动物源性成分

饲料中动物源性成分检测技术研究进展
摘要:
饲料安全与动物生产、环境污染和人类健康密切相关。

动物废弃物进入饲料行业曾经弥补了蛋白质饲料不足的缺口,但却带来了新的问题。

饲料中动物源性成分的定性或定量检测技术已成为国内外的研究热点，适用于各种样品、基于各种原理的方法和技术被开发出来。

本文以组织学特征为基础的显微镜分析方法、以蛋白质和DNA为基础的免疫学和PCR分析方法、高效液相色谱法和近红外光谱法在动物源性饲料组分中的研究应用进展等方面做了综述,并对其发展趋势进行讨论。

饲料安全已与动物生产、环境污染和人类健康
密切相关。

动物源性副产品因富含蛋白质、钙、磷等
营养成分而被应用于畜禽饲料中, 但现有的证据表
明, 在动物饲料中添加未经加热处理牛源性饲料或
感染过痒病因子的牛( 羊) 肉/ 肉骨粉( MBM) 后能够
引发和传播疯牛病( BSE)。

我国于1999、2001和2004年先后
下发了关于对动物源性饲料生产和管理的相关条例, 主要对反刍动物源性饲料组分、MBM、肉粉、骨
粉、血粉、动物内脏干粉和动物废弃物等使用做了严
格的规定。

目前关于饲料中动物源性成分检测主要
以样品的组织学特性和品种特异性的生物标记物
( 如蛋白质、DNA和其他生物大分子等) 为对象, 其
中PCR技术发展迅速, 已逐步被世界各国采用。

但
由于动物源性饲料组成上的复杂性, 单一的PCR技
术仍不能克服耗时、效率低和假阳性等问题。

因此,
研究并建立一种( 套) 快速、灵敏、可靠的动物源性饲
料检测技术, 对于提高饲料质量、防止饲料掺假、控
制进口饲料安全和制订相关饲料法规等均具有重要
意义。

本文中动物源性成分
是指动物组织以及蛋和奶，包括肉类及其制品(含动物
脏器)、水生动物产品等，检测技术是指上述成分中蛋
白质和DNA等具有种间特异性物质的物种鉴定和含量分
析技术。

该技术已成为保护消费者权益和安全的重要技
术手段。

动物源性成分检测技术通常建立在对样品蛋白质、
DNA、脂肪酸等分子结构、序列或组成特异性分析的
基础上。

涉及的技术手段包括酶联免疫、聚合酶链式
反应、电泳、色谱、生物传感分析等。

本文根据分
析对象对动物源性成分检测技术进行分类论述，讨论各
方法的优势与局限性及其发展趋势。

1. 1以组织学为基础的检测技术饲料显微镜分
析技术主要以组织学特性为基础, 借助立体显微镜
观察样品粗糙片段的形态学构造, 同时利用光学显
微镜观察细小颗粒的组织学构造, 从而区分不同组
织。

显微镜技术以前主要用于产品品质认证( 纯
度) , 能够鉴别产品混合物中植物( 如面粉、香料和饲
料等产品) 或动物源性组分( 如颖苞、糊粉细胞、淀
粉、血块、骨碎片、羽毛碎片、毛发、肌肉纤维等) 。

BSE出现以后, 一些国家和研究机构利用饲料显微
镜技术结合沉淀分析能够检测混合饲料中动物源性
饲料组分, 检测精度可达0. 02%~ 0. 1%。

该方法
主要过程如下: 样品粉碎到一定的粒度后, 利用组合
显微镜( 放大倍数可达400) 估计骨碎片与非骨碎
片( 肌肉碎片) 的比例。

大部分的骨粉碎片通过沉淀
分析, 粉碎的样品悬浮在四氯乙烯中, 根据溶液的密
度区分颗粒( 闻伟刚等, 2004)（闻伟刚, 赵秀玲, 等. 进口饲料中牛、羊源成分的PCR同时检测
方法. 农业生物技术学报, 2004, 12(2): 167~169.）。

沉淀物中, 骨刺部分
利用分级筛收集后称重, 最后计算动物源性组分的
总重量。

目前欧盟官方已将饲料显微镜分析技术作
为检测动物源性饲料成分的方法, 并且制定了严格
的操作规程
, 可以区分反刍动物饲料中肉及肉骨粉、喷雾
血粉、家禽废弃物和鱼粉( Ronaldo等, 2004)（Ronaldo L, Sanches, Juarez F, et al. Inhouse validation of a
method for detection of animal meals in ruminant feeds by microscopy. Food Control, 2004, 1~8.）。

低倍镜下沉淀物的一般结构和颜色是鉴别肉骨
粉来源的第一信号。

哺乳动物的骨碎片呈白色或淡黄
色, 禽类骨碎片的颜色发暗, 这些骨碎片都是不透明
的, 而鱼类骨碎片要比哺乳动物和禽类的透明。

高倍
镜下可以看到哺乳动物的骨碎片呈椭圆形近似圆形,
根据骨碎片的品质与透明度的不同, 用导管有时也能
看到, 有时环行骨板的方向也能看到。

与哺乳动物相
比, 禽类的骨碎片更加尖锐, 腺窝更圆, 用导管看不
到。

鱼类的骨呈扁平状, 其陷窝为拉长的梭形, 连成网
状, 而且根据鱼的种类不同也呈现一定的多样性。

这
些特征是最一般的特征, 在实际的检验中变化较大。

肉骨粉中会出现平滑肌或骨骼肌, 不管是哺乳动物、
禽类还是鱼类, 肌肉组织一般都被破坏成短的纤维,
其宽度依据处理的方法和动物的营养状况而不同。

动
物肌纤维一般没有各自的明显特征, 肌纤维的出现与
否是判定饲料中是否出现动物源性成分的重要依据。

饲料中毛发、羽毛、蛋壳、鱼刺、鱼鳃的检出可以进一
步确定饲料中是否出现动物源性成分。

欧盟已尝试通
过饲料显微镜学方法来进行定量测定。

饲料显微镜学方法具有样品制备量少、设备便
宜、简单易行的优点, 但该方法费时、费力, 对技术人
员的要求高, 结果与试验员的经验相关性很大。

不同
样品中所含有动物源性成分的来源多样, 低倍镜下颜
色的重叠比较大, 高倍镜下骨陷窝的重叠性比较大。

这要求显微镜分析师达到较高的专业水平。

因此, 迫切需要建立一套新的、合适的鉴定标准。

1 基于蛋白特异性的检测技术
1.1 蛋白分子立体结构特异性
基于蛋白的鉴别技术大多以蛋白分子立体结构特异
性为基础，应用抗原-抗体特异性结合的原理建立，通
过检测标记信号的有无或强弱来判断目标成分的有无或
多少。

该类技术具有操作简单、特异性好、不需要大
型仪器设备的优点，容易操作，可以进行大规模检测，
其核心技术是特异性抗原和抗体的筛选与制备。

骨骼肌
中的肌钙蛋白I(troponin I，tnI)具有高特异性和热稳定
性，是理想的抗原之一，Liu等
[1]（LIU Lihua, CHEN Furchi, DORSEY J L, et al. Sensitive monoclonal
antibody-based sandwich ELISA for the detection of porcine skeletal
muscle in meat and feed products[J]. Food Science, 2006, 71(1): M1-M6.）
以猪tnI为抗原制备了
两种单克隆抗体Mab 8F10和Mab 5H9，Mab 8F10能够
和所有的哺乳动物tnI而Mab 8F10只和猪tnI特异性反
应，用该组抗体开发的抗体夹心法能够检出鸡肉和牛肉
中掺杂的猪肉成分(检出限分别为0.05%和0.1%)、检出
大豆蛋白基料饲料中和肉骨粉中的肉成分(检出限分别为
0.05%和1%)，而且样品经过132℃、2h的高温处理后
不影响检测效果。

基于蛋白分子立体结构特异性的检测方法也有局限
性，蛋白抗原决定簇的立体结构会受到多种环境因素影
响而改变，当检测加工过的成分时其特异性和准确性会
大打折扣，此时需要有其他手段辅助检测[6]（van RAAMSDONK L W D, von HOLST C, BAETEN V, et al. New developments in the detection and identification of processed animal
proteins in feeds[J]. Animal Feed Science and Technology, 2007, 133(1): 63-83.）
1.2 蛋白或肽谱特异性
基于蛋白的鉴别技术不仅仅局限于ELISA法为代表
的免疫学方法，应用液相色谱(LC)、高效液相色谱
(HPLC)、毛细管电泳(EC)或二维电泳分析样品蛋白和短
肽组成特点也能实现对样品中动物源性成分种类的识
别。

例如，Ashoor等
[7]（ASHOOR S H, MONTE W C, STILES P G. Liquid chromatographic identification of meats[J]. Journal Association of Official Analytical
Chemists, 1988, 71(2): 397-403.）
开发了能够定性检测多种肉类
成分和定量检测鸡肉- 火鸡肉混合物成分的LC技术。

1.3 免疫学方法
肉骨粉一般都要经过高温、高压处理, 在这
个过程中许多蛋白质都发生了变性, 失去了抗原性和
水溶性, 这就给检测带来了困难。

为了使用免疫学方
法鉴定动物成分的种类, 必须选择合适的动物成分作
为抗原, 其中肌肉组织的蛋白质具有较高的价值。

目
前已发现几种热稳定的蛋白质可以作为检测的目的
蛋白, 其中包括肌钙蛋白。

免疫测定速度快、操作简单, 不需要对工作人员进行特殊的培训; 并且特异性高, 能特异性地检测动物肌
肉, 而不与其它动物成分发生反应。

ELISA 方法由于具
有特异性和灵敏度高的优点, 被广泛应用于食品和饲
料中的肉类品种鉴别; 并且ELISA 不需要大型的科学
设备, 容易操作, 可以进行大规模的检测。

2 基于DNA序列特异性的鉴别技术
因
此，利用DNA分子序列特异性开发定性、定量检测食
品、饲料中动物源性成分的方法和技术定已成为该领域
的研究焦点和主流，也是多数国家检测方法标准中指定
的检测方法。

2.1 DNA杂交技术
Ebbehoj
[16] EBBEHOJ K F, THOMSEN P D. Species differentiation of heated meat products by DNA hybridization[J]. Meat Science, 1991, 30(3): 221-234.
和Thomsen
等应用
32
P-标记探针建立了检测生、熟牛肉中猪肉成分的DNA杂
交技术，同年开发了能够区分近亲物种成分(猴和人、
牛和绵羊或山羊)的条形-斑点杂交技术，检出限根据检
测对象亲缘关系的远近分布在0.01%～10%区间。

2.2 基于PCR的动物源性成分检测技术
2.2.1 PCR-电泳
用物种间高异性引物对样品中的DNA进行PCR扩
增后琼脂糖电泳分离，通过观察是否有特异性条带出现
便可判定样品中是否含有相应的物种成分。

该方法灵
敏、便捷、准确，而且成本低廉，大量的具体方法和技术已被建立和开发，实现了对常见动物源性成分
(单一或混合物)的快速检测。

2.2.2 PCR-RFLP
限制性片段长度多态性(restriction fragment length
polymorphism，RFLP)是应用物种间同源基因上特定限
制性内切酶位点特异性来实现对样品中动物源性成分来
源的识别。

此方法简单高效，无需设计物种特异性引
物，使用适合的通用引物即可，将扩增产物进行限制
内切酶反应，通过分析电泳图谱特征来判定物种来源，
但该方法适合鉴别单一成分样品，多物种混合物样品由
于电泳图谱较为复杂，分析难度较高，结果可靠性较
低。

高琳等
[31] 高琳, 徐幸莲, 周光宏. 应用PCR-RFLP法鉴别肉制品中的猪和牛源性成分[J]. 南京农业大学学报, 2008, 31(2): 135-138.
建立了以动物线粒体DNA中Cytb区段保
守序列为靶序列的PCR-RFLP肉种检测方法，能从猪、
牛、羊、鸡、鸭、兔6 种生肉及高压猪肉、猪肉火
腿肠等7种热加工肉制品中鉴别出猪源性和牛源性成
分。

2.2.3 PCR测序
该方法是将特异性PCR反应得到的扩增产物分离纯
化后进行测序，并到基因组数据库(如http://www.ncbi.
/)进行序列比对来确定待检样品所属的物种类
型，例如，Iijima等
[37] IIJIMA K, SUZUKI K, OZAKI K, et al. DNA analysis for identification
of food-associated foreign substances[J]. Journal of Food Quality, 2006,
29(5): 531-542.
建立了基于18S rRNA基因测
序的食品中动植物源性成分来源分析方法，Girish等
[38] GIRISH P S, ANJANEYULU A S R, VISWAS K N, et al. Sequence
analysis of mitochondrial 12S rRNA gene can identify meat species[J].
Meat Science, 2004, 66(3): 551-556.
建立了基于线粒体12S rRNA基因测序的鉴定方法。

2.2.4 随机引物的扩增
随机引物的扩增法(random amplified polymorphic
DNA-PCR，RAPD)使用非特异性引物，能与模板上多
个位点结合而不是与某一限制性位点特异性结合，经过
PCR扩增反应后可产生多个PCR产物，最有效结合的引
物在扩增过程中相互竞争而产生指纹，经过凝胶电泳可
产生物种特异性的图谱，以此来鉴定样品中的动物源性
成。

RAPD的优点在
于无需知道分析对象的全基因组序列，但其局限性也很
突出，如只适合分析单一成分样品，而对分析多成分
混合物会有一定困难。

2.2.5 实时荧光PCR
实时荧光PCR技术(real-time fluorescent polymerase
chain reaction，RT-PCR)是一种在PCR反应体系中加入
荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个反应进程的
PCR技术，并可通过标准曲线对未知模板进行定量分
析。

该技术的出现使物种鉴别的灵敏性和准确性都有所
提高，而且该技术无需进行电泳过程，避免了溴化乙
锭等有毒染料的使用，降低了实验对人体的危险系数。

其更大优势在于可通过设立外标物制作标准曲线实现对
样品中特定动物源性成分(DNA)含量的绝对定量，通过
分别加入特异性引物和通用引物实现特定成分的相对定
量，从而实现对肉类食品中掺假成分含量的测定和掺假
行为严重程度的判定。

其缺点是检测成本较高，包括
仪器和实验耗材。

2.3 环介导等温扩增技术
环介导等温扩增技术
[56]
(loop-mediated isothermal
amplification，LAMP)是一种崭新的DNA扩增方法，与
普通PCR相比其最大的特点是利用具有链置换活性的
DNA聚合酶(如Bacillus stearothermophilus DNA
polymerase) 在65℃对样品中DNA进行等温扩增，而无
需进行温度变化循环，具有简单、快速、特异性强的
特点。

Ahmed等AHMED M U, HASAN Q, HOSSAIN M M, et al. Meat species iden-tification based on the loop mediated isothermal amplification and elec-trochemical DNA sensor[J]. Food Control, 2010, 21(5): 599-605
[57]
开发出了基于环介导基因恒温扩增
(LAMP)和电化学芯片技术联用的动物源性成分生物传感
鉴定技术，分别能检出混合样品中20.33ng/μL的
猪肉成分，20.33ng/μL的鸡肉成分，以及78.68pg/μL
的牛肉成分。

该技术为肉种鉴别技术小型化、便携化
合自动化开辟了新的途径。

LAMP法也有局限性，由于
是链置换合成，不适合进行长链DNA的扩增，在产物回
收鉴定、克隆、单链分离方面的表现也不如传统PCR。

2.4 DNA指纹分析法
DNA指纹分析法也被用于动物成分分析。

动物基因组中
存在大量的分散重复序列(
Interspersed Repeat Sequence
,
IRS), 并且是种间高度特异的。

Buntijer 通过用哺乳动物中广
泛存在的分散重复序列的特异引物进行PCR扩增, 建立了从
牛到鸵鸟的30多种哺乳动物的DNA指纹
[ 8] Buntijer J. B. ,
et al.J.Ind. Microbiol. Biotechnol. 1998,21: 121～127
, 这种分析产生
20～60个条带的图谱。

实验结果表明: 用这种方法对120℃加
热处理20min的动物肉类DNA样品进行检测所得到的指纹
结果, 与对同种动物完整DNA样品进行检测得到的指纹结果
相一致。

4近红外光谱方法
近红外光谱分析技术( Ne a r infra re d re fle c ta nc e
spe c trosc opy, NIRS) 是饲料界最广泛应用的技术之一,
可以用于饲料中动物源性成分的检测。

NIRS 的原理
是饲料中的分子物质可以吸收不同波长的光线。

其优
点是检测快速、不用有害的试剂、所需样品量少、非破坏
性检测、经济重复性好以及具有可以开发为商业化仪
器的潜力; 主要缺点是这项技术是间接的检测, 因此
需要大量样品的参考值来形成一个校正和参考模型。

现有饲料中动物源性成分检测方法有显微镜检
测、近红外漫反射光谱法等
DardenneP. Startfeed-strategies andmethods to detect and quantify mammalian tissues in feeding stuffs [M]. Namur:
EuropeanCommunities, 2005: 1~ 14.。

由于动物源性成
分组成复杂, 单一的检测方法虽然各具特点但也存
在不同程度的局限性。

鉴于此, 在不断完善各类单
一检测技术的同时, 开展不同检测仪器结合技术研
究, 以突破单一检测技术的局限, 一直是国内外学者
研究的热点和重要方向
[ 5] 卜登攀,王加启, 贺云霞,等. 动物源性成分检测技术研究进展[ J]. 中国畜牧兽医, 2008, 35( 2): 55~60.。

显微近红外( near-infraredmicroscopy, 简称NIRM)光谱分析技术是现
代分析仪器发展的重要突破, 它是将传统傅里叶变
换近红外光谱技术与光学显微镜检测技术有机结合
的产物, 基于变尺度的点模式获取不同样品单个颗
粒微区的近红外光谱进行分析, 从而检测精度得以
大幅度提高。

应用显微近红外光谱分析技术检测饲
料中的动物源性成分, 在简化制样方法的同时避免
了单纯光学显微镜检测需人眼直接观测判断, 相比
近红外漫反射光谱法, 基于微区分析可获取饲料中单一组分的光谱, 使不同组分吸收峰差异更加显著,
有利于定性检测不同种属饲料成分, 同时有利于检
测精度的提高。

因此在选择动物源性成分的检测方法
时, 应考虑实验室的条件和检测需要, 选择合适
的方法。

总之，动物源性成分鉴定技术为保证食品安全、
保障消费者权益和保护野生动物提供了可靠的技术手段，该领域也将继续成为研究热点受到持续关注。