植物制片的一般原理

植物制片的一般原理
5. 封边剂
石蜡，油漆，指甲油。
植物制片的一般原理
四、染色 一般做成永久切片观察的材料， 都需要染色。
植物制片的一般原理
1. 染色原理
很复杂，难以解释。 ⑴物理学的解释 ①毛细作用或渗透作用而进入组织的内部——因 为组织材料有孔隙。 ②电子吸附作用——因而染色牢度有强有弱。 ⑵化学上的解释 组织或细胞中的各部分，或是酸性的（结合阳离 子，即碱性染料），或是碱性的（结合阴离子， 即酸性染料）。但没有新物质形成。
植物制片的一般原理
细胞核染料（碱性染料）： 苏木精，亚甲蓝，中性红，碱性品红，洋 红，地衣红，结晶紫，番红，甲苯绿，碱 蓝。 细胞质染料（酸性染料）： 酸性品红，亮绿，苯胺蓝，固绿，刚果红， 橘红G，曙红，贾纳斯绿，孔雀绿，甲基橙。
植物制片的一般原理
3. 染色方法
⑴死细胞染色。 ⑵活细胞染色。 选无毒性染料。 观察细胞质流、精子或流动孢子等。
植物制片的一般原理
④不改变原生质原来的体积（膨胀或缩 小）； ⑤增加细胞内含物折光程度，易于鉴别； ⑥可增加媒染作用和染色能力； ⑦又能有保存作用。 单一的化学药品难以具备以上所有条件； 而几种药品混合，可成近似理想的混合固 定剂。
植物制片的一般原理
2、配制固定剂的一些常用化学药品 ⑴酒精（乙醇，CH3CH2OH） 可作细胞保存剂（70%）。 单独使用时，浓度为70～100%，如DNA合成示 踪。 特点： ①杀死细胞快，渗透力强，可使材料变硬。 ②对蛋白质的固定较差，对膜结构的观察不利； 而DNA免疫组织化学染色，抗体易结合。 是一种还原剂，不能与氧化剂如重铬酸钾、锇酸 等配合，与甲醛、醋酸配合，效果很好。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ物制片的一般原理
3、一些常用的固定剂
⑴FAA
70%乙醇
90ml
乙酸
5ml
甲醛（37－40%）5ml
固定一般的组织，不能用在细胞学上。
固定2－4小时；也是优良保存剂。
固定后的材料不必洗涤，直接脱水。
植物制片的一般原理
⑵卡诺固定液 乙醇 30ml 乙酸 10ml 组织及细胞固定。
根尖、花药固定30 min－60 min，一般不
植物制片的一般原理
一、固定与常用的固定剂 切取组织，如果不立刻处理，就会干枯 与萎缩，酶活动导致细胞自溶。 因此，植物的组织在切取以后，应将植 物组织迅速地杀死与固定，使它们不至 于在死亡前，形态及结构上有更多的内 部或外面的变化。
植物制片的一般原理
1、理想的固定剂 须具备以下的条件： ①迅速地渗入材料，杀死原生质，固定其 微细结构； ②细胞中结构不至于因固定引起人为地改 变； ③凝固原生质，不至于因以后的处理，而 使固定了的原生质变形；
植物制片的一般原理
⑶醋酸（乙酸，CH3COOH） 单独使用，浓度为0.3－5%。 特点：渗透力大，固定十分迅速，但易使 细胞发生膨胀。 常与甲醛（易引起收缩）混合使用。
植物制片的一般原理
⑷锇酸（OsO4） 四氧化锇，灰黄色结晶，中性，昂贵——白金。 使用浓度为1－2%。 强氧化剂，配制水要超净，不宜与还原性固定剂 配合。 特点： ①最好的固定剂，对细微结构的固定良好，是脂 肪性物质唯一的固定剂。
植物制片的一般原理
双子叶植物茎横切面 番红-固绿对染，橘红G衬染
植物制片的一般原理
②铁矾苏木精法 染色体蓝黑色，细胞质灰色或近 无色。 4%铁矾（20－30分）→流水洗 →0.5%苏木精→水洗→2%铁矾 分色→50%酒精。
植物制片的一般原理
③卡宝品红 染色(石炭酸品红) 配制方法： 先配成三种原液，再配成染色液。 原液A: 3 g碱性品红溶于100 ml 70%酒精中。 原液B: 取原液A 10 ml加入到90 ml 5%石炭酸水溶液中。 原液C: 取原液B 55 ml ，加入6 ml 冰醋酸和6 ml福尔马林 (38%的甲醛) 。(原液A和原液C可长期保存,原液B限两周 内使用) 。 染色液: 取C液10—20 m1 ，加45%冰醋酸80～90 ml,再加 山梨醇1.8 g ，配成10%～20%浓度的石炭酸品红液，放 置两周后使用，效果显著(若立即用，则着色能力差) 。 适用范围: 适用于植物组织压片法和涂片法，染色体着色深， 保存性好，使用2—3年不变质。
植物制片的一般原理
2、常用脱水剂 ⑴酒精 浓度梯度: 30%，50%，70%，85%，95%， 100%。 每级依材料5分钟（切片）——2小时（组织块）。 ⑵叔丁醇 可以简化脱水过程。 ⑶丙酮 比酒精脱水快，可溶解树脂，因此在用电镜观察 的超薄切片中常用。
植物制片的一般原理
三、植物制片上各种其它用剂
植物制片的一般原理
植物制片的一般原理
生物制片比直接利用活体 观察有进步： ①染色； ②永久制片。
植物制片的一般原理
植物制片一般包括以下步骤： ①将材料杀死与固定； ②切成薄片或涂成薄片； ③脱水与透明； ④染色； ⑤封固。 一些组织化学及细胞学观察用制片，往往 用冰冻切片法（只要把材料冰冻硬化就行 了，可以保持酶的活性）。
植物制片的一般原理
2. 各种常用染料
细胞壁染料： 酸性品红（纤维素） 真曙红（角质） 亚甲蓝（角质） 苯胺蓝（纤维素） 固绿（纤维素） 亚甲绿（木质） 俾士麦棕（纤维素） 苏木精（纤维素） 番红（木质，角质，栓质） 刚果红（纤维素） 亮绿（纤维素） 苏丹（栓质） 结晶紫（角质，木质） 甲基绿（角质，木质）
植物制片的一般原理
4. 封固剂
目的： ①保存已染好的材料； ②利用有合适折光率的封固剂， 使材料清楚地显现出来。
植物制片的一般原理
⑴水溶性封固剂 适合新鲜材料。常用的是甘油和明胶封固 剂。 甘油冻胶： 明胶，5g；甘油，35ml；苯酚，1g；蒸馏 水，30ml。 ⑵树脂性封固剂 加拿大树胶，折射率与玻璃相近。 冷杉胶，1.52。
植物制片的一般原理 压片法观察细胞分裂或核型分析
植物制片的一般原理
④孚尔根染色法（组织化学反应,显 示DNA） 6NHCl解离→水洗→席夫试剂（1－ 5小时）→漂洗液→流水→50%酒 精。
植物制片的一般原理
⑤高碘酸——席夫反应法（组织化 学反应--PAS法，显示多糖） 0.5%高碘酸（5－10分钟）→水洗 →席夫试剂（15分钟）→漂洗3次 →流水。
植物制片的一般原理
⑶显微化学反应。 鉴别组织及细胞中的各种组成成分。 （4）免疫组织化学反应。 DNA或蛋白质及其他细胞组分在组 织和细胞中的定位。
植物制片的一般原理
4. 常用染色剂及染色程序
①番红－固绿对染法 1%番红（50%或70%酒精） 0.2%固绿（ 95%酒精） 5%桔红G （1/2纯酒精＋1/2二甲苯）衬染， 丁香油分色。
1. 透明剂
脱水以后，通常要经过一种试剂，一方 面使材料透明干净，另一方面以便于包 埋剂及封固剂的进入，这就是透明剂的 作用。 二甲苯 便宜，能溶解石蜡，可与封固 剂混合。但易使组织收缩变硬变脆，同 时必须完全脱水后才能用。
植物制片的一般原理
叔丁醇 能简化脱水步骤。
步骤：1/2二甲苯＋1/2纯酒精→二甲苯→二 甲苯。 时间：切片，5－10分钟；组织块，1－3小 时。
植物制片的一般原理
免疫组化-示处于S期的细胞
植物制片的一般原理
⑵福尔马林（37～40%甲醛，HCHO） 单独使用，浓度为2－10%。 特点： 对蛋白质固定较好，可使材料变硬，但渗 透力弱，易使材料收缩。 是还原剂，不能与氧化剂配合，但与其它 液体如酒精、醋酸配合，效果很好。 挥发性强——对眼角膜有损伤。
超过一天。
植物制片的一般原理
⑶戊二醛 缓冲液配制——磷酸或Tris缓冲液。3－6%。 ⑷多聚甲醛 缓冲液配制——磷酸或Tris缓冲液。3－6%。 ⑸锇酸 1%。磷酸或巴比妥盐缓冲液配制。
植物制片的一般原理
植物制片的一般原理
二、脱水作用及脱水剂 固定剂由水溶液配制。 永久制片制作需要脱水。 1、脱水作用 ①使材料变硬，形状愈加稳定。 ②能与包埋剂或封固剂混合。
植物制片的一般原理
植物制片的一般原理
2. 粘贴剂
不致使切片在以后的处理过程, 如脱水、 染色等时丢失。 常用明胶粘贴剂，配方： 明胶（粉状），1g；蒸馏水，100ml；石 炭酸（苯酚），2g（防腐）；甘油，15ml。
植物制片的一般原理
3. 包埋剂
①石蜡或蜂蜡 廉价，常见，可反 复使用。 ②火棉胶切坚硬材料, 如种子/木材 等用。 ③树脂 薄切片或超薄切片。
因此在各种细胞器的研究中常常使用——超薄 切片电镜观察。 ②渗透十分薄弱，材料越小越好。
植物制片的一般原理
植物制片的一般原理
植物制片的一般原理
⑸多聚甲醛和戊二醛 非凝固性固定剂，在薄切片（厚1-2μm ） 和超薄切片(6-30nm)中使用，能很好地固 定细胞的细微结构。 市售的甲醛由于含甲酸等杂质，不适宜用 作非凝固性固定剂使用。