免疫组化实验指导
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由于免疫组化具有特异性强、灵敏度高、定位准确等特点，且能将形态研究 与功能研究有机地结合在一起，这门新技术已被广泛地应用于生物学和医学研究 的许多领域。在病理学研究中，免疫组化技术的作用和意义更为重要。
实验前准备 在实验开始前，要先确保该实验所用到的试剂都准备到位，如：不同浓度梯 度的乙醇，PBS 缓冲液，3%过氧化氢，10%正常山羊血清，0.01M 枸橼酸缓冲液， DAB 显色液，二甲苯和抗体等。 本实验所使用到的仪器和耗材有：芬兰百得提供的移液器，赛默飞的 QSP 盒装吸头、恒温箱，医用微波炉，盖玻片，镊子，洗瓶，湿盒，切片架等。 本视频按照以下步骤展开实验：脱蜡复水后进行抗原修复，接着免疫反应， 化学染色，最后脱水封片并进行结果分析。 脱蜡复水 首先对组织切片进行脱蜡复水处理：切片在室温放置 60min 后，浸泡在二甲 苯中。10min 后，放入另一个装有二甲苯的染缸再泡 10min。脱蜡后，将组织切 片逐级放入无水乙醇、95%、85%，75%，50%的乙醇中，每次处理均为 5min。 水合处理后，将组织切片放入纯水中，孵育 5min，再转移放入 PBS 缓冲液中孵 育 5min。 抗原修复 抗原表位修复之前，需进行内源性过氧化物酶的淬灭处理：滴加 3%过氧 化氢溶液于切片上，湿盒孵育 10min。用 PBS 浸泡清洗 3 次，每次 5min，尽可 能洗去残留的过氧化氢。将切片浸入 0.01M 枸橼酸缓冲液中，微波中大火力加 热至沸腾并保持 8min，取出容器，待缓冲液温度自然降到室温。反复 2 次，用
免疫组织化学
免疫组织化学又称免疫细胞化学，是通过共价键将酶连接在抗体上，制成酶 标抗体，再利用酶对底物的特异催化作用，生成有色的不溶性产物或具有一定电 子密度的颗粒，于普通显微镜或电镜下进行细胞表面及细胞内各种抗原成分的定 位 。目前通常选用免疫酶组化间接染色法进行实验，利用该技术，可进行细胞、 亚细胞水平检测各种抗原物质（如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等）。
感谢 Doctor A 的悉心讲解，这堂课又学到了好多知识。
Select Measure，选择测量对象。选中 Area（面积）和 IOD（累积光密度）， 点击 OK。
回到 Count /Size 窗口，点击 Select Color。在 Segmentation 窗口，选择 Histogram Based，HIS 通道。调节饱和度等参数后，点击 Close。
PBS 再洗 5min。 免疫反应 用滤纸擦去周围多余的 PBS，滴加 PBS 稀释好的 10%正常山羊血清，室温 湿盒封闭 30-60min。孵育结束后，去除封闭液，滴加一抗工作液，4°C 孵育过夜。 第二天，移去一抗后，用 PBS 洗两次，每次 10min.擦去切片周围多余的液 体，滴加二抗工作液，室温孵育 30min。弃去二抗后，PBS 洗两次，每次 10min。 化学染色 去除切片上多余的 PBS,滴加新鲜配制的 DAB 工作液，湿盒孵育，在显微镜 下监测染色程度。染色结束后，PBS 浸泡洗去 DAB 染液，每次 5min，重复 3 次。 去除残留液体，苏木素复染 2-5min，复染结束后，用水洗去多余染液，在 1%盐 酸酒精中分化数秒。再次进行水洗切片。 脱水封片 此过程刚好和复水相反，首先进行 50%乙醇处理 5min，然后依次浸泡在 75%， 85%，95%和无水乙醇中，时间 5min，最后置于二甲苯中进行透明化处理两次， 每次均为 10min。脱水处理后，擦去切片周围的液体，滴上 1 滴中性树胶，盖上 盖玻片，用镊子的钝端轻轻敲击盖玻片，去除气泡以使封片完全。 结果观察 在显微镜下观察实验结果，并于相同的条件下拍取照片进行后续的结果分析。 如图所示，苏木素复染细胞核后，细胞核被染上蓝色，实验组胞浆剪呈现棕黄色， 阳性信号较强；阴性对照组胞浆不被 DAB 染色。 半定量分析 使用 Image Pro Plus 图像分析软件分析累积光密度值。打开 Image-Pro Plus 软件，点击 File，打开实验组和对照组的结果图片。 点击 Measure。Calibration，点击 Intensity 进行光密度校对。在 Intensity Calibration 窗口中，点击 New，选中 Std.Optical Density，点击 Optical，点击 Image， 选择图中最亮的一点。在 Incident Level 中输入与其最接近的整十数，点击 ok。 校正光密度后，点击 Measure，Count/ Size。在 Count Size 窗口，点击 Measure，
选中一张图片，在 Count Size 窗口，点击 View，在 Statistics 窗口可见结果。 获得累积光密度值后，可选用相关软件进行统计学分析。 疑问解答 Doctor A，最近做免疫组化的结果非特异性染色都很深，该怎么解决呢？ Miss Q，非特异性染色是在做免疫组化中经常遇到的问题，最重要一点，我 们可以通过调节一二抗的浓度和孵育时间来控制。至于抗体，建议用单克隆抗体， 可减少非特异性染色。通过延长封闭时间、适当增加封闭液浓度也能降低非特异 性组分与抗体的结合。DAB 的显色要在显微镜下监控，达到理想的染色程度时 立即终止反应，避免染色时间过长或 DAB 浓度过高。此外，很多同学在标本染 色过程中经常干片，这容易增强非特异性着色。 谢谢 Doctor A，那免疫组化染色呈阴性结果，这又是怎么一回事呢？ 遇到这种情况，一般可以从这几点查找原因： 抗体浓度和质量问题以及抗体来源选择错误；抗原修复不全，对于甲醛固定 的组织必须用充分抗原修复来打开抗原表位，以利于与抗体结合；组织切片本身 这种抗原含量低；血清封闭时间过长；DAB 孵育时间过短；细胞通透不全，抗 体未能充分进入胞内参与反应。 开始做免疫组化实验时，建议同学们一定要先做个阳性对照片，排除抗体等 外的方法问题。 在孵育抗体前，为什么要进行抗原修复呢？ 刚才也有提到过，抗原修复是为了使Biblioteka Baidu原抗体更好地结合。石蜡切片由于处 理过程中会造成抗原交联而影响染色结果，通常需要进行抗原修复以增强显色。 多数抗原可以通过抗原修复试剂预处理，改变醛基固定造成的蛋白交联，以暴露 隐藏的抗原位点。抗原修复对于石蜡切片免疫组化、免疫细胞化学的最终显色结 果有着重要的影响。
实验前准备 在实验开始前，要先确保该实验所用到的试剂都准备到位，如：不同浓度梯 度的乙醇，PBS 缓冲液，3%过氧化氢，10%正常山羊血清，0.01M 枸橼酸缓冲液， DAB 显色液，二甲苯和抗体等。 本实验所使用到的仪器和耗材有：芬兰百得提供的移液器，赛默飞的 QSP 盒装吸头、恒温箱，医用微波炉，盖玻片，镊子，洗瓶，湿盒，切片架等。 本视频按照以下步骤展开实验：脱蜡复水后进行抗原修复，接着免疫反应， 化学染色，最后脱水封片并进行结果分析。 脱蜡复水 首先对组织切片进行脱蜡复水处理：切片在室温放置 60min 后，浸泡在二甲 苯中。10min 后，放入另一个装有二甲苯的染缸再泡 10min。脱蜡后，将组织切 片逐级放入无水乙醇、95%、85%，75%，50%的乙醇中，每次处理均为 5min。 水合处理后，将组织切片放入纯水中，孵育 5min，再转移放入 PBS 缓冲液中孵 育 5min。 抗原修复 抗原表位修复之前，需进行内源性过氧化物酶的淬灭处理：滴加 3%过氧 化氢溶液于切片上，湿盒孵育 10min。用 PBS 浸泡清洗 3 次，每次 5min，尽可 能洗去残留的过氧化氢。将切片浸入 0.01M 枸橼酸缓冲液中，微波中大火力加 热至沸腾并保持 8min，取出容器，待缓冲液温度自然降到室温。反复 2 次，用
免疫组织化学
免疫组织化学又称免疫细胞化学，是通过共价键将酶连接在抗体上，制成酶 标抗体，再利用酶对底物的特异催化作用，生成有色的不溶性产物或具有一定电 子密度的颗粒，于普通显微镜或电镜下进行细胞表面及细胞内各种抗原成分的定 位 。目前通常选用免疫酶组化间接染色法进行实验，利用该技术，可进行细胞、 亚细胞水平检测各种抗原物质（如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等）。
感谢 Doctor A 的悉心讲解，这堂课又学到了好多知识。
Select Measure，选择测量对象。选中 Area（面积）和 IOD（累积光密度）， 点击 OK。
回到 Count /Size 窗口，点击 Select Color。在 Segmentation 窗口，选择 Histogram Based，HIS 通道。调节饱和度等参数后，点击 Close。
PBS 再洗 5min。 免疫反应 用滤纸擦去周围多余的 PBS，滴加 PBS 稀释好的 10%正常山羊血清，室温 湿盒封闭 30-60min。孵育结束后，去除封闭液，滴加一抗工作液，4°C 孵育过夜。 第二天，移去一抗后，用 PBS 洗两次，每次 10min.擦去切片周围多余的液 体，滴加二抗工作液，室温孵育 30min。弃去二抗后，PBS 洗两次，每次 10min。 化学染色 去除切片上多余的 PBS,滴加新鲜配制的 DAB 工作液，湿盒孵育，在显微镜 下监测染色程度。染色结束后，PBS 浸泡洗去 DAB 染液，每次 5min，重复 3 次。 去除残留液体，苏木素复染 2-5min，复染结束后，用水洗去多余染液，在 1%盐 酸酒精中分化数秒。再次进行水洗切片。 脱水封片 此过程刚好和复水相反，首先进行 50%乙醇处理 5min，然后依次浸泡在 75%， 85%，95%和无水乙醇中，时间 5min，最后置于二甲苯中进行透明化处理两次， 每次均为 10min。脱水处理后，擦去切片周围的液体，滴上 1 滴中性树胶，盖上 盖玻片，用镊子的钝端轻轻敲击盖玻片，去除气泡以使封片完全。 结果观察 在显微镜下观察实验结果，并于相同的条件下拍取照片进行后续的结果分析。 如图所示，苏木素复染细胞核后，细胞核被染上蓝色，实验组胞浆剪呈现棕黄色， 阳性信号较强；阴性对照组胞浆不被 DAB 染色。 半定量分析 使用 Image Pro Plus 图像分析软件分析累积光密度值。打开 Image-Pro Plus 软件，点击 File，打开实验组和对照组的结果图片。 点击 Measure。Calibration，点击 Intensity 进行光密度校对。在 Intensity Calibration 窗口中，点击 New，选中 Std.Optical Density，点击 Optical，点击 Image， 选择图中最亮的一点。在 Incident Level 中输入与其最接近的整十数，点击 ok。 校正光密度后，点击 Measure，Count/ Size。在 Count Size 窗口，点击 Measure，
选中一张图片，在 Count Size 窗口，点击 View，在 Statistics 窗口可见结果。 获得累积光密度值后，可选用相关软件进行统计学分析。 疑问解答 Doctor A，最近做免疫组化的结果非特异性染色都很深，该怎么解决呢？ Miss Q，非特异性染色是在做免疫组化中经常遇到的问题，最重要一点，我 们可以通过调节一二抗的浓度和孵育时间来控制。至于抗体，建议用单克隆抗体， 可减少非特异性染色。通过延长封闭时间、适当增加封闭液浓度也能降低非特异 性组分与抗体的结合。DAB 的显色要在显微镜下监控，达到理想的染色程度时 立即终止反应，避免染色时间过长或 DAB 浓度过高。此外，很多同学在标本染 色过程中经常干片，这容易增强非特异性着色。 谢谢 Doctor A，那免疫组化染色呈阴性结果，这又是怎么一回事呢？ 遇到这种情况，一般可以从这几点查找原因： 抗体浓度和质量问题以及抗体来源选择错误；抗原修复不全，对于甲醛固定 的组织必须用充分抗原修复来打开抗原表位，以利于与抗体结合；组织切片本身 这种抗原含量低；血清封闭时间过长；DAB 孵育时间过短；细胞通透不全，抗 体未能充分进入胞内参与反应。 开始做免疫组化实验时，建议同学们一定要先做个阳性对照片，排除抗体等 外的方法问题。 在孵育抗体前，为什么要进行抗原修复呢？ 刚才也有提到过，抗原修复是为了使Biblioteka Baidu原抗体更好地结合。石蜡切片由于处 理过程中会造成抗原交联而影响染色结果，通常需要进行抗原修复以增强显色。 多数抗原可以通过抗原修复试剂预处理，改变醛基固定造成的蛋白交联，以暴露 隐藏的抗原位点。抗原修复对于石蜡切片免疫组化、免疫细胞化学的最终显色结 果有着重要的影响。