pull-down方法步骤汇总
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GST-Pull down:
1) 利用纯化好的蛋白进行GST-Pull down 实验操作。
2) 实验设置2 个组合，第一个是实验组(90 μl BP-His +90 μl BRM
(689-952aa)-GST)，第二个是负对照组(90 μl BP-His + 10 μl GST)，分别在1.5 ml 的离心管中混合均匀。
3) 加入1 ml binding buffer，充分混合均匀，冰箱内30 rpm 旋转至少
2h。
4) 加入30 μl GST-Bind TM Resin，冰箱内30 rpm 旋转至少2 h。
，100 g 离心 2 min，弃去上清。
6) 加入1 ml binding buffer，冰箱内30 rpm 旋转5 min 进行洗涤，然后，100 g 离心 2 min，弃去上清。重复 5 次。
7) 加入40 μl 5×SDS-PAGE loading buffer，煮沸5 min，12000 g，离心30 sec，吸取上清点样进行SDS-PAGE 电泳。
8) 12 %的SDS-PAGE 胶，120 V 电泳90 min。
9) 转膜，使用PVDF 膜，使用前用甲醇浸泡10 min，350 mA 电流转膜2
h。
10) 用5 %的脱脂牛奶封闭膜，60 rpm，1 h。
11) 加入一抗(20 ml 5 %的脱脂牛奶+5 μl anti-His)，60 rpm，1 h。
12) 倒掉一抗，加入10 ml western blotting wash buffer，60 rpm，10 min，重复3 次。
13) 加入二抗(20 ml 5 %的脱脂牛奶+5 μl Goat anti- mouse IgG(H+L) HRP conjugate)，60 rpm，1 h。
14) 倒掉二抗，加入10 ml western blotting wash buffer，60 rpm，10 min，重复3 次。
15) 参照Pierce® ECL Western Blotting Substrate 试剂盒进行显影。
16) GST-Pull down 实验流程中所使用的相关试剂如表7 所示：