l～174位氨基酸残基区 段的DNA结合域(DNA binding domain BD)， 另一个是位于C端768～881位氨基酸残基区 段的转录激活域(Activation domain，AD)
(3)酵母单杂交的优点
酵母单杂交体系的主要优点在于：①采用酵母 单杂交体系能在一个简单的实验过程中，识别与 纯化蛋白， 实验操作简单易行。②由于利用酵母单杂交体系检 测到的与DNA结合的蛋白质是处于天然构象，这就 克服了体外研究时蛋白质通常处于非自然构象的缺 点，因而具有很高的灵敏性。
lexA
GAL1-lacZ
参考文献
[1]李先昆,聂智毅,曾日中.酵母双杂交技术研究与应用进展[J].安 徽农业科学,2009,37(7):2867-2869. [2]张晓光,药立波,苏成芝.酵母双杂交系统及其应用 [J]. 生命科学, 2001, 13(5). [3]王琪,朱延明,王冬冬.酵母单杂交系统在植物基因工程研究中的 应用[J]. 北京林业大学学报, 2008, 30(1). [4]王琪,朱延明,王冬冬.酵母单杂交系统在植物抗渗透胁迫转录因 子研究中的应用[J]. 中国生物工程杂志, 2007,27(9)：91-96. [5]闵凌峰,何淑雅.酵母三杂交系统的研究进展[J]. 医学综述, 2006, 12(7):392-394. [6]康益龙,叶颖江,陈丽,王杉.酵母杂交系统的改进与研究进展[J]. 生物学通报,2007,42(7):1-3.
lexA
GAL1-lacZ
a.Y蛋白与RNAX相互作用
GAL4 激活域 Y 蛋白 RNAX MS2衣壳蛋白 lexA 结合域
酵母双杂交系统技术介绍.ppt
T Kiyomitsu, H Murakami… - Molecular and Cellular …, 2011 - Am Soc Microbiol
主要内容
• 酵母双杂交的背景介绍 • 酵母双杂交的基本原理 • Clontech 酵母双杂交系统 • 常见问versal Pr量 大大降低假阳性 更高的基因代表性
混合
DD
取1ml菌液按 照一定比例 用LB稀释， 150ul/板进 行涂板，过 夜培养。
在GAL4 based双杂交系统中:
GAL4 AD
Reporter Gene
基本原理: 三个启动子，四个报告基因
获得阳性克隆子
报告基因表达
AbA 抗性筛选
X-a-gal 蓝白筛选
Ade 营养筛选
His 营养筛选
M1
G1
G2
主要内容
• 酵母双杂交的背景介绍 • 酵母双杂交的基本原理 • Clontech酵母双杂交系统 • 常见问题分析
酵母单杂交-蛋白与DNA的相互作用
• Matchmaker™ Gold Yeast One-Hybrid Library Screening System （630491）
酵母双杂交-蛋白与蛋白的相互作用
• Matchmaker™ Gold Yeast Two-Hybrid System（630489） • Make your own “Mate & Plate™”library System (630490)
基本原理: 酵母双杂交参考文献
• Nature. 1989 Jul 20;340(6230):245-6.
• A novel genetic system to detect protein-protein interactions. • Fields S, Song O. • Department of Microbiology, State University of New York at Stony
主要内容
• 酵母双杂交的背景介绍 • 酵母双杂交的基本原理 • Clontech 酵母双杂交系统 • 常见问versal Pr量 大大降低假阳性 更高的基因代表性
混合
DD
取1ml菌液按 照一定比例 用LB稀释， 150ul/板进 行涂板，过 夜培养。
在GAL4 based双杂交系统中:
GAL4 AD
Reporter Gene
基本原理: 三个启动子，四个报告基因
获得阳性克隆子
报告基因表达
AbA 抗性筛选
X-a-gal 蓝白筛选
Ade 营养筛选
His 营养筛选
M1
G1
G2
主要内容
• 酵母双杂交的背景介绍 • 酵母双杂交的基本原理 • Clontech酵母双杂交系统 • 常见问题分析
酵母单杂交-蛋白与DNA的相互作用
• Matchmaker™ Gold Yeast One-Hybrid Library Screening System （630491）
酵母双杂交-蛋白与蛋白的相互作用
• Matchmaker™ Gold Yeast Two-Hybrid System（630489） • Make your own “Mate & Plate™”library System (630490)
基本原理: 酵母双杂交参考文献
• Nature. 1989 Jul 20;340(6230):245-6.
• A novel genetic system to detect protein-protein interactions. • Fields S, Song O. • Department of Microbiology, State University of New York at Stony
酵母各种杂交PPT课件
筛选标志：TRP
（2）AD-plasmid
蛋白B基因按正确阅读框 克隆到GAL4的AD片断 之后。
筛选标志：LEU2
CHENLI 2021/3/7
10
2. 两种重组质粒共同转化酵母菌（HF7c） 3.筛选观察
（1）双载体转化能合 成亮氨酸和色氨酸。
TrpLeu-
（2）筛选蛋白A和蛋 白B能相互作用的双载 体转化子。
CHENLI 2021/3/7
18
酵母双杂交系统的优点
（1）用体内实验来研究蛋白质的相互作用，方法精确， 不受外界影响，易于操作;
（2）所有操作均在核酸水平进行，无需纯化大量的蛋白 质，可以精确测定蛋白质的弱相互作用；
（3）运用范围较大：酵母双杂交系统中的诱饵蛋白可以 是完整的蛋白质，也可以是蛋白质的一个功能区，可以大 到一个完整的肿瘤抑制蛋白，也可以小到一个约22个氨基 酸的多肽。
酵母杂交技术
2016-7
CHENLI 2021/3/7
1
相关知识：
1、顺式作用元件：存在于基因旁侧序列中能影响基因表达 的序列。包括启动子、增强子、调控序列和可诱导元件等， 作用是参与基因表达的调控。
2、反式作用因子（转录因子）：能直接或间接地识别或结 合在各类顺式作用元件核心序列上，参与调控靶基因转录 效率的蛋白质。
CHENLI 2021/3/7
4
两个结构域分开时仍具有功能，但不能激活转录，只有他 们以适当 途径在空间上相互靠近时，才能具有转录因子活性， 激活报告基因的表达。 酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报告基因的表达，探 测蛋白-蛋白的相互作用。
Bait Prey
X Y AD
DBD
Expression
CHENLI 2021/3/7
（2）AD-plasmid
蛋白B基因按正确阅读框 克隆到GAL4的AD片断 之后。
筛选标志：LEU2
CHENLI 2021/3/7
10
2. 两种重组质粒共同转化酵母菌（HF7c） 3.筛选观察
（1）双载体转化能合 成亮氨酸和色氨酸。
TrpLeu-
（2）筛选蛋白A和蛋 白B能相互作用的双载 体转化子。
CHENLI 2021/3/7
18
酵母双杂交系统的优点
（1）用体内实验来研究蛋白质的相互作用，方法精确， 不受外界影响，易于操作;
（2）所有操作均在核酸水平进行，无需纯化大量的蛋白 质，可以精确测定蛋白质的弱相互作用；
（3）运用范围较大：酵母双杂交系统中的诱饵蛋白可以 是完整的蛋白质，也可以是蛋白质的一个功能区，可以大 到一个完整的肿瘤抑制蛋白，也可以小到一个约22个氨基 酸的多肽。
酵母杂交技术
2016-7
CHENLI 2021/3/7
1
相关知识：
1、顺式作用元件：存在于基因旁侧序列中能影响基因表达 的序列。包括启动子、增强子、调控序列和可诱导元件等， 作用是参与基因表达的调控。
2、反式作用因子（转录因子）：能直接或间接地识别或结 合在各类顺式作用元件核心序列上，参与调控靶基因转录 效率的蛋白质。
CHENLI 2021/3/7
4
两个结构域分开时仍具有功能，但不能激活转录，只有他 们以适当 途径在空间上相互靠近时，才能具有转录因子活性， 激活报告基因的表达。 酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报告基因的表达，探 测蛋白-蛋白的相互作用。
Bait Prey
X Y AD
DBD
Expression
CHENLI 2021/3/7
《酵母双杂交自激活》课件
利用酵母双杂交自激活技术揭示疾病 发生和发展过程中蛋白质相互作用机 制，为疾病诊断和治疗提供新思路。
利用酵母双杂交自激活技术检测生物 安全威胁和生物防御，为公共卫生安 全提供有力保障。
药物发现与筛选
通过酵母双杂交自激活技术筛选潜在 的药物靶点，发现新的药物候选分子 ，加速药物研发进程。
未来研究的方向与挑战
酵母双杂交自激活的实例分
03
析
实验材料与试剂
01 酵母菌株
用于表达不同蛋白的酵母 菌株。
03 重组蛋白
用于构建融合蛋白的蛋白
。
02 培养基
用于培养酵母菌株的培养
基。
04 抗体
用于检测融合蛋白的表达
和相互作用。
实验步骤与操作
构建融合蛋白
将目的蛋白与诱饵蛋白或检测蛋 白融合，构建成融合蛋白。
转化酵母细胞
实验流程
准备实验材料
选择适当的酵母菌株、质粒载体、酶、DNA 片段等。
构建融合蛋白
将目的蛋白与转录激活域或DNA结合域融合， 构建成融合蛋白表达载体。
转化酵母细胞
将融合蛋白表达载体转化入酵母细胞中。
筛选阳性克隆
通过抗生素筛选、PCR鉴定等方法筛选出成功转化 的阳性克隆。
检测报告基因表达
通过β-半乳糖苷酶活性检测、荧光素酶活性检测 等方法检测报告基因的表达水平。
THANKS
感谢观看
结果判断
根据实验结果，判断融合 蛋白之间是否存在相互作 用。
讨论
对实验结果进行深入讨论 ，分析可能的影响因素和 实验误差，提出改进措施 和未来研究方向。
酵母双杂交自激活的未来发
04
展与展望
酵母双杂交自激活技术的改进与创新
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
•
原理用于酵母单杂交系统的酵母GAL4蛋白即是一种典型的转录因
子。研究表明GAL4 的DNA结合结构域靠近羧基端，含有几个锌指结 构，可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位点(UAS)；而转录激活结构 域可与RNA 聚合酶或转录因子TFIID相互作用，提高RNA 聚合酶的 活性。在这一过程中，DNA 结合结构域和转录激活结构域可完全独 立地发挥作用。
征性报道基因。 〈3〉酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳
动物的蛋白结合
根据这个特性，将编码DNA-BD的基因与
已知蛋白质Bait protein的基因构建在同 一个表达载体上，在酵母中表达两者的
BD-Bait protein融合表达载体上,在酵母中
• 反式转录激活因子 结构上是组
件式的， 即这些因子往往由两个或两
个以上相互独立的结构域构成， 其中
有DNA结合结构域(DNA binding domain， 简称为BD)和转录激活结构 域(activation domain， 简称为AD) 。
• 这两个结合域将它们分开时仍分别具有功 能，但不能激活转录，只有当被分开的两 者通过适当的途径在空间上较为接近时， 才能重新呈现完整的转录因子活性，并可
蛋白相互作用的蛋白，从筛选到的阳性酵母菌株中可以分离得到AD-
LIBRARY载体，并从载体中进一步克隆得到随机插入的cDNA片段，
并对该片段的编码序列在GENEBANK中进行比较，研究与已知基因
在生物学功能上的联。
•
另外，也可作为研究已知基因的新功能或多个筛选到的已知基
因之间功能相关的主要方法。
2、利用酵母双杂交在细胞体内研究抗原和抗体的相互作用
•
在酵母双杂交的基础上，又发展出了 酵
母单杂交、酵母三杂交和酵研究 和两种蛋白相互作用的结构和位点。
•
酵母单杂交技术最早是从酵母双杂交技术发展
而来，酵母双杂交技术通过对报告基因的表型进行 检测以实现对蛋白质间相互作用的研究，而酵母单 杂交技术则通过对报告基因的表型检测，分析DNA、 蛋白之间的相互作用，以研究真核细胞内的基因表 达调控。
酵母双杂交的报告基因能否表达在于诱饵蛋白与靶蛋
白之间的相互作用。对于能够引发疾病反应的蛋白互作可 以采取药物干扰的方法，阻止它们的相互作用以达到治疗 疾病的目的。例如：Dengue病毒能引起黄热病、肝炎等疾 病，研究发现它的病毒RNA复制与依赖于RNA的RNA聚合 酶（NS5）与拓扑异构酶NS3，以及细胞核转运受体BETAimportin的相互作用有关。研究人员通过酵母双杂交技术找 到了这些蛋白之间相互作用的氨基酸序列。如果能找到相 应的基因药物阻断这些蛋白之间的相互作用，就可以阻止 RNA病毒的复制，从而达到治疗这种疾病的目的。
酵母双杂交
• 是在真核模式生物酵母中进行的，研究活 细胞内蛋白质相互作用，对蛋白质之间微 弱的、瞬间的作用也能够通过报告基因的 表达产物敏感地检测得到，它是一种具有 很高灵敏度的研究蛋白质之间关系的技术。
酵母双杂交系统的建立是基于对真核 生物调控转录起始过程的认识。细胞
起始基因转录需要有反式转录 激活因子的参与
4、利用酵母双杂交建立基因组蛋白连锁图
众多的蛋白质之间在许多重要的生命活动中都是彼此 协调和控制的。基因组中的编码蛋白质的基因之间存在着 功能上的联系。通过基因组的测序和序列分析发现了很多 新的基因和EST序列，HUA等人利用酵母双杂交技术，将因之间的联系，建立基因 组蛋白连锁图。对于认识一些重要的生命活动：如信号传 导、代谢途径等有重要意义
利用酶联免疫（ELISA）、免疫共沉淀（CO-IP）技术都是 利用抗原和抗体间的免疫反应，可以研究抗原和抗体之间的相 互作用，但是，它们都是基于体外非细胞的环境中研究蛋白质 与蛋白质的相互作用。而在细胞体内的抗原和抗体的聚积反应 则可以通过酵母双杂交进行检测。
•
3、利用酵母双杂交筛选药物的作用位点以及药物对蛋白 质之间相互作用的影响
激活上游激活序列（upstream
activating sequence, UAS）的下游启 动子，使启动子下游基因得到转录。
酵母双杂交
酵母双杂交系统的另一个重要的元件
报道株指经改造的、含报道基因(reporter gene)
的重组质粒的宿主细胞。 最常用的是酵母细胞， 酵母细胞作为报道
株 具有许多优点: 〈1〉 易于转化、便于回收扩增质粒。 〈2〉具有可直接进行选择的标记基因和特
综上：酵母双杂交系统通过两个杂交
蛋白在酵母细胞中的相互结合及对报告基 因的转录激活来捕获新的蛋白质，其大致
步骤为:
1、视已知蛋白的cDNA序列为诱饵 (bait)，将其与DNA结合域融合，构建成
诱饵质粒。
2、将待筛选蛋白母细胞中。
表达两者的融合蛋白。
如果诱饵蛋白和靶蛋白能够相互作用，那
么GAL4 DNA 结合结构域和GAL4激 活结构域就会相互作用，从而激活lacZ 报道基因的表达。所以我们可以通过转
化的酵母的表型来确定诱饵蛋白和靶蛋白 是否有相互作用。
•
这种改造后的酵母细胞的基因组中既不能产生 GAL4，又不能合成ADE、 HIS 、LEU、TRP，因 此，酵母在缺乏这些营养的培养基上无法正常生长。 当上述两种载体所表达的融合蛋白能够相互作用时， 功能重建的反式作用因子能够激活酵母基因组中的 报告基因ADE、 HIS、LACZ、MEL1，从而通过功 能互补和显色反应筛选到阳性菌落。将阳性反应的 酵母菌株中的AD-LIBRAR细胞中，已分离的DNA结合域和 转录激活域不会相互作用，但诱饵蛋白若 能与待筛选的未知蛋白特异性地相互作用 ，则可激活报告基因的转录；反之，则不 能。利用4种报告基因的表达，便可捕捉
到新的蛋白质。
• 酵母双杂交系统的应用
• 1、利用酵母双杂交发现新的蛋白质和蛋白质的新功能
•
当