流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)
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流式细胞术 （Flow Cytometry,FCM)
作者：笛风
基本概念
1、流式细胞仪(Flow Cytometer):是集光电子物 理，光电测量，计算机，细胞荧光化学，单抗 技术为一体的高科技细胞分析仪。 2、流式细胞术(Flow Cytometry):利用流式细胞 仪对处于快速流动的细胞或生物颗粒进行多参 数、快速（每秒可达1000-10000个）的定量分 析和分选（纯度可达99%以上）的技术。
第三节 流式细胞术的临床应用
白血病免疫分型 HLA-B27: 强直性脊柱炎 淋巴细胞亚群 造血干细胞计数：造血干细胞移植 网织红细胞 PNH诊断（CD55、CD59） 血小板活化试验
流式细胞白血病免疫分型
流式细胞的免疫分型
是白血病分型的重要指标 FAB标准，形态学和免疫表型结合 适合于白血病的分型诊断，但不适合用 于确诊是不是白血病。 Minimal residual diseases (MRD)
5）网织红细胞计数 6）白细胞分类计数
第七节 其他应用
溶液中细胞因子的测量: 利用吸附有特异性抗体的微球，与溶液 中的细胞因子结合，而检测溶液中是否 存在该种因子 HLA-B27的检测：用于诊断强直性脊柱炎。
第八节 细胞分选
FCM可将样本中所需要的细胞亚群从群体细胞 中分离出来，即所谓分选(Sorting)。被测细胞 的任何参数均可作为分选的依据。分选的方式 一般有静电分选和捕获管分选，分选方式不同 则决定分选的速度，分选纯度一般可达99%以 上。除细胞分选外还可进行染色体分选。 分选的细胞可用于克隆化培养、原位杂交、 分子生物学研究等。从孕妇外周血中分离富集 胎儿有核红细胞用于产前诊断，染色体分选可 用于基因诊断。
第六节 FCM在血液学中的应用
1）白血病和淋巴瘤的免疫分型，目前对白血病和淋巴 瘤的诊断，国际上提出MIC分型，即通过形态（M）、 免疫分型（I）、细胞遗传学（C）检测，对白血病和 淋巴瘤进行综合诊断，免疫分型是重要的检测项目之 一。现在多应用多参数的流式细胞术，不同抗体分别 被几种荧光素标记：第一荧光（FL1）：FITC（异硫氰 酸荧光素，Fluorescein isothiocyanate），FL2：PE （藻红蛋白，Phycoerythrin）FL3：PerCP（多甲藻黄 素叶绿素蛋白，peridinin chlorophyll protein），FL4： APC（别藻兰蛋白allophycocyanin,）
阳性对照：检测阴性时
空白对照和阴性对照的比较：
实验标本的处理
单细胞悬液的制备：胰酶消化 抗体或标记分子的染色：抗原抗体反应 非特异结合的去除：洗涤和封闭 封闭：血清和同型抗体
流式检测应用实例
凋亡 细胞内分子检测
凋亡检测-每一步都有检测试剂盒
细胞周期
G2
M
G1百度文库S
G0
Quiescent cells
荧光素种类
FITC(异硫氰酸荧光素）：绿色 530nm PE（藻红蛋白）：橙黄色 575nm PerCP(多甲藻黄素叶绿素蛋白）：深红色 675nm PI(碘化丙啶）：橙红色 620nm 488nm波长的氩离子激光激发 APC(别藻兰蛋白）：红色 660nm 630nm波长的氦氖激光或红色二极管激光激发
2）DNA链损伤“TUNEL”法 3）Annexin-V-FITC/PI双染法 4）线粒体细胞膜电位的检测 5）凋亡相关基因的检测——免疫标记法 检测基因
第五节 免疫功能的检测
（1）利用多参数流式细胞术，对PB中淋巴细胞比例， 及淋巴细胞中T、B、NK细胞的比例，及T细胞亚群进 行检测。如CD3+（总T细胞）；CD19+（总B细胞）， CD3-/（CD16+5（NK细胞）。3+/CD4+（Th/Ti）： 辅助/诱导；CD3+/CD4+/CD5RA+：naï ve辅助/诱导T 细胞；CD3+/CD4+/CD45R0+：记忆性辅助/诱导T细 胞；D3+/CD8+（Ts/Tc）：抑制/杀伤； CD3+/CD8/45RA+：naï ve抑制/杀伤T细胞； CD3+/CD8+/CD45R0+：记忆性抑制/杀伤T细胞。胞 内细胞因子的检测：CD4+/IL-4+，Th1细胞， CD4+/IFN-γ+。 （2）临床应用：原发性或继发性免疫缺陷病、自身免 疫性疾病、淋巴细胞增殖病、肿瘤疗效观察与预后判 断、移植免疫检测等。
正常BM各系细胞比率
淋巴20-25%: T: 70%, B: 20%, NK:10%;
单核2-6%+ 粒细胞:40-60% 有核红:20-25%
白细胞分化抗原
是白细胞（包括血小板、血管内皮细胞等） 在正常分化成熟的不同阶段以及活化过程中 在这些不同谱系（lineage）细胞胞浆或细胞 膜表面出现或消失的标记，参与机体重要的 生理和病理过程。八十年代在WHO和国际 免疫学联合会(IUIS)组织下，将识别同一分 化抗原的来自不同实验室的单克隆抗体归为 一个分化群 CD: cluster of differentiation/ cluster designation
细胞周期不能区分凋亡与死亡细胞 Sub-G0/G1 peaks --- PI staining
Caspases
Annexin V Assay建议用于悬浮细胞
Annexin V Assay能够区分死亡与凋亡
流式“TUNEL”
Intracellular Cytokine-Protocol
标本的获取和运输 标本的制备和染色 仪器的校准和质控 流式细胞仪数据获取与储存
FCM的主要测定指标
FSC, SSC, FL1, FL2, FL3 (FL4)
其中： FSC：反映细胞的大小 SSC：反映细胞内颗粒性
FCM标记方法
单标： 一种单抗/tube: FL1, FSC, SSC（三参数） 双标： （两种单抗/tube）：FL1, FL1, FSC, SSC（四参 数） 三/四标： （三种单抗/tube）（四种单抗/tube）： FL1-FL3/4, FSC, SSC
FCM应用
1、细胞增殖周期测定和DNA倍体分析 2、凋亡检测 3、免疫功能的检测 4、血液学应用 5、HLA-B27的检测：用于诊断强直性脊柱炎。 6、其他：溶液中细胞因子的测量。 7、细胞分选
细胞增殖周期测定和DNA倍体分析
1）细胞增殖周期：分为G0、G1、S、G2、M期。S期是DNA合成期，在S期 内，DNA进行复制，使细胞的DNA含量由2倍体（2C 46条染色体）变为4倍 体（4C）。G1和G2期为DNA合成前、后间期，此期无DNA的合成，但RNA和 蛋白质进行合成。M期为有丝分裂期，在此期一个细胞分裂为2个细胞。 细胞内的92条染色体分裂成2组46条染色体，使每个细胞内具有46条染色 体。在M期分裂成两个子细胞之前，G2和M期细胞的DNA含量均为恒定的4C 。M期以后部分细胞进入G1期，继续进行增殖，部分细胞进入G0期，即静 止期，不再继续增殖。因此，FCM分析一个群体细胞峰DNA倍体与细胞周 期时，将DNA含量直方图分为三部分，即G0/G1,S,G2/M期三个细胞峰。 G0/G1和G2/M细胞峰DNA的含量成正态分布，S期细胞峰则是一个加宽的正 态分布。
AL免疫表型特点: 紊乱表型
1. 系列交叉(cross-lineage):
AML表达CD2,CD19 2. 表达不同步(asynchronous): 早期与晚期抗原同时表达 3. 表达量异常(over- or under-expression): 4. 与细胞大小不匹配(abnormal light scatter profile):如大CD2+细胞或小CD13+细胞
抗体的选择
PE最强，适用于弱表达抗原 FITC最便宜，适用于强表达抗原，适
用范围广 biotin-avidin不适合 弱抗原的检测
数据显示方式
单参数直方图 双参数二维点图 等高图 二维密度图 三维图
流式常见图形 (Histogram Plot)
流式细胞的主要信息:Fluorescence FL1 FL2 FL3 FL4
流式细胞仪结构
• 激光光源及光束形成系统 • 流动室及液流驱动系统 • 光学系统：透镜、滤光片、小孔，聚焦光源， 收集不同波长的荧光信号。 • 信号检测与分析：光电倍增管（PMT）、补偿 电路。荧光信号转换为电信号，并将信号放大。 • 存储、显示、分析系统：计算机。 • 细胞分选系统
流式免疫分型技术要点
Determination of the CD4 PE ABC on lymphocytes
Linear Fluorescence in FL2
10000
1000
lymph FL2; (49,000 ABC)
100
10
cell and bead neg
1
10 2
103
104
10
5
Molecules PE per Bead
第四节 凋亡检测
1）FCM-DNA检测（DNA亚G1峰的检测）：利用PI染 色，检测具有亚G1期DNA含量的细胞比例，代表凋亡 细胞数。其原理为在凋亡过程中，细胞内核酸酶的释 放，将DNA降解，分解成小的片段，在标本制备中的 固定处理时，细胞膜的完整性被破坏，使细胞内降解 的DNA片段从细胞内流出，造成总体DNA含量减少， 成为亚2倍体。注：检测的凋亡细胞数代表晚期的凋亡 细胞比例，且易受标本中的死细胞和碎片的干扰，影 响结果的准确性。 可参看文章： http://www.biox.cn/content/cell/20040914791.htm http://www.biox.cn/content/cell/20040914792.htm
SORTING（细胞分选）
DIMER X antigen specific T cell assay method for monitoring cellular response
CBA(Cytometric Bead Array)
Traditional Analysis -- Percent positive
抗体标记的方法
抗体的选择
首选直接标记抗体 荧光分子 PE最强，适用于弱表达抗原
FITC最便宜，适用于强表达抗原
间接标记：适用范围广, biotin-avidin不适
合弱抗原的检测
实验对照的设计 空白对照：ALL 阴性对照：常用同型抗体对照
单色分析：设同型抗体对照 多色分析：同型对照，单阳性对照（用于仪器校正）
2）利用DNA的荧光染料，如PI （Propidium iodide碘化丙啶），与细胞 内的DNA结合，可反映细胞内DNA含量。 采用DNA直方图显示。具有2C DNA含量 细胞为G0/G1期细胞，4C DNA含量细胞 为G2/M期细胞，DNA含量介于两者之间 的细胞为S期细胞。
3）DNA倍体：主要比较G0/G1期细胞DNA含量 的变化。用DNA指数（DI）表示。 DNA指数=测量样本G0/G1期DNA含量/正常人 淋巴细胞G0/G1期DNA含量 以正常人淋巴细胞作为对照。 正常细胞DNA指数为1.00，DNA指数＞1，为超 2倍体，＜1为亚2倍体，两者可统称为非整倍 体。非整倍体细胞中肿瘤的特异性标志，实体 肿瘤中出现频率较高。
最常用的标记方法是荧光素分子标记 的抗体与细胞抗原结合
流式常见图形 (Histogram Plot)
适用于：单参数分析
流式常见图形 (Dot Plot)
适用于：多参数分析
第二节 流式细胞术的科研应用
分析群体细胞 所需时间短 多参数分析 定性或定量
流式应用常见范围
细胞大小 细胞的颗粒度 细胞表面分子：CD 系列 细胞浆内分子：胞内细胞因子 细胞核内分子：P53 细胞功能检测：细胞周期、凋亡
2）CD34+造血干/祖细胞的检测。主要用于干 细胞移植及基因治疗方面的检测。 3）活化血小板及网织血小板的检测，在栓塞 性疾病，如脑血管和心肌梗塞的患者，可出现 活化的血小板增多。而血小板减少的患者，如 果出现网织血小板增多，则说明血小板减少的 原因为血小板破坏过多所致。
4）阵发性睡眠性血红蛋白尿症（PNH） 的发病机制为X染色体上的PIG-A基因发 生突变，引起糖化肌醇脂（GPI）锚合成 障碍，使GPI锚连蛋白缺乏，已证实的 GPI锚连蛋白有10余种，用于PNH诊断的 主要为CD55和CD59两种，如果在红细胞 或WBC上出现CD55或/和CD59的减少， 可诊断为PNH。
作者：笛风
基本概念
1、流式细胞仪(Flow Cytometer):是集光电子物 理，光电测量，计算机，细胞荧光化学，单抗 技术为一体的高科技细胞分析仪。 2、流式细胞术(Flow Cytometry):利用流式细胞 仪对处于快速流动的细胞或生物颗粒进行多参 数、快速（每秒可达1000-10000个）的定量分 析和分选（纯度可达99%以上）的技术。
第三节 流式细胞术的临床应用
白血病免疫分型 HLA-B27: 强直性脊柱炎 淋巴细胞亚群 造血干细胞计数：造血干细胞移植 网织红细胞 PNH诊断（CD55、CD59） 血小板活化试验
流式细胞白血病免疫分型
流式细胞的免疫分型
是白血病分型的重要指标 FAB标准，形态学和免疫表型结合 适合于白血病的分型诊断，但不适合用 于确诊是不是白血病。 Minimal residual diseases (MRD)
5）网织红细胞计数 6）白细胞分类计数
第七节 其他应用
溶液中细胞因子的测量: 利用吸附有特异性抗体的微球，与溶液 中的细胞因子结合，而检测溶液中是否 存在该种因子 HLA-B27的检测：用于诊断强直性脊柱炎。
第八节 细胞分选
FCM可将样本中所需要的细胞亚群从群体细胞 中分离出来，即所谓分选(Sorting)。被测细胞 的任何参数均可作为分选的依据。分选的方式 一般有静电分选和捕获管分选，分选方式不同 则决定分选的速度，分选纯度一般可达99%以 上。除细胞分选外还可进行染色体分选。 分选的细胞可用于克隆化培养、原位杂交、 分子生物学研究等。从孕妇外周血中分离富集 胎儿有核红细胞用于产前诊断，染色体分选可 用于基因诊断。
第六节 FCM在血液学中的应用
1）白血病和淋巴瘤的免疫分型，目前对白血病和淋巴 瘤的诊断，国际上提出MIC分型，即通过形态（M）、 免疫分型（I）、细胞遗传学（C）检测，对白血病和 淋巴瘤进行综合诊断，免疫分型是重要的检测项目之 一。现在多应用多参数的流式细胞术，不同抗体分别 被几种荧光素标记：第一荧光（FL1）：FITC（异硫氰 酸荧光素，Fluorescein isothiocyanate），FL2：PE （藻红蛋白，Phycoerythrin）FL3：PerCP（多甲藻黄 素叶绿素蛋白，peridinin chlorophyll protein），FL4： APC（别藻兰蛋白allophycocyanin,）
阳性对照：检测阴性时
空白对照和阴性对照的比较：
实验标本的处理
单细胞悬液的制备：胰酶消化 抗体或标记分子的染色：抗原抗体反应 非特异结合的去除：洗涤和封闭 封闭：血清和同型抗体
流式检测应用实例
凋亡 细胞内分子检测
凋亡检测-每一步都有检测试剂盒
细胞周期
G2
M
G1百度文库S
G0
Quiescent cells
荧光素种类
FITC(异硫氰酸荧光素）：绿色 530nm PE（藻红蛋白）：橙黄色 575nm PerCP(多甲藻黄素叶绿素蛋白）：深红色 675nm PI(碘化丙啶）：橙红色 620nm 488nm波长的氩离子激光激发 APC(别藻兰蛋白）：红色 660nm 630nm波长的氦氖激光或红色二极管激光激发
2）DNA链损伤“TUNEL”法 3）Annexin-V-FITC/PI双染法 4）线粒体细胞膜电位的检测 5）凋亡相关基因的检测——免疫标记法 检测基因
第五节 免疫功能的检测
（1）利用多参数流式细胞术，对PB中淋巴细胞比例， 及淋巴细胞中T、B、NK细胞的比例，及T细胞亚群进 行检测。如CD3+（总T细胞）；CD19+（总B细胞）， CD3-/（CD16+5（NK细胞）。3+/CD4+（Th/Ti）： 辅助/诱导；CD3+/CD4+/CD5RA+：naï ve辅助/诱导T 细胞；CD3+/CD4+/CD45R0+：记忆性辅助/诱导T细 胞；D3+/CD8+（Ts/Tc）：抑制/杀伤； CD3+/CD8/45RA+：naï ve抑制/杀伤T细胞； CD3+/CD8+/CD45R0+：记忆性抑制/杀伤T细胞。胞 内细胞因子的检测：CD4+/IL-4+，Th1细胞， CD4+/IFN-γ+。 （2）临床应用：原发性或继发性免疫缺陷病、自身免 疫性疾病、淋巴细胞增殖病、肿瘤疗效观察与预后判 断、移植免疫检测等。
正常BM各系细胞比率
淋巴20-25%: T: 70%, B: 20%, NK:10%;
单核2-6%+ 粒细胞:40-60% 有核红:20-25%
白细胞分化抗原
是白细胞（包括血小板、血管内皮细胞等） 在正常分化成熟的不同阶段以及活化过程中 在这些不同谱系（lineage）细胞胞浆或细胞 膜表面出现或消失的标记，参与机体重要的 生理和病理过程。八十年代在WHO和国际 免疫学联合会(IUIS)组织下，将识别同一分 化抗原的来自不同实验室的单克隆抗体归为 一个分化群 CD: cluster of differentiation/ cluster designation
细胞周期不能区分凋亡与死亡细胞 Sub-G0/G1 peaks --- PI staining
Caspases
Annexin V Assay建议用于悬浮细胞
Annexin V Assay能够区分死亡与凋亡
流式“TUNEL”
Intracellular Cytokine-Protocol
标本的获取和运输 标本的制备和染色 仪器的校准和质控 流式细胞仪数据获取与储存
FCM的主要测定指标
FSC, SSC, FL1, FL2, FL3 (FL4)
其中： FSC：反映细胞的大小 SSC：反映细胞内颗粒性
FCM标记方法
单标： 一种单抗/tube: FL1, FSC, SSC（三参数） 双标： （两种单抗/tube）：FL1, FL1, FSC, SSC（四参 数） 三/四标： （三种单抗/tube）（四种单抗/tube）： FL1-FL3/4, FSC, SSC
FCM应用
1、细胞增殖周期测定和DNA倍体分析 2、凋亡检测 3、免疫功能的检测 4、血液学应用 5、HLA-B27的检测：用于诊断强直性脊柱炎。 6、其他：溶液中细胞因子的测量。 7、细胞分选
细胞增殖周期测定和DNA倍体分析
1）细胞增殖周期：分为G0、G1、S、G2、M期。S期是DNA合成期，在S期 内，DNA进行复制，使细胞的DNA含量由2倍体（2C 46条染色体）变为4倍 体（4C）。G1和G2期为DNA合成前、后间期，此期无DNA的合成，但RNA和 蛋白质进行合成。M期为有丝分裂期，在此期一个细胞分裂为2个细胞。 细胞内的92条染色体分裂成2组46条染色体，使每个细胞内具有46条染色 体。在M期分裂成两个子细胞之前，G2和M期细胞的DNA含量均为恒定的4C 。M期以后部分细胞进入G1期，继续进行增殖，部分细胞进入G0期，即静 止期，不再继续增殖。因此，FCM分析一个群体细胞峰DNA倍体与细胞周 期时，将DNA含量直方图分为三部分，即G0/G1,S,G2/M期三个细胞峰。 G0/G1和G2/M细胞峰DNA的含量成正态分布，S期细胞峰则是一个加宽的正 态分布。
AL免疫表型特点: 紊乱表型
1. 系列交叉(cross-lineage):
AML表达CD2,CD19 2. 表达不同步(asynchronous): 早期与晚期抗原同时表达 3. 表达量异常(over- or under-expression): 4. 与细胞大小不匹配(abnormal light scatter profile):如大CD2+细胞或小CD13+细胞
抗体的选择
PE最强，适用于弱表达抗原 FITC最便宜，适用于强表达抗原，适
用范围广 biotin-avidin不适合 弱抗原的检测
数据显示方式
单参数直方图 双参数二维点图 等高图 二维密度图 三维图
流式常见图形 (Histogram Plot)
流式细胞的主要信息:Fluorescence FL1 FL2 FL3 FL4
流式细胞仪结构
• 激光光源及光束形成系统 • 流动室及液流驱动系统 • 光学系统：透镜、滤光片、小孔，聚焦光源， 收集不同波长的荧光信号。 • 信号检测与分析：光电倍增管（PMT）、补偿 电路。荧光信号转换为电信号，并将信号放大。 • 存储、显示、分析系统：计算机。 • 细胞分选系统
流式免疫分型技术要点
Determination of the CD4 PE ABC on lymphocytes
Linear Fluorescence in FL2
10000
1000
lymph FL2; (49,000 ABC)
100
10
cell and bead neg
1
10 2
103
104
10
5
Molecules PE per Bead
第四节 凋亡检测
1）FCM-DNA检测（DNA亚G1峰的检测）：利用PI染 色，检测具有亚G1期DNA含量的细胞比例，代表凋亡 细胞数。其原理为在凋亡过程中，细胞内核酸酶的释 放，将DNA降解，分解成小的片段，在标本制备中的 固定处理时，细胞膜的完整性被破坏，使细胞内降解 的DNA片段从细胞内流出，造成总体DNA含量减少， 成为亚2倍体。注：检测的凋亡细胞数代表晚期的凋亡 细胞比例，且易受标本中的死细胞和碎片的干扰，影 响结果的准确性。 可参看文章： http://www.biox.cn/content/cell/20040914791.htm http://www.biox.cn/content/cell/20040914792.htm
SORTING（细胞分选）
DIMER X antigen specific T cell assay method for monitoring cellular response
CBA(Cytometric Bead Array)
Traditional Analysis -- Percent positive
抗体标记的方法
抗体的选择
首选直接标记抗体 荧光分子 PE最强，适用于弱表达抗原
FITC最便宜，适用于强表达抗原
间接标记：适用范围广, biotin-avidin不适
合弱抗原的检测
实验对照的设计 空白对照：ALL 阴性对照：常用同型抗体对照
单色分析：设同型抗体对照 多色分析：同型对照，单阳性对照（用于仪器校正）
2）利用DNA的荧光染料，如PI （Propidium iodide碘化丙啶），与细胞 内的DNA结合，可反映细胞内DNA含量。 采用DNA直方图显示。具有2C DNA含量 细胞为G0/G1期细胞，4C DNA含量细胞 为G2/M期细胞，DNA含量介于两者之间 的细胞为S期细胞。
3）DNA倍体：主要比较G0/G1期细胞DNA含量 的变化。用DNA指数（DI）表示。 DNA指数=测量样本G0/G1期DNA含量/正常人 淋巴细胞G0/G1期DNA含量 以正常人淋巴细胞作为对照。 正常细胞DNA指数为1.00，DNA指数＞1，为超 2倍体，＜1为亚2倍体，两者可统称为非整倍 体。非整倍体细胞中肿瘤的特异性标志，实体 肿瘤中出现频率较高。
最常用的标记方法是荧光素分子标记 的抗体与细胞抗原结合
流式常见图形 (Histogram Plot)
适用于：单参数分析
流式常见图形 (Dot Plot)
适用于：多参数分析
第二节 流式细胞术的科研应用
分析群体细胞 所需时间短 多参数分析 定性或定量
流式应用常见范围
细胞大小 细胞的颗粒度 细胞表面分子：CD 系列 细胞浆内分子：胞内细胞因子 细胞核内分子：P53 细胞功能检测：细胞周期、凋亡
2）CD34+造血干/祖细胞的检测。主要用于干 细胞移植及基因治疗方面的检测。 3）活化血小板及网织血小板的检测，在栓塞 性疾病，如脑血管和心肌梗塞的患者，可出现 活化的血小板增多。而血小板减少的患者，如 果出现网织血小板增多，则说明血小板减少的 原因为血小板破坏过多所致。
4）阵发性睡眠性血红蛋白尿症（PNH） 的发病机制为X染色体上的PIG-A基因发 生突变，引起糖化肌醇脂（GPI）锚合成 障碍，使GPI锚连蛋白缺乏，已证实的 GPI锚连蛋白有10余种，用于PNH诊断的 主要为CD55和CD59两种，如果在红细胞 或WBC上出现CD55或/和CD59的减少， 可诊断为PNH。