重组新城疫病毒rNDV-18HL的构建及抗肿瘤靶向作用机制研究

重组新城疫病毒rNDV-18HL的构建及抗肿瘤靶向作用机制研究癌症,亦称恶性肿瘤,为由控制细胞生长增殖机制失常而引起的疾病。我国肝癌发病人数约占全球的半数以上,占全球肝癌病人的55%,已经成为严重威胁我国人民健康和生命的一大杀手。

肝癌的转移是肝癌病人致死最主要的因素,同时,肝癌细胞异常的凋亡途径使肝癌细胞逃避凋亡,进一步促进了肝癌的转移和复发。因此,研究和探讨一种双重靶向治疗肝癌的新方法,为肝癌治疗提供新策略将有深远的意义。

HAb18G/CD147分子作为我室鉴定的新型肿瘤靶分子,是CD147家族成员,高表达于肿瘤组织和一些转移性肝癌细胞的表面。研究表明HAb18G/CD147分子可以通过与整合素的结合,激活下游PI3K-Akt信号通路,促进肿瘤细胞自身基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)的分泌,从而促进肿瘤细胞的侵袭和转移。

本室前期用杂交瘤技术获得了针对HAb18G/CD147分子的鼠源性抗体HAb18,能够抑制HAb18G/CD147调控的相关功能。嵌合抗体hHAb18即为鼠源性抗体HAb18通过人源化改造而来。

本研究一方面基于前期建立的具有在肿瘤细胞特异性复制的新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)反向遗传学技术平台,构建表达hHAb18全长抗体基因的重组病毒rNDV-18HL,探讨抗体靶向治疗和溶瘤病毒治疗双效应系统对肝癌的抗肿瘤疗效,为肝癌治疗探索新手段。另一方面旨在比较rndv-18hl所表达人源化抗体hhab18和鼠源性抗体hab18与hab18g/cd147分子的亲和力,以及hhab18抗体与hab18g/cd147分子的结合特异性,并阐明hhab18封闭其靶点hab18g/cd147,从而抑制肿瘤细胞侵袭和转移的体内外作用和分子机制。

本研究分为四部分:第一部分携带人源化抗体hhab18的重组新城疫病毒的构建及复活为实现肿瘤抗体靶向治疗与溶瘤病毒治疗的联合,我们首先从

cho-ts28细胞中克隆得到hhab18抗体基因的全长序列,利用反向遗传学技术,构建包含hhab18抗体基因和ndvitalien株基因组的重组质粒,命名为

pbr-rndv-18hl,测序验证正确。利用本室前期建立的重组病毒体外复活系统,将pcdna-np、pcdna-p和pcdna-l三个辅助质粒与pbr-rndv-18hl共转染bsr-t7/5细胞,成功复活表达hhab18的重组新城疫病毒,命名为rndv-18hl。

用重组病毒感染bsr-t7/5细胞,westernblot检测结果显示,hhab18抗体能够在靶细胞中表达,特异性结合hab18g/cd147分子;利用elisa方法我们在细胞培养上清中也检测到hhab18抗体的分泌,且于病毒感染细胞第3天达到最大值,为7μg/ml。本部分研究结果表明:1)利用反向遗传学技术构建并复活了表达hhab18抗体的重组新城疫病毒,命名为rndv-18hl;2)该重组病毒rndv-18hl能够高效表达外源基因hhab18。

第二部分人源化抗体hhab18和亲本鼠源性抗体hab18与肿瘤抗原分子

hab18g/cd147的亲和力比较利用重组病毒rndv-18hl感染bsr-t7/5细胞后48h,收集细胞上清,并纯化病毒所表达人源化抗体hhab18。为检测该抗体与其亲本鼠源抗体hab18及cho-hhab18抗体(即cho-ts28细胞表达的hab18抗体)和肿瘤抗原分子hab18g/cd147的亲和力,我们利用表面等离子共振技术(surfaceplasmonresonance,spr),比较了两种抗体与其抗原的亲和力。

spr结果显示,人源化抗体hhab18和其亲本鼠源性抗体hab18及cho-hhab18抗体与hab18g/cd147分子的亲和力一致,解离平衡常数kd分别为4.15×

10-10mol/l、2.73×10-10mol/l和2.66×10-10mol/l。westernblot和细胞免

疫荧光检测显示,hhab18和hab18抗体均可以与人肝癌细胞smmc-7721、hepg2

和huh-7的膜分子hab18g/cd147特异性结合。

通过台盼蓝染色、mtt和brdu检测的方法,筛选了hhab18抗体浓度为0.01、0.05和0.1mg/ml时,不会对肝癌细胞的增殖有显著影响(p>0.05);利用annexinv-fitc/pi和tunel标记的方法,激光扫描共聚焦显微镜和倒置显微镜观察显示,在确定的最高抗体浓度0.1mg/ml时,hhab18抗体亦不会引起细胞的凋亡。本部分研究结果表明:1)hhab18和hab18抗体与其抗原分子hab18g/cd147的亲

和力一致;2)hhab18抗体能够与肿瘤细胞膜分子hab18g/cd147特异性结

合;3)hhab18抗体以0.01、0.05和0.1mg/ml浓度作用于肿瘤细胞时,不会影响

细胞的增殖,亦不会引起细胞的凋亡。

第三部分人源化抗体hhab18抑制肝癌细胞侵袭运动的作用和分子机制

hab18g/cd147分子已被证实与肿瘤的侵袭和转移密切相关。本部分研究通过人

源化抗体hhab18特异性封闭肿瘤细胞膜分子hab18g/cd147,检测细胞侵袭和转

移能力的变化,并进一步阐明抗体作用的分子机制。

人工重组基底膜侵袭实验结果显示,与对照组相比,hhab18抗体可以显著性

抑制smmc-7721细胞的侵袭能力

(p<0.05,0.05mg/mlhhab18vscontrol;p<0.01,0.1mg/mlhhab18vscontrol );在明胶酶谱和real-timepcr的实验中,人急性单核白血病细胞thp-1的mmps

分泌水平能被hhab18抗体抑制,smmc-7721细胞mmps的相对mrna水平也受到显著性抑制(p<0.01,0.05、0.1mg/mlhhab18vscontrol);进一步采用划痕实验证实,hhab18抗体能够在24h和48h分别抑制smmc-7721和smmc-7721-cd147/gfp 肿瘤细胞(稳定过表达cd147/gfp融合基因的smmc-7721细胞)的运动能力,而单